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摘 要 为明确拟南芥At2g04450启动子对靶标基因表达的启动作用，根据已报道的拟南芥基因组序列设计合成1对引物，以拟南芥基因组DNA为模板克隆At2g04450上游调控序列，并与pBAR-GUS中间表达载体相连构建植物表达载体p04450p-GUS，采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥，以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性以及病原菌PstDC3000对该启动子的诱导表达效果。结果表明：获得At2g04450上游调控序列，该序列不仅具有启动子活性，并且具有组织特异性，GUS基因主要在根特异表达；病原菌PstDC3000对该启动子的表达没有诱导作用。本结果将为研究At2g04450的功能奠定基础。
关键词 At2g04450启动子；GUS活性；组织表达特异性
中图分类号 Q78 文献标识码 A
Molecular Cloning and Activity Analysis of a Promoter of
an Arabidopsis thaliana Gene At2g04450
WU Kunxin1，ZHANG Xiuchun1，CHEN Xiongting1，LIU Zhixin1，PENG Ming1，2*
1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory
of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China
2 Environmental Safety Supervision and Inspection Centre for Genetically Modified Plants and Microorganisms
used in Plants，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China
Abstract 5′-UTR of At2g04450 gene was cloned by PCR from Arabidopsis thaliana. To investigate the tissue expression pattern and the possible response to pathogen infection of the cloned regulatory sequence，an expression vector containing this sequence fused with GUS was constructed for transformation into A. thaliana by using agrobacterium-mediated method. Histochemical staining of transgenic A. thaliana showed that GUS reporter gene was predominantly expressed in roots，and the activity of the promoter can not be induced by the PstDC3000. This research will facilitate the study of At2g04450 gene function.
Key words At2g04450 promoter；GUS activity；Tissue specificity
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.010
At2g04450命名为AtNUDT6，是分布于拟南芥细胞质中的 Nudix水解酶基因[1]。Nudix（Nucleoside diphosphates linked to some moiety X）水解酶是需要Mg2+的一类酶，这类酶的共同特征是含有高度保守的由23个氨基酸残基组成的Nudix基序（motif/box），广泛存在于包括病毒、细菌、真核生物在内的250多种生物中。细菌和人类Nudix至少具有2大功能，一是清除细胞内产生的有害代谢产物；二是调节各生化途径的中间代谢产物的积累[1]。
与人类和大肠杆菌相比，植物Nudix水解酶基因家族的研究起步比较晚。拟南芥基因组全序列分析发现拟南芥至少存在24个Nudix水解酶基因，分布于细胞质、叶绿体和线粒体中。目前对Nudix 水解酶基因家族的了解还不够充分，甚至在某些认识上存在矛盾。拟南芥第一个Nudix 水解酶基因（AtNUDT1），体外生化分析发现AtNUDT1是一个NADH焦磷酸化酶，在体内生理状态下表现为具有对叶酸前体物质和（脱氧）核苷三磷酸的水解酶活性，表明AtNUDT1是一个双功能酶[2-3]。Ogawa等[4]研究显示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7和AtNUDT10 在体外实验中均可水解ADP-ribose和NADH，且过量表达AtNUDT2能增强拟南芥的抗氧化能力[4]。Bartsch等[5]的研究结果也提示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7 和AtNUDT10 可以通过水解细胞内ADP-ribose 从而减少游离ADP-ribose对细胞的伤害作用，但它们在植物体内的实际作用还有待于进一步研究。
哺乳动物中NUDT6被证明能够调节纤维原细胞生长因子的表达[6]，并且还可能通过对生长信号的反应来调节增值[7]。Ishikawa等[8]研究表明拟南芥AtNUDT6在转录后水平受绿茶儿茶酸的负调控，但在依赖于NPR1的水杨酸信号传导途径中起正调控作用。目前尚未见At2g04450启动子活性分析的相关报道。本研究从拟南芥中获得At2g04450上游调控序列，并以它驱动GUS基因的表达，明确其对靶基因表达的启动作用。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型为本实验室保存。
1.1.2 药品与试剂 pMD18-T vector 购自TaKaRa公司；分子生物学实验用各种限制性内切酶、连接酶等购自Promaga公司；生化试剂购自Sigma公司；大肠杆菌（E. coli）DH5α、 根癌农杆菌（Agrob-acterium tumefaciens）GV3101、 载体pBAR-GUS、 病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（PstDC3000）为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 At2g04450启动子的分离、克隆和测序 采用试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取高纯度拟南芥基因组DNA，具体按试剂盒说明书进行。根据GenBank序列（登录号：CP002685.1），设计At2g04450上游非编码区的特异引物04450p-F： TCAAAGATACCGGACTGTGGAAGC和04450p-R： AACTAGTCCATATTCTAAGAAAACCCAAGTTC（图2），以拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR扩增。将PCR扩增产物连接到pMD18-T质粒，按Sambrook等[9]方法，转化E. coli DH5α感受态细胞，经筛选获得重组质粒。采用用ABI Prism 377测序仪进行测定。利用数据库PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对启动子调控元件进行预测分析。
1.2.2 04450p：：GUS植物表达载体的构建 克隆的04450p启动子片段用AgeI和SpeI进行双酶切，将释放出的外源片段与经AgeI和SpeI双酶切的载体pBAR-GUS相连，转化大肠杆菌，摇菌并抽提质粒。将酶切鉴定正确的克隆用冻融法转入根癌农杆菌GV3101菌株中。
1.2.3 拟南芥转化 转化方法采用花序浸泡法[10]，抗性植株的筛选参照张秀春等[11]进行。
1.2.4 抗性植株PCR检测 采用NaOH法快速提取抗性植株基因组DNA，以叶片基因组DNA为模板，BAR-219F（GGTCTGCACCATCGTCAACCACTA
CA）和BAR-671R（GGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCC
AGAA）为引物，PCR反应体系参照产品说明书进行。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 病原菌的培养和接种 病原菌的培养按Whalen等[12]方法进行。将培养好的病原菌以10 mmol/L MgCl2稀释至OD600=0.1，用没有针头的注射器器口紧贴叶片背面，然后用力缓慢推注射器使菌液完全注入右半片叶子，直到注射的右半叶片湿润为止。本研究以8个独立的转基因株系为试验材料，重复3次。每株系接6个重复（6棵），每个重复接种3片叶子，分别取注射1、5、24 h后的叶片进行GUS活性的组织化学染色分析，以注射10 mmol/L MgCl2的叶片为对照。
1.2.6 GUS活性的组织化学染色分析 种植T3代纯合植株，分别取不同时期及不同组织的材料进行GUS染色[13]。
2 结果与分析
2.1 At2g04450基因启动子片段的扩增
以拟南芥Col-0生态型的总基因组DNA为模板，用特异引物04450p-F和04450p-R进行PCR扩增获得1 405 bp的At2g04450上游调控序列（图1-a），命名为04450p。将扩增产物与pMD18-T载体连接后在含X-Gal和IPTG的固体LB培养基上进行重组子的筛选，并对其中1个白斑用AgeI和SpeI进行酶切鉴定，结果如图1-b所示，待鉴定质粒的酶切产物与预期大小相同，将该重组质粒命名为pMD18-04450p。pMD18-04450p序列分析表明，克隆的04450p与GenBank中登录的序列（登录号：CP002685.1）一致。
2.2 植物表达载体的构建和转化
用AgeI和SpeI酶切重组质粒pMD18-04450p，回收1 400 bp左右的目的片段，并插入到pBAR-GUS载体的GUS报告基因上游，所得重组质粒经AgeI和SpeI进行双酶切鉴定，获得预期大小的目的片段，结果如图2所示，经鉴定的重组子命名p04450p-GUS。通过冻融法，将获得的重组表达载体转化农杆菌GV3101菌株，提取质粒并经AgeI和SpeI双酶切验证（图略）后用于拟南芥转化。
2.3 抗性植株PCR检测
用渗透转化法，将p04450p-GUS转入拟南芥，经除草剂抗性筛选获得33株抗性植株。以BAR-219F和BAR-671R为引物，对抗性植株进行PCR检测，部分结果如图3所示。其扩增结果均与质粒p04450p-GUS的扩增结果相同，在250～500 bp之间出现一条明亮条带，大小与预期一致，证明此抗性植株均含有bar基因片段，获得了转基因04450p：：GUS植株。
2.4 At2g04450启动子在不同组织中的活性分析
将筛选出的转基因04450p：：GUS植株T3代纯合子进行GUS组织化学染色，结果表明野生型拟南芥（对照）幼苗和花序（图4-a，4-f）没有GUS表达，而转基因04450p：：GUS植株的表达情况（图4-c～e， h～j）与CaMV35S[14]（图4-b， 4-g）、AtNUDT8[15]、AtNUDT5[16]等组成型表达启动子完全不同，表现为2周大的转基因幼苗叶片除在顶端和两侧的3点外其余部位均没有检测到GUS信号（图4-c， 4-d），而根部只有侧根中间部分检测到GUS表达信号（图4-j），但是在莲座叶（图4-e）、整个花序（图4-h）、果荚（图4-i）没有检测到GUS表达信号。本结果显示，所分离克隆的片段具有启动子功能并且有一定的组织特异性。 2.5 病原菌PstDC3000对At2g04450启动子的诱导表达分析
病原菌PstDC3000的诱导表达分析如图5所示，与已报道的受病原菌诱导的04430p：：GUS转基因植株GUS表达量随着诱导时间的增加而加强不同[17]，病原菌PstDC3000 诱导1、5、24 h 后的04450p：：GUS转基因植株GUS的表达与注射10 mmol/L MgCl2 24 h后的对照并没有区别，均没有GUS活性，说明病原菌PstDC3000 对At2g04450 启动子驱动的GUS表达没有诱导作用。
3 讨论与结论
本研究中At2g04450启动子在不同组织中的活性分析结果显示，该启动子的活性在根中明显高于其他部位，这与Ogawa等[1]的研究报道At2g04450在根中的转录水平明显低于茎和叶不同，其原因可能是由于培养条件不同所致。Jambunathan等[17]报道野生型拟南芥（Col-0）的AtNUDT2，AtNUDT6和 AtNUDT7在营养丰富程度不同的培养基质中表达水平有所差异。
病原菌PstDC3000对At2g04450启动子的诱导表达分析结果显示，该病原菌对At2g04450启动子没有诱导作用，该结果与Adams-Phillips等[18]报道的病原菌PstDC3000对拟南芥At2g04450基因的表达没有诱导作用相一致。此外，其与该序列的生物信息学分析结果相吻合，在04450p序列中除包含基本的启动元件及大量的CAAT盒外，还包含MBS元件（干旱诱导相关）、HSE元件（热胁迫相关）以及与光响应有关的ACCT-motif、GAG-motif、 TCT-motif、G-box及MRE元件（图6），表明该序列不仅具有启动子活性，而且还可能具有多重因子的诱导活性。但是该启动子缺乏与病原菌诱导相关的顺式作用元件GCC 类元件和W-boxes元件[19-20]等。W-box[（T）TGAC（C/T）]是植物特有的超基因家族WRKY转录因子的结合位点。越来越多的证据表明，W-boxes是许多病原诱导植物基因的主要顺式作用元件。串连排列的W-box往往与病原的诱导特性有关。
本研究成功地克隆拟南芥At2g04450的启动子04450p，并与pBAR-GUS相连构建了植物表达载体p04450p-GUS，采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥，通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析，并对3.5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果显示该启动子具有一定的组织特异性，并且病原菌PstDC3000对该启动子的表达没有诱导作用。本研究将为拟南芥At2g04450的功能研究提供参考。
参考文献
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关键词 At2g04450启动子；GUS活性；组织表达特异性
中图分类号 Q78 文献标识码 A
Molecular Cloning and Activity Analysis of a Promoter of
an Arabidopsis thaliana Gene At2g04450
WU Kunxin1，ZHANG Xiuchun1，CHEN Xiongting1，LIU Zhixin1，PENG Ming1，2*
1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory
of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China
2 Environmental Safety Supervision and Inspection Centre for Genetically Modified Plants and Microorganisms
used in Plants，Ministry of Agriculture，Haikou，Hainan 571101，China
Abstract 5′-UTR of At2g04450 gene was cloned by PCR from Arabidopsis thaliana. To investigate the tissue expression pattern and the possible response to pathogen infection of the cloned regulatory sequence，an expression vector containing this sequence fused with GUS was constructed for transformation into A. thaliana by using agrobacterium-mediated method. Histochemical staining of transgenic A. thaliana showed that GUS reporter gene was predominantly expressed in roots，and the activity of the promoter can not be induced by the PstDC3000. This research will facilitate the study of At2g04450 gene function.
Key words At2g04450 promoter；GUS activity；Tissue specificity
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.010
At2g04450命名为AtNUDT6，是分布于拟南芥细胞质中的 Nudix水解酶基因[1]。Nudix（Nucleoside diphosphates linked to some moiety X）水解酶是需要Mg2+的一类酶，这类酶的共同特征是含有高度保守的由23个氨基酸残基组成的Nudix基序（motif/box），广泛存在于包括病毒、细菌、真核生物在内的250多种生物中。细菌和人类Nudix至少具有2大功能，一是清除细胞内产生的有害代谢产物；二是调节各生化途径的中间代谢产物的积累[1]。
与人类和大肠杆菌相比，植物Nudix水解酶基因家族的研究起步比较晚。拟南芥基因组全序列分析发现拟南芥至少存在24个Nudix水解酶基因，分布于细胞质、叶绿体和线粒体中。目前对Nudix 水解酶基因家族的了解还不够充分，甚至在某些认识上存在矛盾。拟南芥第一个Nudix 水解酶基因（AtNUDT1），体外生化分析发现AtNUDT1是一个NADH焦磷酸化酶，在体内生理状态下表现为具有对叶酸前体物质和（脱氧）核苷三磷酸的水解酶活性，表明AtNUDT1是一个双功能酶[2-3]。Ogawa等[4]研究显示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7和AtNUDT10 在体外实验中均可水解ADP-ribose和NADH，且过量表达AtNUDT2能增强拟南芥的抗氧化能力[4]。Bartsch等[5]的研究结果也提示，AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7 和AtNUDT10 可以通过水解细胞内ADP-ribose 从而减少游离ADP-ribose对细胞的伤害作用，但它们在植物体内的实际作用还有待于进一步研究。
哺乳动物中NUDT6被证明能够调节纤维原细胞生长因子的表达[6]，并且还可能通过对生长信号的反应来调节增值[7]。Ishikawa等[8]研究表明拟南芥AtNUDT6在转录后水平受绿茶儿茶酸的负调控，但在依赖于NPR1的水杨酸信号传导途径中起正调控作用。目前尚未见At2g04450启动子活性分析的相关报道。本研究从拟南芥中获得At2g04450上游调控序列，并以它驱动GUS基因的表达，明确其对靶基因表达的启动作用。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型为本实验室保存。
1.1.2 药品与试剂 pMD18-T vector 购自TaKaRa公司；分子生物学实验用各种限制性内切酶、连接酶等购自Promaga公司；生化试剂购自Sigma公司；大肠杆菌（E. coli）DH5α、 根癌农杆菌（Agrob-acterium tumefaciens）GV3101、 载体pBAR-GUS、 病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（PstDC3000）为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 At2g04450启动子的分离、克隆和测序 采用试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取高纯度拟南芥基因组DNA，具体按试剂盒说明书进行。根据GenBank序列（登录号：CP002685.1），设计At2g04450上游非编码区的特异引物04450p-F： TCAAAGATACCGGACTGTGGAAGC和04450p-R： AACTAGTCCATATTCTAAGAAAACCCAAGTTC（图2），以拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR扩增。将PCR扩增产物连接到pMD18-T质粒，按Sambrook等[9]方法，转化E. coli DH5α感受态细胞，经筛选获得重组质粒。采用用ABI Prism 377测序仪进行测定。利用数据库PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对启动子调控元件进行预测分析。
1.2.2 04450p：：GUS植物表达载体的构建 克隆的04450p启动子片段用AgeI和SpeI进行双酶切，将释放出的外源片段与经AgeI和SpeI双酶切的载体pBAR-GUS相连，转化大肠杆菌，摇菌并抽提质粒。将酶切鉴定正确的克隆用冻融法转入根癌农杆菌GV3101菌株中。
1.2.3 拟南芥转化 转化方法采用花序浸泡法[10]，抗性植株的筛选参照张秀春等[11]进行。
1.2.4 抗性植株PCR检测 采用NaOH法快速提取抗性植株基因组DNA，以叶片基因组DNA为模板，BAR-219F（GGTCTGCACCATCGTCAACCACTA
CA）和BAR-671R（GGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCC
AGAA）为引物，PCR反应体系参照产品说明书进行。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5 病原菌的培养和接种 病原菌的培养按Whalen等[12]方法进行。将培养好的病原菌以10 mmol/L MgCl2稀释至OD600=0.1，用没有针头的注射器器口紧贴叶片背面，然后用力缓慢推注射器使菌液完全注入右半片叶子，直到注射的右半叶片湿润为止。本研究以8个独立的转基因株系为试验材料，重复3次。每株系接6个重复（6棵），每个重复接种3片叶子，分别取注射1、5、24 h后的叶片进行GUS活性的组织化学染色分析，以注射10 mmol/L MgCl2的叶片为对照。
1.2.6 GUS活性的组织化学染色分析 种植T3代纯合植株，分别取不同时期及不同组织的材料进行GUS染色[13]。
2 结果与分析
2.1 At2g04450基因启动子片段的扩增
以拟南芥Col-0生态型的总基因组DNA为模板，用特异引物04450p-F和04450p-R进行PCR扩增获得1 405 bp的At2g04450上游调控序列（图1-a），命名为04450p。将扩增产物与pMD18-T载体连接后在含X-Gal和IPTG的固体LB培养基上进行重组子的筛选，并对其中1个白斑用AgeI和SpeI进行酶切鉴定，结果如图1-b所示，待鉴定质粒的酶切产物与预期大小相同，将该重组质粒命名为pMD18-04450p。pMD18-04450p序列分析表明，克隆的04450p与GenBank中登录的序列（登录号：CP002685.1）一致。
2.2 植物表达载体的构建和转化
用AgeI和SpeI酶切重组质粒pMD18-04450p，回收1 400 bp左右的目的片段，并插入到pBAR-GUS载体的GUS报告基因上游，所得重组质粒经AgeI和SpeI进行双酶切鉴定，获得预期大小的目的片段，结果如图2所示，经鉴定的重组子命名p04450p-GUS。通过冻融法，将获得的重组表达载体转化农杆菌GV3101菌株，提取质粒并经AgeI和SpeI双酶切验证（图略）后用于拟南芥转化。
2.3 抗性植株PCR检测
用渗透转化法，将p04450p-GUS转入拟南芥，经除草剂抗性筛选获得33株抗性植株。以BAR-219F和BAR-671R为引物，对抗性植株进行PCR检测，部分结果如图3所示。其扩增结果均与质粒p04450p-GUS的扩增结果相同，在250～500 bp之间出现一条明亮条带，大小与预期一致，证明此抗性植株均含有bar基因片段，获得了转基因04450p：：GUS植株。
2.4 At2g04450启动子在不同组织中的活性分析
将筛选出的转基因04450p：：GUS植株T3代纯合子进行GUS组织化学染色，结果表明野生型拟南芥（对照）幼苗和花序（图4-a，4-f）没有GUS表达，而转基因04450p：：GUS植株的表达情况（图4-c～e， h～j）与CaMV35S[14]（图4-b， 4-g）、AtNUDT8[15]、AtNUDT5[16]等组成型表达启动子完全不同，表现为2周大的转基因幼苗叶片除在顶端和两侧的3点外其余部位均没有检测到GUS信号（图4-c， 4-d），而根部只有侧根中间部分检测到GUS表达信号（图4-j），但是在莲座叶（图4-e）、整个花序（图4-h）、果荚（图4-i）没有检测到GUS表达信号。本结果显示，所分离克隆的片段具有启动子功能并且有一定的组织特异性。 2.5 病原菌PstDC3000对At2g04450启动子的诱导表达分析
病原菌PstDC3000的诱导表达分析如图5所示，与已报道的受病原菌诱导的04430p：：GUS转基因植株GUS表达量随着诱导时间的增加而加强不同[17]，病原菌PstDC3000 诱导1、5、24 h 后的04450p：：GUS转基因植株GUS的表达与注射10 mmol/L MgCl2 24 h后的对照并没有区别，均没有GUS活性，说明病原菌PstDC3000 对At2g04450 启动子驱动的GUS表达没有诱导作用。
3 讨论与结论
本研究中At2g04450启动子在不同组织中的活性分析结果显示，该启动子的活性在根中明显高于其他部位，这与Ogawa等[1]的研究报道At2g04450在根中的转录水平明显低于茎和叶不同，其原因可能是由于培养条件不同所致。Jambunathan等[17]报道野生型拟南芥（Col-0）的AtNUDT2，AtNUDT6和 AtNUDT7在营养丰富程度不同的培养基质中表达水平有所差异。
病原菌PstDC3000对At2g04450启动子的诱导表达分析结果显示，该病原菌对At2g04450启动子没有诱导作用，该结果与Adams-Phillips等[18]报道的病原菌PstDC3000对拟南芥At2g04450基因的表达没有诱导作用相一致。此外，其与该序列的生物信息学分析结果相吻合，在04450p序列中除包含基本的启动元件及大量的CAAT盒外，还包含MBS元件（干旱诱导相关）、HSE元件（热胁迫相关）以及与光响应有关的ACCT-motif、GAG-motif、 TCT-motif、G-box及MRE元件（图6），表明该序列不仅具有启动子活性，而且还可能具有多重因子的诱导活性。但是该启动子缺乏与病原菌诱导相关的顺式作用元件GCC 类元件和W-boxes元件[19-20]等。W-box[（T）TGAC（C/T）]是植物特有的超基因家族WRKY转录因子的结合位点。越来越多的证据表明，W-boxes是许多病原诱导植物基因的主要顺式作用元件。串连排列的W-box往往与病原的诱导特性有关。
本研究成功地克隆拟南芥At2g04450的启动子04450p，并与pBAR-GUS相连构建了植物表达载体p04450p-GUS，采用农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥，通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析，并对3.5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果显示该启动子具有一定的组织特异性，并且病原菌PstDC3000对该启动子的表达没有诱导作用。本研究将为拟南芥At2g04450的功能研究提供参考。
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