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摘 要：本文采用高校液相测定了阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的含量，固定相为：瑞士Hamilton反相液相色谱柱 HxSil C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un），乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相，检测波长为230nm；此方法简便、准确、重现性好，可用于阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的含量测定。
关键词：阿莫西林；原料；含量
酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善。酶法产品主要有产品含量稳定并且杂质低；酶法产品生产批量能够达到化学法产品的2～3倍；有机溶剂的使用量大幅度减少90%，废水排放减少80%等特点。本文采用高效液相法对阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的进行了含量测定。
1 仪器与试药
LC-2212型液相色谱仪（北京中科惠分仪器有限公司）；兰博OV3000大容量柱温箱（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；和泰Master-S超纯水机（自来水为水源）（上海和泰仪器有限公司）；BILON-1000C多用途恒温超声提取机（上海比朗仪器制造有限公司）；600220液相保护柱（天津琛航科苑科技发展有限公司）。乙腈（重庆跃翔化工有限公司）、磷酸二氢钾（重庆跃翔化工有限公司）、三乙胺（重庆跃翔化工有限公司）、磷酸（天津市精强化工有限公司）醋酸乙酯（重庆跃翔化工有限公司）、甲酸（天津市精强化工有限公司）、乙醇（重庆跃翔化工有限公司）、乙酸铵（重庆跃翔化工有限公司）。6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品自制。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-5]。色谱柱为瑞士Hamilton 反相液相色谱柱 HxSil C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un）；乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相；检测波长为230nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按阿莫西林峰计算应不得低于2500。
2.2 供试品溶液的制备
取阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物适量，精密称取，置50mL棕色量瓶中，加流动相适量，超声处理提取5分钟，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
取105℃干燥5小时的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品适量，精密称取6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品约10mg，置50mL棕色容量瓶中，用加流动相超声溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林0.2mg）。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为50、100、150、200、250、300、350、400μg·mL-1的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品在50～400μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照制备对照品溶液，精密吸取6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.86%，0.85%，0.86%，0.93%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批样品6份，分别依照2.2项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值为0.75%，0.81%，0.79%，0.85%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，30，60分钟精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林峰面积积分值的RSD为0.77%，0.76%，0.81%，0.85%。结果表明6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林至少在60分钟内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.5%，99.3%，99.5%，99.3%，RSD为0.86%，0.79%，0.81%，0.78%。
3 讨论
分别考察乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5），乙腈-30mmol·L-1碳酸氢铵水溶液（含有0.7%氨水、0.1%三乙胺）线性梯度洗脱，乙腈-水（46∶54），乙腈-水-三乙胺（30：70：0.1）；0.2%三乙胺溶液（用磷酸調p H至5.3）-乙腈（65∶35）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30：10：1：59）；不同比例的流动相，结果以乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相。
参考文献
[1]周晓溪，顾立素，逄涣欢，胡昌勤，冯芳.阿莫西林/克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定方法的比较[J].中国抗生素杂志，2005（12）.
[2]杨泽民，陈吉生，杜志昂，符玲海.反相高效液相色谱法同时测定阿莫维酸钾中阿莫西林和克拉维酸钾的含量[J].中国医院药学杂志，1999（09）.
[3]张珂.HPLC法测定阿莫西林克拉维酸钾颗粒的含量[J].药学进展，2007（05）.
[4]丁一冰，吴永淳，伊芳，王静，隋国福.HPLC法测定阿莫西林克拉维酸钾复方制剂的含量[J].黑龙江医药，1997（02）.
[5]王川平，任进民，孙倩，张晓青，徐智儒.RP-HPLC法同时测定人血清中阿莫西林、克拉维酸钾浓度[J].中国药师，2004（03）.
关键词：阿莫西林；原料；含量
酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善。酶法产品主要有产品含量稳定并且杂质低；酶法产品生产批量能够达到化学法产品的2～3倍；有机溶剂的使用量大幅度减少90%，废水排放减少80%等特点。本文采用高效液相法对阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的进行了含量测定。
1 仪器与试药
LC-2212型液相色谱仪（北京中科惠分仪器有限公司）；兰博OV3000大容量柱温箱（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；和泰Master-S超纯水机（自来水为水源）（上海和泰仪器有限公司）；BILON-1000C多用途恒温超声提取机（上海比朗仪器制造有限公司）；600220液相保护柱（天津琛航科苑科技发展有限公司）。乙腈（重庆跃翔化工有限公司）、磷酸二氢钾（重庆跃翔化工有限公司）、三乙胺（重庆跃翔化工有限公司）、磷酸（天津市精强化工有限公司）醋酸乙酯（重庆跃翔化工有限公司）、甲酸（天津市精强化工有限公司）、乙醇（重庆跃翔化工有限公司）、乙酸铵（重庆跃翔化工有限公司）。6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品自制。
2 含量测定
2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-5]。色谱柱为瑞士Hamilton 反相液相色谱柱 HxSil C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un）；乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相；检测波长为230nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按阿莫西林峰计算应不得低于2500。
2.2 供试品溶液的制备
取阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物适量，精密称取，置50mL棕色量瓶中，加流动相适量，超声处理提取5分钟，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
2.3 对照品溶液的制备
取105℃干燥5小时的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品适量，精密称取6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品约10mg，置50mL棕色容量瓶中，用加流动相超声溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林0.2mg）。
2.5 标准曲线的制备
制备浓度为50、100、150、200、250、300、350、400μg·mL-1的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品在50～400μg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照制备对照品溶液，精密吸取6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.86%，0.85%，0.86%，0.93%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批样品6份，分别依照2.2项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值为0.75%，0.81%，0.79%，0.85%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，30，60分钟精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林峰面积积分值的RSD为0.77%，0.76%，0.81%，0.85%。结果表明6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林至少在60分钟内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.5%，99.3%，99.5%，99.3%，RSD为0.86%，0.79%，0.81%，0.78%。
3 讨论
分别考察乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5），乙腈-30mmol·L-1碳酸氢铵水溶液（含有0.7%氨水、0.1%三乙胺）线性梯度洗脱，乙腈-水（46∶54），乙腈-水-三乙胺（30：70：0.1）；0.2%三乙胺溶液（用磷酸調p H至5.3）-乙腈（65∶35）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30：10：1：59）；不同比例的流动相，结果以乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相。
参考文献
[1]周晓溪，顾立素，逄涣欢，胡昌勤，冯芳.阿莫西林/克拉维酸钾原料及制剂中有关物质测定方法的比较[J].中国抗生素杂志，2005（12）.
[2]杨泽民，陈吉生，杜志昂，符玲海.反相高效液相色谱法同时测定阿莫维酸钾中阿莫西林和克拉维酸钾的含量[J].中国医院药学杂志，1999（09）.
[3]张珂.HPLC法测定阿莫西林克拉维酸钾颗粒的含量[J].药学进展，2007（05）.
[4]丁一冰，吴永淳，伊芳，王静，隋国福.HPLC法测定阿莫西林克拉维酸钾复方制剂的含量[J].黑龙江医药，1997（02）.
[5]王川平，任进民，孙倩，张晓青，徐智儒.RP-HPLC法同时测定人血清中阿莫西林、克拉维酸钾浓度[J].中国药师，2004（03）.