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摘要 鼠曲草是一年生草本植物，在我国均有分布，民间清明前后采食。本文检测了鼠曲草茎叶及花中总黄酮含量，对比了提取方法。总黄酮用醋酸铅沉淀、柱层析纯化。结果表明，鼠曲草茎叶及花中的黄酮含量分别为7.37、38.14 mg/g；最佳提取条件为乙醇浓度40%、料液比1∶40，温度70 ℃，时间2 h；黄酮（A）的含量最多，还原能力和清除DPPH自由基能力高于芦丁，有明显的抗猪油氧化能力，但抗氧化持续性不及BHT。黄酮（B）的抗氧化活性与芦丁相当。
关键词 鼠曲草；花；提取；总黄酮；抗氧化活性；过氧化值
中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）24-0237-04
Study on Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Flower of Gnaphalium affine D. Don
ZHANG De-sheng KANG Zhao-jin YOU Shuang-mei XIA Wan-qiu FENG Ya-juan LIU Pin-hua
（College of Chemistry and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011）
Abstract Gnaphalium affine D.Don is an annual herb，which distributes widely in China and is often fed in Tomb-Sweeping Day.This paper tested the content of total flavonoids in stem，leaves and flowers of Gnaphalium affine D.Don，and compared the extraction methods.Total flavonoids were precipitated with lead acetate and purified by column chromatography.The results showed that the content of flavonoids in the stem and leaves，flowers of Gnaphalium affine D.Don were 7.37 mg/g and 38.14 mg/g，respectively.The optimum extraction conditions were as following，ethanol concentration was 40%，solid-liquid ratio was 1∶40，temperature was 70 ℃，time was 2 h.The content of flavonoids（A）was highest，reducing ability and DPPH free radical scavenging ability were higher than that of rutin，which had obvious anti-lard oxidation ability，but the persistence of antioxidation was not as good as BHT. Flavonoids（B）had similar antioxidant activity to rutin.
Key words Gnaphalium affine D.Don；flower；extraction；total flavonoid；antioxidant activity；peroxidation value
鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don），菊科，簇生，一年生草本，生于海拔1 600～2 700 m的田埂、荒地、路旁，尤以稻田最常見。清明前民间有采集嫩尖食用的习惯。茎叶入药，化痰止咳、清热利湿，活血降压，是治气喘和支气管炎以及非传染性溃疡、创伤的常见用药，全草含胡萝卜素、抗坏血酸、硫胺素、核黄素、花中木犀草素4′-β-D-葡萄糖苷、鼠曲草素、斛皮素-5-甲醚，有镇咳、抑菌的作用[1-2]。现有研究表明，鼠曲草属植物具有多种生物活性，除了医药价值，在营养保健、生物农药、化妆品等方面也有一定的应用价值。鼠曲草资源丰富，药食两用，是一种极具开发利用潜质的生物资源[3]。因此，本文研究了鼠曲草花中黄酮的提取方法及抗氧化活性，以期为深加工和综合开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鼠曲草及鼠曲草花（云南曲靖采摘）；猪油（购自曲靖一超市新鲜肥猪膘，实验室火炼法提取）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）（食品级，郑州超凡有限公司）；芦丁（化学对照品，中国药品生物制品检定所）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（日本原装进口，AR）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（广州市化学试剂玻璃仪器批发部，AR）；水杨酸、焦性没食子酸等试剂均为分析纯。
1.2 仪器
分析天平（AL204-IC，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；紫外分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）；离心机（4 000 r/min，常州国华电器有限公司）；旋转蒸发仪（N-1100，上海爱朗仪器有限公司）；恒温培养箱（29SN-DP-501，天津试验仪器厂）。
1.3 研究方法
1.3.1 原料的预处理。鼠曲草茎叶及花除弃杂质，洗净，65 ℃烘干粉碎后80 ℃烘至恒重，放入干燥器中备用。 1.3.2 标准曲线的绘制。精密称取经120 ℃减压真空干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，获得芦丁储备液。取芦丁储备液10 mL置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，获得芦丁使用液。取芦丁使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL（质量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg），分别置于50 mL容量瓶中。加95%乙醇至总体积为15 mL，依次加入100 g/L硝酸铝溶液1 mL、9.8 g/L醋酸钾溶液1 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，静置1 h。以未加芦丁使用液为空白对照，用1 cm比色皿于415 nm处测定吸光度。以芦丁质量为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程，y=0.644 4x-0.001 7，R2=0.999 9。
1.3.3 茎叶及花中总黄酮含量的检测。分别准确称取恒重的茎叶及花1 g于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇30 mL，70 ℃水浴回流提取2 h，取出冷却至室温，用60%乙醇定容至刻度，摇均，滤纸过滤，弃前1/3滤液，取1 mL滤液于50 mL容量瓶中，按1.3.2中方法显色，在415 nm处测定吸光度，由回归方程计算总黄酮含量。
1.3.4 鼠曲草花中黄酮提取条件的考察。具体包括以下内容。
（1）乙醇浓度对黄酮提取的影响。准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇200 mL，70 ℃恒温水浴提取2 h[4]，取出冷却至室温，用对应浓度乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳乙醇浓度。
（2）时间对黄酮提取的影响。准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比加入40%乙醇 200 mL，于70 ℃恒温水浴提取30、60、90、120、150 min，取出冷却至室温，用40%乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳时间。
（3）温度对黄酮提取的影响。准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比加入40%乙醇200 mL，分别于55、60、65、70、75、80 ℃恒温水浴提取2 h，取出冷却至室温，用40%乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳温度。
（4）料液比对黄酮提取的影响。按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（m/v）的料液比准确称取鼠曲草花于250 mL容量瓶中加入40%乙醇，于70 ℃水浴提取2 h，取出冷却至室温，用40%乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳料液比。
（5）碱液对黄酮提取的影响。参考鼠曲草花中黄酮含量及酚羟基数量确定考察方案：准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶40的料液比分别加入15%Na2CO3、5%NaOH、饱和Ca（OH）2 200 mL于70 ℃恒温水浴提取2 h，取出冷却至室温，用对应碱液定容至刻度。滤纸过滤，弃前1/3滤液，滤液用稀盐酸调节pH值为4～5[5]。按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳碱液。
（6）纤维素酶对黄酮提取的影响。称取0.200 0 g纤维素酶于250 mL锥形瓶中，精确称取鼠曲草花5 g，加入95 mL 水。调节pH≈5，45 ℃水浴中磁力搅拌[6]，水解24 h，取出加热沸腾15 min使酶灭活，在80 ℃烘箱中烘干，再转移到250 mL容量瓶中加入40%乙醇200 mL，70 ℃恒温水浴提取2 h，取出冷却至室温后用40%乙醇定容到250 mL。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量，计算提取率。
（7）菠萝蛋白酶对黄酮提取的影响。称取5.600 0 g菠萝蛋白酶于250 mL燒杯中，精确称取鼠曲草花5 g，加水95 mL。调节pH≈7，45 ℃水浴中磁力搅拌[7-10]，水解5 h，后续步骤同纤维素酶的方法。
（8）木瓜蛋白酶对黄酮提取的影响。称取1.000 0 g木瓜蛋白酶于250 mL烧杯中，精确称取鼠曲草花5 g，加入95 mL水[8-10]。调节pH≈6，60 ℃水浴中磁力搅拌，水解3 h，后续步骤同纤维素酶的方法。
（9）淀粉酶对黄酮提取的影响。称取0.600 0 g淀粉酶于250 mL烧杯中，精确称取鼠曲草花5 g，加入95 mL水[11]。调节pH≈6，45 ℃水浴中磁力搅拌，水解2 h，后续步骤同纤维素酶的方法。
1.3.5 鼠曲草花中总黄酮的分离。浸提液中滴加10%醋酸铅至无沉淀，离心分离得沉淀物（说明含有邻二酚羟基或兼有3-羟基，4-酮基或5-羟基，4-酮基的化合物），清液滴加10%碱式醋酸铅至无沉淀，离心分离得沉淀物（说明含有一般酚类化合物）[12]。在沉淀物中分别加入一定量乙醇使其分散，并用85%硫酸调节pH值为5～6，离心分离。清液减压浓缩制样。用硅胶柱分离，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脱除尽叶绿素，用75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩制样。用聚酰胺柱分离，蒸馏水洗脱至无色，收集75%乙醇洗脱液，旋干后用适量40%乙醇溶解得醋酸铅沉淀黄酮（A）和碱性醋酸铅沉淀黄酮（B），供抗氧化试验及抗猪油氧化使用。
1.3.6 还原能力的测定。将黄酮（A）、黄酮（B）、芦丁配制成0.302 mg/mL供测试使用。取芦丁溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分别于15 mL离心管中，补充水至0.5 mL（试样的质量浓度为0、60.4、120.8、181.2、241.6、302.0 μg/mL），不加铁氰化钾溶液的为对应空白样。分别加入pH=6.6，0.2 mol/L磷酸缓冲溶液2.50 mL和1%的铁氰化钾溶液2.50 mL，混合均匀，于50 ℃水浴中反应20 min后快速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混合均匀。取清液2.50 mL于试管中，加入2.50 mL蒸馏水，再加入0.1%三氯化铁溶液0.50 mL，混合均匀，于室温下静置10 min，700 nm测定吸光度。黄酮（A）、黄酮（B）方法同芦丁。 1.3.7 清除DPPH试验。将黄酮（A）、黄酮（B）、芦丁配制成60.4 μg/mL供测试使用。取芦丁溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于15 mL离心管中，补充乙醇至总体积为2 mL，然后加入0.22 mmol/L的DPPH溶液2.00 mL（试样的质量浓度为1.51、3.02、4.53、6.04、7.55、9.06 μg/mL），于室温暗处放置反应30 min，517 nm测得的吸光度为A1，以2.00 mL无水乙醇代替样液测得的吸光度为A2，以2.00 mL乙醇代替DPPH溶液测得的吸光值为A3（空白）。黄酮（A）、黄酮（B）方法同芦丁。试样对DPPH的清除率：
清除率（%）=×100
1.3.8 黄酮（A）的抗油脂氧化的试验。具体有以下方面内容。
（1）标准曲线的绘制。参照GB/T 5009.37适当改动，用二氯甲烷代替三氯甲烷绘制标准曲线，分别精密量取10.0 μg/mL铁标准使用液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（相当于0，2.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0 μg）于干燥的10 mL比色管中，用二氯甲烷 甲醇（7 3）混合溶剂稀释至刻度，混匀。加1滴（约0.05 mL）硫氰酸钾溶液（300 g/L），摇匀。室温下准确放置5 min后，1 cm比色皿，以二氯甲烷 甲醇（7 3）混合溶剂为参比，500 nm测吸光度值，各点吸光度值减去零管吸光度值后绘制标准曲线，以铁标准质量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：y=0.037 4x-0.011 6，R2=0.999 3。
（2）烘箱诱导法抗猪油氧化试验。取猪油20 g于培养皿中。试验组、对照组分别加入乙酸乙酯配制的浓度为1.51 mg/mL黄酮（A）及BHT溶液2.7 mL（折合为4.0 mg），空白组加入乙酸乙酯2.7 mL。搅拌均匀，水浴加热除去乙酸乙酯。然后将各组培养皿置于（65±1）℃的烘箱诱导氧化，每隔48 h取样，参照GB/T 5009.37方法测定其过氧化值[13-15]。同时比较了POV抑制率的大小[16-17]，计算公式如下：
POV抑制率（%）=■×100
2 结果与分析
试验得知鼠曲草花中黄酮含量为3.814%；茎叶中黄酮含量为0.737%。花中的黃酮含量约为茎叶的5倍，为此主要针对花中的黄酮进行研究。醋酸铅沉淀分离得总黄酮约为85%，碱式醋酸铅沉淀得总黄酮约为15%，说明鼠曲草花中黄酮主要含有邻二酚羟基兼有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物，也含有部分一般酚类黄酮化合物。
2.1 乙醇浓度对提取率的影响
由图1可知，40%乙醇提取效果最佳，提取率达到3.81%，30%、50%乙醇提取效果基本相当。黄酮苷是由黄酮苷元与糖基构成，黄酮苷元极性较小，糖基极性较大。根据“相似相溶”原则，黄酮苷易溶于中等或中等偏上极性的溶剂中。因为水分子之间具有较高的结合能，能很好地溶解与水分子具有强烈相互作用的物质，所以黄酮苷元在水中的溶解度较低。对于乙醇水溶液，由于引入了羟基，乙醇分子之间不仅彼此以氢键相结合，而且与水分子也形成氢键，降低了水的极性，故黄酮苷元的溶解度增加。乙醇浓度超过40%时极性相对偏低，黄酮苷的溶解度也降低。另外乙醇浓度越高，细胞蛋白质越易变性凝固，不利于乙醇向细胞内渗透，影响了提取率[18]。从乙醇浓度对提取率的影响表明鼠曲草花中黄酮以含糖基构成为主。
2.2 时间对提取率的影响
提取开始时易溶于溶剂的成分以转移到溶剂为主，随着时间的延长，溶剂中溶解成分浓度增加，从溶剂中转移到被提取物的量逐渐增加，最后形成溶出与吸附平衡。由图2可知，120 min以后提取率趋于稳定，此时黄酮的提取率为3.81%。
2.3 温度对提取率的影响
温度越高越有利于黄酮的提取，但同时杂质溶出量也相应增大，同时对温度敏感的活性成分易被破坏。由图3可知，随温度的升高，总黄酮提取率呈增加趋势，温度从55 ℃到75 ℃提取率增加了约0.5%。70 ℃与75 ℃基本相当，故70～75 ℃是较合理的选择，此时黄酮的提取率为3.7%～3.8%。
2.4 料液比对提取效果的影响
由于黄酮的提取率随料液比的减小而升高，但溶剂用量大提取的成本也增加。由图4可知，从单次的料液比效果看，1∶30较1∶20有明显提高，1∶40时总黄酮的提取率达到最大值，为3.81%。故1∶40为最佳料液比。
2.5 碱液对黄酮提取率的影响
黄酮类化合物分子中多含有酚羟基，显酸性，故可用碱性溶液提取。黄酮中酚羟基的酸性越弱，要求的碱性越强，才能生成盐，提高在水中的溶解度。碱液提取时，所用碱的浓度不宜过高，以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核[19]。由图5可知，饱和氢氧化钙浓度约为0.16%，提取效果高于其他2种碱液。氢氧化钠、碳酸钠提取率低可能是因为碱性过强破坏黄酮结构或因碱性弱、浓度过大所导致。碱液提取效果明显低于40%乙醇的情况说明羟基在乙醇中的溶解度影响大于生成盐在水中溶解度的影响。
2.6 酶水解对黄酮提取率的影响
由图6可知，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解提取总黄酮的效果明显高于淀粉酶和纤维素酶水解的提取率。说明蛋白质的存在会影响黄酮扩散进入提取液。原因可能是，在乙醇的作用下蛋白质发生变性包裹了黄酮，阻滞了乙醇的扩散，还可能是因蛋白质中氨基与酚羟基的结合影响了提取效果。比较水解条件，采用木瓜蛋白酶预处理后提取鼠曲草花中黄酮更加合理。
2.7 还原能力的测定
通过测定还原能力的大小可以用来证实抗氧化活性的大小[20]。由表1可知，鼠曲草花中黄酮（A）的还原能力大于对照样芦丁，且随浓度的增加还原能力明显增强。黄酮（B）与芦丁基本相当。芦丁为5-羟基，4-酮基，3位键接糖，含有邻二酚羟基类黄酮。黄酮（A）为中性醋酸铅沉淀分离所得黄酮，还原能力大于芦丁说明黄酮（A）可能在3位含有羟基。而黄酮（B）为一般酚羟基黄酮，不含邻二酚羟基，但还原能力与芦丁相当，可能3-羟基对还原能力贡献较大。 2.8 清除DPPH自由基的测定
DPPH自由基在可见光区的最大吸收峰为517 nm，其乙醇溶液呈深紫色，当自由基清除剂存在时由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析来检测自由基消除情况，从而评价某种物质的抗氧化能力。抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，其抗氧化能力越强[21-22]。由表2可知，黄酮（A）对DPPH自由基的清除能力明显高于芦丁，黄酮（B）低于芦丁。清除DPPH自由基能力与还原能力的表现一致。
2.9 黄酮（A）抗油脂氧化研究
用清除DPPH自由基能力的大小衡量抗油脂的氧化能力是较合理的[17]，为此对黄酮（A）进行了抗猪油氧化效果的研究。由表3可知，黄酮（A）对油脂有明显的抗氧化作用，312 h内过氧化值基本保持不变，且与对照品BHT基本相当。但到达336 h后黄酮（A）抗氧化能力逐渐下降，随着时间的延长POV抑制率值快速下降，说明黄酮（A）抗氧化的持续效果不及BHT。
3 讨论与结论
试验结果发现，鼠曲草黄酮主要存在于花中，是茎叶的5倍以上，以邻二酚羟基兼有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物为主要成分。花中黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度40%、提取温度70 ℃、料液比1∶40、提取时间2 h，得率为3.81%。文献[23-24]报道的鼠曲草总黄酮得率分别为4.63%和0.2%，与本文研究结果不相同，原因是原料品种不同，且文献中没有把茎叶和花分开。但报道显示采用微波或超声波辅助是提高提取效果的一种方法。
试验结果还发现，黄酮（A）表现出较强的还原能力和清除DPPH自由基的能力，在抗猪油氧化试验中的持续效果虽不及BHT，但可通过增加黄酮（A）使用量弥补持续性的不足。文献[25-27]报道了鼠曲草用乙醇（80%、75%）、甲醇（70%）提取物（含总酚和总黄酮）的抗大豆油脂氧化及还原能力、清除DPPH自由基的能力，与本文研究的结论基本一致。研究表明，鼠曲草特别是花在医用和保健功能方面有较好的功效，在食品加工方面也有开发潜能。
4 参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第75卷[M].北京： 科学出版社，1979：221-226.
[2] 云南省药物研究所.云南天然药物图鉴：第1卷[M].昆明：云南科技出版社，2004：477.
[3] 张慧颖，孙赟，饶高雄.鼠曲草属药用植物化学成分及药理作用研究进展[J].中国民族民间医药，2012，15（3）：60-64.
[4] 宫玉婷，王钰，阿不都拉·阿巴斯.梓树果实中黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品科学，2008，29（4）：193-195.
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（上接第240页）
[5] 易俗，王瑞兰，谭新中，等.庐山石韦总黄酮的提取工艺初探[J].湘潭师范学院学报（自然科学版），2004，26（4）：76-78.
[6] 陈佳，徐怀德，米林峰，等.洋葱皮总黄酮纤维素酶法提取及抗氧化研究[J].食品科学，2011，32（4）：37-41.
[7] 郑昆，隋新，张晓杰，等.菠萝蛋白酶提取的初步研究[J].吉林化工学院学报，2005，22（1）：16-18.
[8] 刘品华，赵利敏，张鸭光，等.臭参地上部分酶水解条件及黄酮、多糖的研究[J].食品研究与开发，2016，37（6）：64-67.
[9] 刘品华，林慧，刘明研，等.干巴菌废弃料酶水解优化条件及黄酮、多糖含量的研究[J].西南农业学报，2016，29（8）：1849-1853.
[10] 刘品华，李兴虎，刘明研，等.玛咖地上部分酶水解的研究[J].食品科技，2015，40（2）：86-90.
[11] 黄群，肖文军，孙术国，等.α-淀粉酶和糖化酶协同酶解葛根淀粉动力学研究[J].食品科学，2012，33（21）：187-191.
[12] 北京医学院，北京中医学院.中草药成分化学[M].北京：人民卫生出版社，1980：292-326.
[13] 薛畅敏，申艳艳，赵越.槐角黄酮抗油脂氧化作用[J].食品研究与开发，2013，34（13）：117-120.
[14] 刘品华，杨涛，刘明研，等.四种香料抗猪油氧化性的研究[J].食品工业，2015，36（10）：19-21.
[15] 杨涛，韩磊，冯国强，等.小黑药总黄酮抗氧化性研究[J].现代农业科技，2015（17）：311-316.
[16] 刘品华，杨光红，田雪莲，等.小黑药抗油脂氧化及抑菌效果研究[J].食品工业科技，2011，32（10）：311-316.
[17] 刘品华，刘明研，杨涛，等.干巴菌抗氧化性的研究[J].西南农业学报，2016，29（10）：2330-2334.
[18] 刘俊，黄少伟，张越非，等.微波辅助提取土茯苓总黄酮[J].中药材，2007，30（12）：1591-1595.
[19] 孙智敏，李发堂，殷蓉，等.黄酮类化合物提取工艺研究进展[J].河北化工，2005（4）：7-8.
[20] 何玲玲，王新，刘彬，等.板栗多糖的分离纯化及抗氧化活性研究[J].食品与机械，2010，26（2）：72-75.
[21] 周晓丽，邵震，李婷婷，等.木瓜黄酮的提取及抗氧化性研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：170-172.
[22] 张志国，陈锦屏.红枣核类黄酮清除DPPH自由基活性研究[J].食品科学，2007，28（2）：67-70.
[23] 石青浩，李荣，姜子涛.食用鼠曲草黄酮的提取及体外抗氧化性研究[J].食品与生物技术学报，2013，32（3）：307-312.
[24] 杨雪鸥，杨露茜，袁涛，等.细叶鼠曲草总黄酮提取工艺研究[J].湖北农业科学，2017，56（4）：712-715.
[25] 高浩祥，薛凡，何强，等.鼠曲草提取物对食用油脂贮藏过程中氧化酸败的抑制及機理研究[J].食品工业科技，2017，38（4）：148-157.
[26] 廖鹏飞，廖艳桃，吴福恒.鼠曲草提取液黄酮类化合物抗菌及抗氧化性能[J].食品科技，2014，39（3）：193-197.
[27] 蒋燚，郭霜，张飞雪.不同方法对中药鼠曲草粗提物体外抗氧化活性的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（8）：157-160.
关键词 鼠曲草；花；提取；总黄酮；抗氧化活性；过氧化值
中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）24-0237-04
Study on Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Flower of Gnaphalium affine D. Don
ZHANG De-sheng KANG Zhao-jin YOU Shuang-mei XIA Wan-qiu FENG Ya-juan LIU Pin-hua
（College of Chemistry and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011）
Abstract Gnaphalium affine D.Don is an annual herb，which distributes widely in China and is often fed in Tomb-Sweeping Day.This paper tested the content of total flavonoids in stem，leaves and flowers of Gnaphalium affine D.Don，and compared the extraction methods.Total flavonoids were precipitated with lead acetate and purified by column chromatography.The results showed that the content of flavonoids in the stem and leaves，flowers of Gnaphalium affine D.Don were 7.37 mg/g and 38.14 mg/g，respectively.The optimum extraction conditions were as following，ethanol concentration was 40%，solid-liquid ratio was 1∶40，temperature was 70 ℃，time was 2 h.The content of flavonoids（A）was highest，reducing ability and DPPH free radical scavenging ability were higher than that of rutin，which had obvious anti-lard oxidation ability，but the persistence of antioxidation was not as good as BHT. Flavonoids（B）had similar antioxidant activity to rutin.
Key words Gnaphalium affine D.Don；flower；extraction；total flavonoid；antioxidant activity；peroxidation value
鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don），菊科，簇生，一年生草本，生于海拔1 600～2 700 m的田埂、荒地、路旁，尤以稻田最常見。清明前民间有采集嫩尖食用的习惯。茎叶入药，化痰止咳、清热利湿，活血降压，是治气喘和支气管炎以及非传染性溃疡、创伤的常见用药，全草含胡萝卜素、抗坏血酸、硫胺素、核黄素、花中木犀草素4′-β-D-葡萄糖苷、鼠曲草素、斛皮素-5-甲醚，有镇咳、抑菌的作用[1-2]。现有研究表明，鼠曲草属植物具有多种生物活性，除了医药价值，在营养保健、生物农药、化妆品等方面也有一定的应用价值。鼠曲草资源丰富，药食两用，是一种极具开发利用潜质的生物资源[3]。因此，本文研究了鼠曲草花中黄酮的提取方法及抗氧化活性，以期为深加工和综合开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鼠曲草及鼠曲草花（云南曲靖采摘）；猪油（购自曲靖一超市新鲜肥猪膘，实验室火炼法提取）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）（食品级，郑州超凡有限公司）；芦丁（化学对照品，中国药品生物制品检定所）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（日本原装进口，AR）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（广州市化学试剂玻璃仪器批发部，AR）；水杨酸、焦性没食子酸等试剂均为分析纯。
1.2 仪器
分析天平（AL204-IC，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；紫外分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）；离心机（4 000 r/min，常州国华电器有限公司）；旋转蒸发仪（N-1100，上海爱朗仪器有限公司）；恒温培养箱（29SN-DP-501，天津试验仪器厂）。
1.3 研究方法
1.3.1 原料的预处理。鼠曲草茎叶及花除弃杂质，洗净，65 ℃烘干粉碎后80 ℃烘至恒重，放入干燥器中备用。 1.3.2 标准曲线的绘制。精密称取经120 ℃减压真空干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，获得芦丁储备液。取芦丁储备液10 mL置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，获得芦丁使用液。取芦丁使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL（质量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg），分别置于50 mL容量瓶中。加95%乙醇至总体积为15 mL，依次加入100 g/L硝酸铝溶液1 mL、9.8 g/L醋酸钾溶液1 mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，静置1 h。以未加芦丁使用液为空白对照，用1 cm比色皿于415 nm处测定吸光度。以芦丁质量为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程，y=0.644 4x-0.001 7，R2=0.999 9。
1.3.3 茎叶及花中总黄酮含量的检测。分别准确称取恒重的茎叶及花1 g于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇30 mL，70 ℃水浴回流提取2 h，取出冷却至室温，用60%乙醇定容至刻度，摇均，滤纸过滤，弃前1/3滤液，取1 mL滤液于50 mL容量瓶中，按1.3.2中方法显色，在415 nm处测定吸光度，由回归方程计算总黄酮含量。
1.3.4 鼠曲草花中黄酮提取条件的考察。具体包括以下内容。
（1）乙醇浓度对黄酮提取的影响。准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇200 mL，70 ℃恒温水浴提取2 h[4]，取出冷却至室温，用对应浓度乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳乙醇浓度。
（2）时间对黄酮提取的影响。准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比加入40%乙醇 200 mL，于70 ℃恒温水浴提取30、60、90、120、150 min，取出冷却至室温，用40%乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳时间。
（3）温度对黄酮提取的影响。准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶20的料液比加入40%乙醇200 mL，分别于55、60、65、70、75、80 ℃恒温水浴提取2 h，取出冷却至室温，用40%乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳温度。
（4）料液比对黄酮提取的影响。按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（m/v）的料液比准确称取鼠曲草花于250 mL容量瓶中加入40%乙醇，于70 ℃水浴提取2 h，取出冷却至室温，用40%乙醇定容至刻度。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳料液比。
（5）碱液对黄酮提取的影响。参考鼠曲草花中黄酮含量及酚羟基数量确定考察方案：准确称取10 g鼠曲草花于250 mL容量瓶中，按1∶40的料液比分别加入15%Na2CO3、5%NaOH、饱和Ca（OH）2 200 mL于70 ℃恒温水浴提取2 h，取出冷却至室温，用对应碱液定容至刻度。滤纸过滤，弃前1/3滤液，滤液用稀盐酸调节pH值为4～5[5]。按1.3.3中方法检测总黄酮含量。由此确定提取的最佳碱液。
（6）纤维素酶对黄酮提取的影响。称取0.200 0 g纤维素酶于250 mL锥形瓶中，精确称取鼠曲草花5 g，加入95 mL 水。调节pH≈5，45 ℃水浴中磁力搅拌[6]，水解24 h，取出加热沸腾15 min使酶灭活，在80 ℃烘箱中烘干，再转移到250 mL容量瓶中加入40%乙醇200 mL，70 ℃恒温水浴提取2 h，取出冷却至室温后用40%乙醇定容到250 mL。滤纸过滤，按1.3.3中方法检测总黄酮含量，计算提取率。
（7）菠萝蛋白酶对黄酮提取的影响。称取5.600 0 g菠萝蛋白酶于250 mL燒杯中，精确称取鼠曲草花5 g，加水95 mL。调节pH≈7，45 ℃水浴中磁力搅拌[7-10]，水解5 h，后续步骤同纤维素酶的方法。
（8）木瓜蛋白酶对黄酮提取的影响。称取1.000 0 g木瓜蛋白酶于250 mL烧杯中，精确称取鼠曲草花5 g，加入95 mL水[8-10]。调节pH≈6，60 ℃水浴中磁力搅拌，水解3 h，后续步骤同纤维素酶的方法。
（9）淀粉酶对黄酮提取的影响。称取0.600 0 g淀粉酶于250 mL烧杯中，精确称取鼠曲草花5 g，加入95 mL水[11]。调节pH≈6，45 ℃水浴中磁力搅拌，水解2 h，后续步骤同纤维素酶的方法。
1.3.5 鼠曲草花中总黄酮的分离。浸提液中滴加10%醋酸铅至无沉淀，离心分离得沉淀物（说明含有邻二酚羟基或兼有3-羟基，4-酮基或5-羟基，4-酮基的化合物），清液滴加10%碱式醋酸铅至无沉淀，离心分离得沉淀物（说明含有一般酚类化合物）[12]。在沉淀物中分别加入一定量乙醇使其分散，并用85%硫酸调节pH值为5～6，离心分离。清液减压浓缩制样。用硅胶柱分离，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脱除尽叶绿素，用75%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩制样。用聚酰胺柱分离，蒸馏水洗脱至无色，收集75%乙醇洗脱液，旋干后用适量40%乙醇溶解得醋酸铅沉淀黄酮（A）和碱性醋酸铅沉淀黄酮（B），供抗氧化试验及抗猪油氧化使用。
1.3.6 还原能力的测定。将黄酮（A）、黄酮（B）、芦丁配制成0.302 mg/mL供测试使用。取芦丁溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL分别于15 mL离心管中，补充水至0.5 mL（试样的质量浓度为0、60.4、120.8、181.2、241.6、302.0 μg/mL），不加铁氰化钾溶液的为对应空白样。分别加入pH=6.6，0.2 mol/L磷酸缓冲溶液2.50 mL和1%的铁氰化钾溶液2.50 mL，混合均匀，于50 ℃水浴中反应20 min后快速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混合均匀。取清液2.50 mL于试管中，加入2.50 mL蒸馏水，再加入0.1%三氯化铁溶液0.50 mL，混合均匀，于室温下静置10 min，700 nm测定吸光度。黄酮（A）、黄酮（B）方法同芦丁。 1.3.7 清除DPPH试验。将黄酮（A）、黄酮（B）、芦丁配制成60.4 μg/mL供测试使用。取芦丁溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于15 mL离心管中，补充乙醇至总体积为2 mL，然后加入0.22 mmol/L的DPPH溶液2.00 mL（试样的质量浓度为1.51、3.02、4.53、6.04、7.55、9.06 μg/mL），于室温暗处放置反应30 min，517 nm测得的吸光度为A1，以2.00 mL无水乙醇代替样液测得的吸光度为A2，以2.00 mL乙醇代替DPPH溶液测得的吸光值为A3（空白）。黄酮（A）、黄酮（B）方法同芦丁。试样对DPPH的清除率：
清除率（%）=×100
1.3.8 黄酮（A）的抗油脂氧化的试验。具体有以下方面内容。
（1）标准曲线的绘制。参照GB/T 5009.37适当改动，用二氯甲烷代替三氯甲烷绘制标准曲线，分别精密量取10.0 μg/mL铁标准使用液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（相当于0，2.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0 μg）于干燥的10 mL比色管中，用二氯甲烷 甲醇（7 3）混合溶剂稀释至刻度，混匀。加1滴（约0.05 mL）硫氰酸钾溶液（300 g/L），摇匀。室温下准确放置5 min后，1 cm比色皿，以二氯甲烷 甲醇（7 3）混合溶剂为参比，500 nm测吸光度值，各点吸光度值减去零管吸光度值后绘制标准曲线，以铁标准质量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程：y=0.037 4x-0.011 6，R2=0.999 3。
（2）烘箱诱导法抗猪油氧化试验。取猪油20 g于培养皿中。试验组、对照组分别加入乙酸乙酯配制的浓度为1.51 mg/mL黄酮（A）及BHT溶液2.7 mL（折合为4.0 mg），空白组加入乙酸乙酯2.7 mL。搅拌均匀，水浴加热除去乙酸乙酯。然后将各组培养皿置于（65±1）℃的烘箱诱导氧化，每隔48 h取样，参照GB/T 5009.37方法测定其过氧化值[13-15]。同时比较了POV抑制率的大小[16-17]，计算公式如下：
POV抑制率（%）=■×100
2 结果与分析
试验得知鼠曲草花中黄酮含量为3.814%；茎叶中黄酮含量为0.737%。花中的黃酮含量约为茎叶的5倍，为此主要针对花中的黄酮进行研究。醋酸铅沉淀分离得总黄酮约为85%，碱式醋酸铅沉淀得总黄酮约为15%，说明鼠曲草花中黄酮主要含有邻二酚羟基兼有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物，也含有部分一般酚类黄酮化合物。
2.1 乙醇浓度对提取率的影响
由图1可知，40%乙醇提取效果最佳，提取率达到3.81%，30%、50%乙醇提取效果基本相当。黄酮苷是由黄酮苷元与糖基构成，黄酮苷元极性较小，糖基极性较大。根据“相似相溶”原则，黄酮苷易溶于中等或中等偏上极性的溶剂中。因为水分子之间具有较高的结合能，能很好地溶解与水分子具有强烈相互作用的物质，所以黄酮苷元在水中的溶解度较低。对于乙醇水溶液，由于引入了羟基，乙醇分子之间不仅彼此以氢键相结合，而且与水分子也形成氢键，降低了水的极性，故黄酮苷元的溶解度增加。乙醇浓度超过40%时极性相对偏低，黄酮苷的溶解度也降低。另外乙醇浓度越高，细胞蛋白质越易变性凝固，不利于乙醇向细胞内渗透，影响了提取率[18]。从乙醇浓度对提取率的影响表明鼠曲草花中黄酮以含糖基构成为主。
2.2 时间对提取率的影响
提取开始时易溶于溶剂的成分以转移到溶剂为主，随着时间的延长，溶剂中溶解成分浓度增加，从溶剂中转移到被提取物的量逐渐增加，最后形成溶出与吸附平衡。由图2可知，120 min以后提取率趋于稳定，此时黄酮的提取率为3.81%。
2.3 温度对提取率的影响
温度越高越有利于黄酮的提取，但同时杂质溶出量也相应增大，同时对温度敏感的活性成分易被破坏。由图3可知，随温度的升高，总黄酮提取率呈增加趋势，温度从55 ℃到75 ℃提取率增加了约0.5%。70 ℃与75 ℃基本相当，故70～75 ℃是较合理的选择，此时黄酮的提取率为3.7%～3.8%。
2.4 料液比对提取效果的影响
由于黄酮的提取率随料液比的减小而升高，但溶剂用量大提取的成本也增加。由图4可知，从单次的料液比效果看，1∶30较1∶20有明显提高，1∶40时总黄酮的提取率达到最大值，为3.81%。故1∶40为最佳料液比。
2.5 碱液对黄酮提取率的影响
黄酮类化合物分子中多含有酚羟基，显酸性，故可用碱性溶液提取。黄酮中酚羟基的酸性越弱，要求的碱性越强，才能生成盐，提高在水中的溶解度。碱液提取时，所用碱的浓度不宜过高，以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核[19]。由图5可知，饱和氢氧化钙浓度约为0.16%，提取效果高于其他2种碱液。氢氧化钠、碳酸钠提取率低可能是因为碱性过强破坏黄酮结构或因碱性弱、浓度过大所导致。碱液提取效果明显低于40%乙醇的情况说明羟基在乙醇中的溶解度影响大于生成盐在水中溶解度的影响。
2.6 酶水解对黄酮提取率的影响
由图6可知，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解提取总黄酮的效果明显高于淀粉酶和纤维素酶水解的提取率。说明蛋白质的存在会影响黄酮扩散进入提取液。原因可能是，在乙醇的作用下蛋白质发生变性包裹了黄酮，阻滞了乙醇的扩散，还可能是因蛋白质中氨基与酚羟基的结合影响了提取效果。比较水解条件，采用木瓜蛋白酶预处理后提取鼠曲草花中黄酮更加合理。
2.7 还原能力的测定
通过测定还原能力的大小可以用来证实抗氧化活性的大小[20]。由表1可知，鼠曲草花中黄酮（A）的还原能力大于对照样芦丁，且随浓度的增加还原能力明显增强。黄酮（B）与芦丁基本相当。芦丁为5-羟基，4-酮基，3位键接糖，含有邻二酚羟基类黄酮。黄酮（A）为中性醋酸铅沉淀分离所得黄酮，还原能力大于芦丁说明黄酮（A）可能在3位含有羟基。而黄酮（B）为一般酚羟基黄酮，不含邻二酚羟基，但还原能力与芦丁相当，可能3-羟基对还原能力贡献较大。 2.8 清除DPPH自由基的测定
DPPH自由基在可见光区的最大吸收峰为517 nm，其乙醇溶液呈深紫色，当自由基清除剂存在时由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析来检测自由基消除情况，从而评价某种物质的抗氧化能力。抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，其抗氧化能力越强[21-22]。由表2可知，黄酮（A）对DPPH自由基的清除能力明显高于芦丁，黄酮（B）低于芦丁。清除DPPH自由基能力与还原能力的表现一致。
2.9 黄酮（A）抗油脂氧化研究
用清除DPPH自由基能力的大小衡量抗油脂的氧化能力是较合理的[17]，为此对黄酮（A）进行了抗猪油氧化效果的研究。由表3可知，黄酮（A）对油脂有明显的抗氧化作用，312 h内过氧化值基本保持不变，且与对照品BHT基本相当。但到达336 h后黄酮（A）抗氧化能力逐渐下降，随着时间的延长POV抑制率值快速下降，说明黄酮（A）抗氧化的持续效果不及BHT。
3 讨论与结论
试验结果发现，鼠曲草黄酮主要存在于花中，是茎叶的5倍以上，以邻二酚羟基兼有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物为主要成分。花中黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度40%、提取温度70 ℃、料液比1∶40、提取时间2 h，得率为3.81%。文献[23-24]报道的鼠曲草总黄酮得率分别为4.63%和0.2%，与本文研究结果不相同，原因是原料品种不同，且文献中没有把茎叶和花分开。但报道显示采用微波或超声波辅助是提高提取效果的一种方法。
试验结果还发现，黄酮（A）表现出较强的还原能力和清除DPPH自由基的能力，在抗猪油氧化试验中的持续效果虽不及BHT，但可通过增加黄酮（A）使用量弥补持续性的不足。文献[25-27]报道了鼠曲草用乙醇（80%、75%）、甲醇（70%）提取物（含总酚和总黄酮）的抗大豆油脂氧化及还原能力、清除DPPH自由基的能力，与本文研究的结论基本一致。研究表明，鼠曲草特别是花在医用和保健功能方面有较好的功效，在食品加工方面也有开发潜能。
4 参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第75卷[M].北京： 科学出版社，1979：221-226.
[2] 云南省药物研究所.云南天然药物图鉴：第1卷[M].昆明：云南科技出版社，2004：477.
[3] 张慧颖，孙赟，饶高雄.鼠曲草属药用植物化学成分及药理作用研究进展[J].中国民族民间医药，2012，15（3）：60-64.
[4] 宫玉婷，王钰，阿不都拉·阿巴斯.梓树果实中黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品科学，2008，29（4）：193-195.
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（上接第240页）
[5] 易俗，王瑞兰，谭新中，等.庐山石韦总黄酮的提取工艺初探[J].湘潭师范学院学报（自然科学版），2004，26（4）：76-78.
[6] 陈佳，徐怀德，米林峰，等.洋葱皮总黄酮纤维素酶法提取及抗氧化研究[J].食品科学，2011，32（4）：37-41.
[7] 郑昆，隋新，张晓杰，等.菠萝蛋白酶提取的初步研究[J].吉林化工学院学报，2005，22（1）：16-18.
[8] 刘品华，赵利敏，张鸭光，等.臭参地上部分酶水解条件及黄酮、多糖的研究[J].食品研究与开发，2016，37（6）：64-67.
[9] 刘品华，林慧，刘明研，等.干巴菌废弃料酶水解优化条件及黄酮、多糖含量的研究[J].西南农业学报，2016，29（8）：1849-1853.
[10] 刘品华，李兴虎，刘明研，等.玛咖地上部分酶水解的研究[J].食品科技，2015，40（2）：86-90.
[11] 黄群，肖文军，孙术国，等.α-淀粉酶和糖化酶协同酶解葛根淀粉动力学研究[J].食品科学，2012，33（21）：187-191.
[12] 北京医学院，北京中医学院.中草药成分化学[M].北京：人民卫生出版社，1980：292-326.
[13] 薛畅敏，申艳艳，赵越.槐角黄酮抗油脂氧化作用[J].食品研究与开发，2013，34（13）：117-120.
[14] 刘品华，杨涛，刘明研，等.四种香料抗猪油氧化性的研究[J].食品工业，2015，36（10）：19-21.
[15] 杨涛，韩磊，冯国强，等.小黑药总黄酮抗氧化性研究[J].现代农业科技，2015（17）：311-316.
[16] 刘品华，杨光红，田雪莲，等.小黑药抗油脂氧化及抑菌效果研究[J].食品工业科技，2011，32（10）：311-316.
[17] 刘品华，刘明研，杨涛，等.干巴菌抗氧化性的研究[J].西南农业学报，2016，29（10）：2330-2334.
[18] 刘俊，黄少伟，张越非，等.微波辅助提取土茯苓总黄酮[J].中药材，2007，30（12）：1591-1595.
[19] 孙智敏，李发堂，殷蓉，等.黄酮类化合物提取工艺研究进展[J].河北化工，2005（4）：7-8.
[20] 何玲玲，王新，刘彬，等.板栗多糖的分离纯化及抗氧化活性研究[J].食品与机械，2010，26（2）：72-75.
[21] 周晓丽，邵震，李婷婷，等.木瓜黄酮的提取及抗氧化性研究[J].食品工业科技，2007，28（8）：170-172.
[22] 张志国，陈锦屏.红枣核类黄酮清除DPPH自由基活性研究[J].食品科学，2007，28（2）：67-70.
[23] 石青浩，李荣，姜子涛.食用鼠曲草黄酮的提取及体外抗氧化性研究[J].食品与生物技术学报，2013，32（3）：307-312.
[24] 杨雪鸥，杨露茜，袁涛，等.细叶鼠曲草总黄酮提取工艺研究[J].湖北农业科学，2017，56（4）：712-715.
[25] 高浩祥，薛凡，何强，等.鼠曲草提取物对食用油脂贮藏过程中氧化酸败的抑制及機理研究[J].食品工业科技，2017，38（4）：148-157.
[26] 廖鹏飞，廖艳桃，吴福恒.鼠曲草提取液黄酮类化合物抗菌及抗氧化性能[J].食品科技，2014，39（3）：193-197.
[27] 蒋燚，郭霜，张飞雪.不同方法对中药鼠曲草粗提物体外抗氧化活性的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（8）：157-160.