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【摘 要】目的：研究多长时间内经福尔马林固定的标本既保证了组织形态的完好，还不影响DNA的提取。材料和方法：人体新鲜肿瘤组织经福尔马林固定标本12例，长期经福尔马林固定的标本10例，采用传统饱和酚氯仿抽提法提取DNA。结果：新鲜标本在福尔马林固定一周内提取DNA效果好，一周后DNA开始讲解，一个月后无法提取DNA。福尔马林长期固定的标本，经处理后有2例可以提出DNA，提取效果不好。结论：采用福尔马林固定的组织标本提取DNA最好在一周内，能保证DNA质量。
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01294-01
随着分子生物学的进展，提取人体肿瘤DNA进行深入研究是常见的实验方法之一。DNA可以从患者血、尿、及肿瘤组织等多种途径获得，但人们更多采用从新鲜肿瘤组织中获得DNA。要想得到新鲜的肿瘤组织，对于不在临床工作的科研工作者来说是比较困难的，途径之一可以天天去医院取标本，这样需要专人往返与单位和医院之间，费时费力；途径之二可以将液氮罐放在医院，但需要定期更换液氮罐，也比较麻烦；因此，为了节省时间和人力，许多研究人员采取福尔马林固定标本，一次性取回标本，但新的问题出现了，从福尔马林固定的组织标本提取DNA存在一定的困难，因为福尔马林会造成DNA降解，导致产量低，影响进一步的研究。有研究显示福尔马林对DNA的降解与固定的时间有关，但是多长时间内经福尔马林固定的标本既保证了组织形态的完好，还不影响DNA的提取，尚缺少具体的实验室数据，就此进行了深入细致的研究。
1材料與方法：
1.1实验材料：从沈阳市沈洲医院和辽宁省肿瘤收集了新鲜肿瘤标本12例，包括子宫肌瘤4例，胃癌4例，大肠癌4例，每例标本体积约3cm3，同一天取材并固定于10%福尔马林溶液中，溶液均没过组织块。另取1998年从中国医科大学收集经福尔马林固定的胃癌标本10例。
1.2 方法：称出标本100mg， 用均浆器均浆，参考Sambroock 等人[1]的方法提取DNA，加入蛋白酶K的量按标准量（100μg/ml），在56℃水浴3小时，不断轻摇混均，视消化效果可以加入标准量的1/2倍蛋白酶K进行消化，直至将材料完全消化为止，用饱和酚氯仿抽提法提取DNA。每天进行一次DNA的提取。
1.3 标本处理：对于1998年长期福尔马林固定的标本，依据文献[2]用PBS溶液冲洗，放在灭菌纸上将其揩干，于超净工作台上用无菌剪刀将材料剪成50mg的小块，放入PBS液浸泡24小时后，转入70%的乙醇中处理24小时。一次换入梯度酒精中处理，80%乙醇2小时，重复一次；90%乙醇2小时，重复一次；95%乙醇2小时，重复一次，然后将材料放入1/2倍的PBS液中浸泡12小时，其间更换一次溶液。然后按照1.2方法提取DNA。
1.4 标本DNA的扩增
随机选取两对引物进行扩增，引物一序列5’CAA GCA GTC ATC CTT TCT C 3’， 5’GCA CTTAGGGATCCCATGAA3’， 扩增条件94℃ 7min ，94℃30s，54℃20s，72℃30s，72℃10min，40个循环，4℃保存。引物二序列，扩增条件上游引物5’GTA GTT TGC CCA AGG TCA AG 3’， 下游引物5’ AGC CAC CTG AGG GGT AAG 3’ 。扩增条件：95℃12分，95℃30秒，58.5℃30秒，72℃60秒 15个循环。
取DNA模板2μl，在2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2 结果
2.1 新鲜标本经福尔马林固定后的结果
新鲜标本经福尔马林固定后经电泳检测为阳性 ，条带清晰明亮。每天提取一次DNA，并检测，直至一周后，DNA提取的阳性率开始下降，到一个月时电泳检测结果均为阴性（图1，2）。
图1 M 为Mark DL2000，1-12道为新鲜肿瘤组织引物一的阳性条带 374bp
图2 M为MarkDL2000，1-12道新鲜肿瘤组织引物二阳性条带429bp
2.2 长期福尔马林固定的标本提取DNA的结果
按文献处理后的标本，电泳检测结果阳性率很低，只有20%，而且阳性条带很弱（图3）， 未处理的标本，电泳检测均为阴性。
图3 M 为MarkDL2000，2，6道为引物一的阳性条带，1，3-5，7-10为阴性
3 讨论
福尔马林固定组织标本是科研工作者收集资料常用的方法之一，因为福尔马林是一种防腐剂，可以较好的保存组织的形态，但是对组织的DNA造成较严重的破坏，严重的影响DNA的质量，主要因为其可以导致DNA-蛋白质之间、蛋白质-蛋白质之间及DNA-DNA之间的交联，这种交联阻碍蛋白质被蛋白酶K完全消化，导致DNA的产量下降。
同时人们发现福尔马林固定标本的时间与DNA的提取质量有关，固定的时间越长，DNA提取的质量越差[3-6]，所以如何能保持组织形态的同时更好的保存DNA的质量，是值得研究的问题。
我们收集了子宫肌瘤、胃癌和大肠癌等标本，用福尔马林固定后，在不同的时间段进行DNA的提取，结果显示在一周之内，DNA的提取效果非常好。在工作中我们也发现石蜡组织提取DNA效果也非常好，这可能都是同样的道理，也就是临床上固定并包埋标本多在一周左右，在一周之内福尔马林可能未能浸透组织，对DNA的破坏较小，支持了我们的结果。而超过一周，DNA提取的质量降低，到一个月时DNA的无法获得。我们用长期固定的胃癌标本进行了同样的实验，未做特殊处理时，DNA检测结果均为阴性，后采用的文献的方法对标本进行了处理，但结果也非常不理想，阳性率低，条带较弱。我们也采用了不同厂家用于长期福尔马林标本DNA的提取试剂盒，虽然有阳性结果，但产量仍很低，无法用于大样本的研究。文献[5]所采用的标本是动物标本，结果理想，与本结果不同，可能标本种属不同造成的差异。再有考虑到组织类型的不同是否对DNA提取有影响，我们分别选取高分化、低分化和印戒细胞胃癌进行研究，发现结果没差别，但本文选取的随机引物，是否可能正好这段DNA缺失，造成提取效果不佳，尚需要进一步研究。
所以，为解决收集标本的困扰，我们可以采用福尔马林固定标本，但最好在一周之内提取组织DNA，如果不能及时提取DNA，标本可分装，放到PBS液里， 或者直接冰冻，这样能够保证组织形态的同时，又能保证DNA不被破坏，可进行分子生物学的研究。
参考文献：
[1] Sambrook，J.， E.F.Fritsch and T.Maniatis .1989 Molecular cloning .A Laboratory Manual .2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press，463-468
[2] 徐来祥，张知彬，宋铭晶等.福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法.动物学报，2002， 48（2）：264-9
[3] 夏颖哲，盛岩，陈宜瑜.福尔马林对固定DNA提取和扩增的影响.，四川动物学报，2006， 25（3）：662-5
[4] Bielawski K，Zaczek A ，Lisowska U，et al .The suitability of DNA extracted from formalin-fixed， paraffined-embedded tissue for double differential polymerase chain reaction analysis. Int J Mol Medicine， 2001，8：573-8
[5] Wu Lin， Patten N， Tsuchiya B， et al .Comparison of the DNA extraction of DNA from formalin-fixed ，paraffin-embedded tissue. Appl Immunohistochem Mol Morpjol，2002，10（3）：269-274
[6] Fang SG， Wan QH， Fujihara N. Formalin removal from archival tissue by critical point drying .Bio Techniques， 2002，33：604-11
【中图分类号】R734.2 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01294-01
随着分子生物学的进展，提取人体肿瘤DNA进行深入研究是常见的实验方法之一。DNA可以从患者血、尿、及肿瘤组织等多种途径获得，但人们更多采用从新鲜肿瘤组织中获得DNA。要想得到新鲜的肿瘤组织，对于不在临床工作的科研工作者来说是比较困难的，途径之一可以天天去医院取标本，这样需要专人往返与单位和医院之间，费时费力；途径之二可以将液氮罐放在医院，但需要定期更换液氮罐，也比较麻烦；因此，为了节省时间和人力，许多研究人员采取福尔马林固定标本，一次性取回标本，但新的问题出现了，从福尔马林固定的组织标本提取DNA存在一定的困难，因为福尔马林会造成DNA降解，导致产量低，影响进一步的研究。有研究显示福尔马林对DNA的降解与固定的时间有关，但是多长时间内经福尔马林固定的标本既保证了组织形态的完好，还不影响DNA的提取，尚缺少具体的实验室数据，就此进行了深入细致的研究。
1材料與方法：
1.1实验材料：从沈阳市沈洲医院和辽宁省肿瘤收集了新鲜肿瘤标本12例，包括子宫肌瘤4例，胃癌4例，大肠癌4例，每例标本体积约3cm3，同一天取材并固定于10%福尔马林溶液中，溶液均没过组织块。另取1998年从中国医科大学收集经福尔马林固定的胃癌标本10例。
1.2 方法：称出标本100mg， 用均浆器均浆，参考Sambroock 等人[1]的方法提取DNA，加入蛋白酶K的量按标准量（100μg/ml），在56℃水浴3小时，不断轻摇混均，视消化效果可以加入标准量的1/2倍蛋白酶K进行消化，直至将材料完全消化为止，用饱和酚氯仿抽提法提取DNA。每天进行一次DNA的提取。
1.3 标本处理：对于1998年长期福尔马林固定的标本，依据文献[2]用PBS溶液冲洗，放在灭菌纸上将其揩干，于超净工作台上用无菌剪刀将材料剪成50mg的小块，放入PBS液浸泡24小时后，转入70%的乙醇中处理24小时。一次换入梯度酒精中处理，80%乙醇2小时，重复一次；90%乙醇2小时，重复一次；95%乙醇2小时，重复一次，然后将材料放入1/2倍的PBS液中浸泡12小时，其间更换一次溶液。然后按照1.2方法提取DNA。
1.4 标本DNA的扩增
随机选取两对引物进行扩增，引物一序列5’CAA GCA GTC ATC CTT TCT C 3’， 5’GCA CTTAGGGATCCCATGAA3’， 扩增条件94℃ 7min ，94℃30s，54℃20s，72℃30s，72℃10min，40个循环，4℃保存。引物二序列，扩增条件上游引物5’GTA GTT TGC CCA AGG TCA AG 3’， 下游引物5’ AGC CAC CTG AGG GGT AAG 3’ 。扩增条件：95℃12分，95℃30秒，58.5℃30秒，72℃60秒 15个循环。
取DNA模板2μl，在2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2 结果
2.1 新鲜标本经福尔马林固定后的结果
新鲜标本经福尔马林固定后经电泳检测为阳性 ，条带清晰明亮。每天提取一次DNA，并检测，直至一周后，DNA提取的阳性率开始下降，到一个月时电泳检测结果均为阴性（图1，2）。
图1 M 为Mark DL2000，1-12道为新鲜肿瘤组织引物一的阳性条带 374bp
图2 M为MarkDL2000，1-12道新鲜肿瘤组织引物二阳性条带429bp
2.2 长期福尔马林固定的标本提取DNA的结果
按文献处理后的标本，电泳检测结果阳性率很低，只有20%，而且阳性条带很弱（图3）， 未处理的标本，电泳检测均为阴性。
图3 M 为MarkDL2000，2，6道为引物一的阳性条带，1，3-5，7-10为阴性
3 讨论
福尔马林固定组织标本是科研工作者收集资料常用的方法之一，因为福尔马林是一种防腐剂，可以较好的保存组织的形态，但是对组织的DNA造成较严重的破坏，严重的影响DNA的质量，主要因为其可以导致DNA-蛋白质之间、蛋白质-蛋白质之间及DNA-DNA之间的交联，这种交联阻碍蛋白质被蛋白酶K完全消化，导致DNA的产量下降。
同时人们发现福尔马林固定标本的时间与DNA的提取质量有关，固定的时间越长，DNA提取的质量越差[3-6]，所以如何能保持组织形态的同时更好的保存DNA的质量，是值得研究的问题。
我们收集了子宫肌瘤、胃癌和大肠癌等标本，用福尔马林固定后，在不同的时间段进行DNA的提取，结果显示在一周之内，DNA的提取效果非常好。在工作中我们也发现石蜡组织提取DNA效果也非常好，这可能都是同样的道理，也就是临床上固定并包埋标本多在一周左右，在一周之内福尔马林可能未能浸透组织，对DNA的破坏较小，支持了我们的结果。而超过一周，DNA提取的质量降低，到一个月时DNA的无法获得。我们用长期固定的胃癌标本进行了同样的实验，未做特殊处理时，DNA检测结果均为阴性，后采用的文献的方法对标本进行了处理，但结果也非常不理想，阳性率低，条带较弱。我们也采用了不同厂家用于长期福尔马林标本DNA的提取试剂盒，虽然有阳性结果，但产量仍很低，无法用于大样本的研究。文献[5]所采用的标本是动物标本，结果理想，与本结果不同，可能标本种属不同造成的差异。再有考虑到组织类型的不同是否对DNA提取有影响，我们分别选取高分化、低分化和印戒细胞胃癌进行研究，发现结果没差别，但本文选取的随机引物，是否可能正好这段DNA缺失，造成提取效果不佳，尚需要进一步研究。
所以，为解决收集标本的困扰，我们可以采用福尔马林固定标本，但最好在一周之内提取组织DNA，如果不能及时提取DNA，标本可分装，放到PBS液里， 或者直接冰冻，这样能够保证组织形态的同时，又能保证DNA不被破坏，可进行分子生物学的研究。
参考文献：
[1] Sambrook，J.， E.F.Fritsch and T.Maniatis .1989 Molecular cloning .A Laboratory Manual .2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press，463-468
[2] 徐来祥，张知彬，宋铭晶等.福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法.动物学报，2002， 48（2）：264-9
[3] 夏颖哲，盛岩，陈宜瑜.福尔马林对固定DNA提取和扩增的影响.，四川动物学报，2006， 25（3）：662-5
[4] Bielawski K，Zaczek A ，Lisowska U，et al .The suitability of DNA extracted from formalin-fixed， paraffined-embedded tissue for double differential polymerase chain reaction analysis. Int J Mol Medicine， 2001，8：573-8
[5] Wu Lin， Patten N， Tsuchiya B， et al .Comparison of the DNA extraction of DNA from formalin-fixed ，paraffin-embedded tissue. Appl Immunohistochem Mol Morpjol，2002，10（3）：269-274
[6] Fang SG， Wan QH， Fujihara N. Formalin removal from archival tissue by critical point drying .Bio Techniques， 2002，33：604-11