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摘要：目的：研究速激肽HK-1类似物 HK-1（1-7）， HK-1（1-8）， HK-1（1-9）HK-1（1-10）对人精子活力的影响研究及构效分析。方法：收集2012年兰州大学第一医院生殖医学专科医院志愿者精液为实验材料，加入生理盐水为空白对照组，加入肉碱为阳性对照组，加入速激肽HK-1类似物[HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）]为实验组，通过计算机辅助精液分析（CASA）方法，检测速激肽其类似物[HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）]不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）对精子活力的影响。结果：速激肽类似物HK-1（1-7）、HK-1（1-8）、HK-1（1-9）、HK-1（1-10）不同浓度对精子活力均无作用，而HK-1能提高精子活力。结论：速激肽碳末端的结构对精子活力的影响中起主要作用。
关键词：精子活力;速激肽HK-1;类似物
在我国不孕症占育龄夫妇的10%，其中男性不育约占一半[1]，引起男性不育的原因可能有环境因素、生活方式、心理因素和生理性疾病等。随着生活方式的改变和环境因素的变化，由男性精液质量异常导致的不育症发生率逐渐升高。弱精症（asthenospermia）是指精液参数中前向运动的精子（a和b级）小于50%或a级运动的精子小于25%的病症，弱精症又称精子活力低下。引起精子活力低下的病因较多。归纳起来主要有以下几类：感染、精液液化异常、免疫因素、内分泌因素、染色体异常、精浆中所含的微量元素异常、维生素类缺乏、与精子运动有关的酶类缺乏或酶活性降低、从事高温、放射职业和接触化学毒物等。此外，吸烟、饮酒以及某些药物因素等都可以通过对精子的直接和间接损伤而影响精子活力。其中内分泌因素与精子活力密切相关。
速激肽家族 （Tachykinin）是由较短的氨基酸序列组成的一类激素，是一种神经肽，广泛分布在哺乳动物和非哺乳动物休内，它们都是短链多肽。哺乳动物速激肽包括 SP，NKA，NKB 和最近发现的 HK-1。这些肽通过结合3种不同的G蛋白偶联的神经激肽受体来发挥其生物学活性。这3种神经激肽受体分别被命名为NK1，NK2和NK3受体，其中SP是NK1受体的内源性配体，NKA是NK2受体的内源性配体，NKB是NK3受体的内源性配体[2-7]。
有实验研究表明NK1，NK2，NK3受体在人精子上都有表达并且SP，NKA和NKB都能提高精子活力，增加A级和B级精子的比例，但是所需药物浓度较高（微摩尔级），作用时间较短，在1-2小时时作用最强，随后逐渐减弱[8]，但这些作用的深入机理还有待研究。通过计算机辅助精液分析（CASA）方法，检测速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）对精子活力的影响，将筛选出高效，安全的类似物用于体外受精—胚胎移植（IVF-ET）术和单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）术可以大大提高其成功率，为弱精症患者提供一种新的治疗策略。
1.资料与方法
1.1资料
1.1.1标本采集
按照《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验检验手册》（第4 版）[9]标准收集2012年兰大一院生殖中心精液分析中心志愿者精液[精子浓度≥20×106/mL，a+b≦40%]的精液标本，标本提供者年龄22～35岁，无心、肝、肾疾病，禁欲3 ～ 5 d，取样前48 h 禁酒和咖啡等对精子有影响的食物或药物，手淫取精，每份标本均经两次以上检查核实。
1.1.2 试剂与仪器
合成筛选出的不同浓度的速激肽其类似物[HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）]不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）;0.9% 氯化钠注射液（ 4.5 g /500 ml; 产品批号： 10030641） 为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;终浓度为5mmol/L的L—肉碱。计算机辅助的精液分析系统（ CASA） 为杭州麦迪公司产品。
1.2 方法
1.2.1 分组
200例弱精症患者的精液标本。分组： 共分6个组，空白对照组加入生理盐水;阳性对照组加入终浓度为5mmol/L的左旋肉碱;实验组分别加入速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10），各实验组均设置3个不同浓度组，加药剂量如下。①空白对照组（ 1 份） ： 加入50μl 等渗生理盐水与试管内的50μl 精子悬液混匀; ②阳性对照组（ 1 份） ： 加入50μl终浓度为5mmol/L的左旋肉碱与试管内的50μl 精子悬液混匀; ③速激肽类似物HK-1（1-7）组（ 3 份） ： 用等渗生理盐水将速激肽类似物HK-1（1-7）配制成3 种不同浓度，各取50μl 药液分别与3个试管内的50 μl 精子悬液混匀，使其终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L; ④速激肽类似物HK-1（1-8）组（ 3 份） ： 同上方法速激肽类似物HK-1（1-8）组终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L;⑤速激肽类似物HK-1（1-9）组（3份） ： 同上方法速激肽类似物HK-1（1-10）的终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L; ⑥速激肽类似物HK-1（1-10）组（3份） ： 同上方法速激肽类似物HK-1（1-10）的终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L。以上各组配制好后迅速将试管密封，混匀，分别于0 min、10 min、30 min、60 min 及90 min用CASA 分析精子的活力。 1.2.2 研究指标
①精子活力（ a + b） %，②活力衰减幅度，△（ a + b） % = [（ 各浓度药物作用精子的活力- 对照组精子的活力） /对照组精子的活力]×100%。
1.3 统计学分析
各组数据以x ± s 表示，应用SPSS 11. 0 统计软件，组间比较采用单因素方差分析，组内比较选择t 检验，P <0. 05 为差异有显著性。
2 结果
2.1人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-7）对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-7）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-7）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
2.2人HK-1 类似物HK-1（1-8） 对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-8）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-8）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
2.3人HK-1 类似物HK-1（1-9） 对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-9）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-9）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
2.4人HK-1 类似物HK-1（1-10） 对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
3 讨论
精子的运动是研究许多药物药理特性的一个潜在的指标[10-12]，肉碱是已证实的可以提高弱精子的精活力、活率及精子运动能力的有效药物[13-15]。前期报道发现速激肽能改善精子活力，故检测速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）对精子活力的影响。
本资料显示， 速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）分别作用精子， 其 10 min、 30 min、 60 min、90 min的（a + b）级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）;与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。因此，本研究发现去除碳末端的速激肽类似物则失去提高精子活力的能力。进一步证明了速激肽HK-1碳末端在发挥生殖方面的作用是不可或缺的重要部分
综上所述， 速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）在不同时间点对精子活力无影响，因此，速激肽在对精子活力的影响中起主要作用的结构为碳末端。这就为设计、合成新型的速激肽类似物提供了一定的理论依据。同时进一步证实了速激肽碳末端结构是影响精子活力的关键因素为治疗男性精子功能低下提供了新思路和新方法。
参考文献：
[1]涂冰， 韦安阳. 不孕不育的诊断与治疗. 北京：人民军医出版社， 2002.
[2]Neubig RR， Faseb J. Fluorescent BODIPY-GTP Analogs：Real-Time Measurement of Nucleotide Binding to G Proteins. Anal Biochem. 2001; 291： 109-1178.
[3]Gerard NP， Garraway LA， Eddy RL， Jr， Shows TB， Iijima H， Paquet JL， Gerard C. Human substance P receptor （NK-1）： organization of the gene， chromosome localization， and functional expression of cDNA clones. Biochemistry. 1991; 30： 10640-10646.
[4]Takeda Y， Chou KB， Takeda J， Sachais BS， Krause JE. Molecular cloning， structural organization and functional expression of the human substance P receptor. Biochemical and biophysical research communications. 1991; 179： 1232-1240.
[5]Takahashi K， Tanaka A， Hara M， Nakanishi S. The primary structure and gene organization of human substance P and neuromedin K receptors. European journal of biochemistry/FEBS. 1992; 204： 1025-1033.
关键词：精子活力;速激肽HK-1;类似物
在我国不孕症占育龄夫妇的10%，其中男性不育约占一半[1]，引起男性不育的原因可能有环境因素、生活方式、心理因素和生理性疾病等。随着生活方式的改变和环境因素的变化，由男性精液质量异常导致的不育症发生率逐渐升高。弱精症（asthenospermia）是指精液参数中前向运动的精子（a和b级）小于50%或a级运动的精子小于25%的病症，弱精症又称精子活力低下。引起精子活力低下的病因较多。归纳起来主要有以下几类：感染、精液液化异常、免疫因素、内分泌因素、染色体异常、精浆中所含的微量元素异常、维生素类缺乏、与精子运动有关的酶类缺乏或酶活性降低、从事高温、放射职业和接触化学毒物等。此外，吸烟、饮酒以及某些药物因素等都可以通过对精子的直接和间接损伤而影响精子活力。其中内分泌因素与精子活力密切相关。
速激肽家族 （Tachykinin）是由较短的氨基酸序列组成的一类激素，是一种神经肽，广泛分布在哺乳动物和非哺乳动物休内，它们都是短链多肽。哺乳动物速激肽包括 SP，NKA，NKB 和最近发现的 HK-1。这些肽通过结合3种不同的G蛋白偶联的神经激肽受体来发挥其生物学活性。这3种神经激肽受体分别被命名为NK1，NK2和NK3受体，其中SP是NK1受体的内源性配体，NKA是NK2受体的内源性配体，NKB是NK3受体的内源性配体[2-7]。
有实验研究表明NK1，NK2，NK3受体在人精子上都有表达并且SP，NKA和NKB都能提高精子活力，增加A级和B级精子的比例，但是所需药物浓度较高（微摩尔级），作用时间较短，在1-2小时时作用最强，随后逐渐减弱[8]，但这些作用的深入机理还有待研究。通过计算机辅助精液分析（CASA）方法，检测速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）对精子活力的影响，将筛选出高效，安全的类似物用于体外受精—胚胎移植（IVF-ET）术和单精子卵胞浆内显微注射（ICSI）术可以大大提高其成功率，为弱精症患者提供一种新的治疗策略。
1.资料与方法
1.1资料
1.1.1标本采集
按照《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验检验手册》（第4 版）[9]标准收集2012年兰大一院生殖中心精液分析中心志愿者精液[精子浓度≥20×106/mL，a+b≦40%]的精液标本，标本提供者年龄22～35岁，无心、肝、肾疾病，禁欲3 ～ 5 d，取样前48 h 禁酒和咖啡等对精子有影响的食物或药物，手淫取精，每份标本均经两次以上检查核实。
1.1.2 试剂与仪器
合成筛选出的不同浓度的速激肽其类似物[HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）]不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）;0.9% 氯化钠注射液（ 4.5 g /500 ml; 产品批号： 10030641） 为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;终浓度为5mmol/L的L—肉碱。计算机辅助的精液分析系统（ CASA） 为杭州麦迪公司产品。
1.2 方法
1.2.1 分组
200例弱精症患者的精液标本。分组： 共分6个组，空白对照组加入生理盐水;阳性对照组加入终浓度为5mmol/L的左旋肉碱;实验组分别加入速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10），各实验组均设置3个不同浓度组，加药剂量如下。①空白对照组（ 1 份） ： 加入50μl 等渗生理盐水与试管内的50μl 精子悬液混匀; ②阳性对照组（ 1 份） ： 加入50μl终浓度为5mmol/L的左旋肉碱与试管内的50μl 精子悬液混匀; ③速激肽类似物HK-1（1-7）组（ 3 份） ： 用等渗生理盐水将速激肽类似物HK-1（1-7）配制成3 种不同浓度，各取50μl 药液分别与3个试管内的50 μl 精子悬液混匀，使其终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L; ④速激肽类似物HK-1（1-8）组（ 3 份） ： 同上方法速激肽类似物HK-1（1-8）组终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L;⑤速激肽类似物HK-1（1-9）组（3份） ： 同上方法速激肽类似物HK-1（1-10）的终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L; ⑥速激肽类似物HK-1（1-10）组（3份） ： 同上方法速激肽类似物HK-1（1-10）的终浓度为2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L。以上各组配制好后迅速将试管密封，混匀，分别于0 min、10 min、30 min、60 min 及90 min用CASA 分析精子的活力。 1.2.2 研究指标
①精子活力（ a + b） %，②活力衰减幅度，△（ a + b） % = [（ 各浓度药物作用精子的活力- 对照组精子的活力） /对照组精子的活力]×100%。
1.3 统计学分析
各组数据以x ± s 表示，应用SPSS 11. 0 统计软件，组间比较采用单因素方差分析，组内比较选择t 检验，P <0. 05 为差异有显著性。
2 结果
2.1人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-7）对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-7）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-7）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
2.2人HK-1 类似物HK-1（1-8） 对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-8）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-8）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
2.3人HK-1 类似物HK-1（1-9） 对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-9）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-9）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
2.4人HK-1 类似物HK-1（1-10） 对人精子活力的影响
人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）; 人速激肽HK-1 类似物HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）作用的精子，其4 个时间点的（ a + b） 级精子百分率与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。
3 讨论
精子的运动是研究许多药物药理特性的一个潜在的指标[10-12]，肉碱是已证实的可以提高弱精子的精活力、活率及精子运动能力的有效药物[13-15]。前期报道发现速激肽能改善精子活力，故检测速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）对精子活力的影响。
本资料显示， 速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）分别作用精子， 其 10 min、 30 min、 60 min、90 min的（a + b）级精子百分率与空白对照组相比均无显著变化（P >0.05）;与阳性对照组相比均显著降低（ P<0.05）。因此，本研究发现去除碳末端的速激肽类似物则失去提高精子活力的能力。进一步证明了速激肽HK-1碳末端在发挥生殖方面的作用是不可或缺的重要部分
综上所述， 速激肽类似物HK-1（1-7），HK-1（1-8），HK-1（1-9），HK-1（1-10）不同浓度（2×10-3mol/L，2×10-4mol/L，2×10-5mol/L）在不同时间点对精子活力无影响，因此，速激肽在对精子活力的影响中起主要作用的结构为碳末端。这就为设计、合成新型的速激肽类似物提供了一定的理论依据。同时进一步证实了速激肽碳末端结构是影响精子活力的关键因素为治疗男性精子功能低下提供了新思路和新方法。
参考文献：
[1]涂冰， 韦安阳. 不孕不育的诊断与治疗. 北京：人民军医出版社， 2002.
[2]Neubig RR， Faseb J. Fluorescent BODIPY-GTP Analogs：Real-Time Measurement of Nucleotide Binding to G Proteins. Anal Biochem. 2001; 291： 109-1178.
[3]Gerard NP， Garraway LA， Eddy RL， Jr， Shows TB， Iijima H， Paquet JL， Gerard C. Human substance P receptor （NK-1）： organization of the gene， chromosome localization， and functional expression of cDNA clones. Biochemistry. 1991; 30： 10640-10646.
[4]Takeda Y， Chou KB， Takeda J， Sachais BS， Krause JE. Molecular cloning， structural organization and functional expression of the human substance P receptor. Biochemical and biophysical research communications. 1991; 179： 1232-1240.
[5]Takahashi K， Tanaka A， Hara M， Nakanishi S. The primary structure and gene organization of human substance P and neuromedin K receptors. European journal of biochemistry/FEBS. 1992; 204： 1025-1033.