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摘要：植物细胞微管在细胞形态建成中具有重要作用。它体积小，且结构始终处于动态变化之中，因此观察到清晰的微管形态有一定的困难。本实验以水稻根尖为材料，介绍了一种改进的植物细胞微管免疫荧光组织化学染色方法，用此方法可以观察到清晰、完整的植物微管形态，此法对观察其它植物细胞微管结构也具有指导作用。
关键词：植物细胞；微管；水稻根尖；免疫荧光组织化学染色
中图分类号：S511；Q245 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2010)04－0040－04
1963年，Ledbetter、Poter和slautterback几乎同时分别在植物和动物细胞的超薄切片中发现细胞质中存在一种超微结构，该结构就是细胞骨架之一——微管。从微管被发现并被确认后，它一直是细胞生物学研究的热点。然而，植物细胞微管体积较小，其外径仅3～12 mm，且构成微管的微管蛋白始终处于动态变化之中，因此观察到清晰而又完整的微管形态成为这一研究领域的难题。本实验以水稻根尖为材料，通过免疫荧光的方法，应用共聚焦显微镜对微管结构进行观察，并在传统的免疫荧光制片方法的基础上对样品酶解和压片等步骤进行了改进，最终观察到形态清晰、结构比较完整的微管。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻“中花11”(Oryza sativa L cv.Zhonghua11)在人工气候箱培养，采用水培方法，生长的光暗周期为16h(光照)/8h(黑暗)，生长温度为(30±0.5)℃，相对湿度为70％。待水稻幼苗长出5d后，取初生根根尖部位进行微管结构观察。
1.2 主要试剂
免疫荧光实验中用到的主要试剂为纤维素酶、果胶酶和β－微管蛋白一抗(马抗小鼠，产品货号：19026)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(产品货号：F0257)，均购自Sigma公司(Mis，souri，USA)。其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.3 材料处理及应用共聚焦显微镜对微管结构的观察
1.3.1 取样及固定用解剖刀切下水稻根尖约5 mm，将其放入含有1.5％多聚甲醛的PEMT缓冲液(50 mmol/L PIPES、5 mnM/L EGTA、5 mmol/LMgSO4、O.05％(V/V)Triton X-100，pH 7.2)中固定1 h，用PEMT缓冲液洗涤3次，每次10 min。
1.3.2 酶解传统方法：用含有0.5％(W/V)果胶酶和lI 5％(W/V)纤维素酶的PEM缓冲液(50mmol/L PIPES、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgSO4，pH 7.2)37℃条件下酶解70 min；改进后：用含有0.5％(W/V)果胶酶和1％(W/V)纤维素酶的PEM缓冲液37℃条件下酶解1 h，用PEM缓冲液洗涤3次，每次10 min。
1.3.3 压片传统方法：把处理好的材料放到载玻片上，并用镊子弄碎，盖上盖玻片。改进后：将根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的盖玻片上，将两张盖玻片交错相叠，夹在滤纸中间，压片，弄好后要室温干燥5 min。
1.3.4 孵育以含有50 mmol/L GIy的PBS溶液(16 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L NaH2POd、150mmol/L NaCl，pH 7.2)处理材料30 min。
1.3.5 抗体标记材料加入到一抗(a－tubulin抗体1：600)中，4℃反应过夜，用PBS洗涤3次，每次10 min，之后加入二抗(1：200)，孵育3 h然后用PBS洗涤3次，每次10 min。
1.3.6 封片 将处理好的材料置于含有0.1％(W/V)间苯二胺的PBS一甘油(1：1，pH 9.0)的防荧光淬灭的载玻片上，以盖玻片压好封片。
1.3.7 观察用激光扫描共聚焦显微镜观察、采集图像。FITC所带的绿色荧光激发波长为488nln，用Carl Zeiss LSM META 510激光扫描共聚焦显微镜观察，激发波长范围为595～530 nm，以40倍油镜(Plan－APOCHROMAT，NA1.3)采集数据。图像存储为1024×1024像素类型，ZOOM设为1.0，用26％的激发光强度扫描。采集到的微管图像用Photoshop 6.0进行处理。
2 结果与分析
应用传统方法与改进方法对水稻根尖细胞内的微管结构进行了观察，结果如图1。图1－a显示，在酶解70 min的情况下，用含1.5％纤维素酶的酶解液酶解，很容易破坏细胞形态，进而破坏微管完整性，导致观察到错误结果。经过反复地摸索和不断尝试，最终发现1.0％纤维素酶加0.5％果胶酶最适于水稻5～10 d的根尖细胞内微管结构的固定及观察，并且酶解时间要根据水稻根的生长时间而定，萌发5 d幼苗所需最佳酶解时间为1 h。这个处理时间既能够充分保证细胞壁的酶解，又不破坏细胞形态，如同时加入0.4 mol/L露醇，则酶解溶液的渗透势与细胞内的渗透势相近，更有利于酶解后细胞形态完整性的保持(图1－b)。
显微观察过程中，如果要在共聚焦激光显微镜下得到清楚的图像，就必须尽可能地使所观察物处于同一个聚焦平面上，即如果观察细胞内结构，则用单细胞层观察的效果比较好。所以应用传统的压片方法时，不同细胞层之间的相互干扰比较严重，很难看到单细胞层及细胞内的超微结构，且抗体反应也不明显，特异性不强，看不到清晰的微管结构(图1－c)。我们将压片方法进行了改进，即将根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的盖玻片上，将两张盖玻片交错相叠，夹在滤纸中间进行压片，并将压好后的片子于室温下干燥5 min后再加入抗体进行免疫。这样做既保证了抗体与细胞间的充分接触，对材料的机械伤害也较小，最终获得了比较好的观察效果(图1－d)。
通过摸索和试验，我们最终总结出一套适合于观察水稻根尖部细胞内微管形态的免疫荧光组织染色方法，利用该方法制备的样品，细胞内微管形态完整，图像清晰，观察效果较好。可清晰地看到经抗体免疫后呈垂直于细胞壁方向排列的微管结构(图2)。
3 讨论与结论
水稻是广泛应用于植物生物学及相关研究领域的模式植物，对其根部细胞骨架动态变化的观察及研究，不仅可阐明水稻根部发育的细胞学机制，对研究其它植物根部发育也具有指导作用。同时，水稻根部的结构较简单，叶绿素含量少，因此可以作为观察微管形态的理想材料。以往对水稻根部细胞骨架结构的观察主要通过显微观察、电镜切片及冰冻蚀刻等方法，但这些方法存在操作复杂、目的性差、图片清晰度不高等不足，难以满足试验的要求。随研究手段的不断提高，目前认为，观察微管形态的最好方法之一是免疫荧光组织化学染色法。
本实验结果表明，应用传统方法获得的水稻根尖部细胞内微管形态结构的图像整体比较模糊，结构不清晰，不能用来说明问题。免疫荧光组织化学制片过程中，酶解是关键步骤之一，如果酶解时间不够，则与微管相免疫的抗体就无法充分进入细胞内，最终无法观察到微管的形态；如果酶解时间过长或酶解程度过高，如应用1.5％纤维素酶酶解，则会破坏细胞形态，从而破坏微管结构，导致实验失败。本实验将酶解方法进行了改进，取得了较好的效果。同时，我们还对压片的方法进行了改进。传统方法中，压片不彻底，导致细胞层间相互干扰，抗体免疫专一性差。改进后，我们将水稻根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的盖玻片上进行压片，之后再加入抗体，在保证抗体与细胞充分接触的条件下保证了细胞结构的完整，对微管的显微观察效果也比较好。
微管是细胞骨架的重要组成成分，在植物生长发育过程中具有重要的生理功能。随着人们对其研究越来越深入，其在维持细胞形态、染色体迁移、细胞有丝分裂、细胞壁构建和信号传导等中的作用也越来越受到重视。目前，荧光免疫技术和分子生物学的发展使得进一步从组织、细胞和分子水平上揭示它的结构和功能成为了可能。而在显微水平上对细胞内骨架结构的制样及观察可为该方面研究的深入提供技术保证。在显微结构的静态观察成为可能后，如何实现对微管解聚和聚合这一动态过程的活体观察，了解与之相关的胞内信息传递及所传递信号如何影响生物体的生长发育，将是进一步工作中亟待解决并阐明的问题。
关键词：植物细胞；微管；水稻根尖；免疫荧光组织化学染色
中图分类号：S511；Q245 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2010)04－0040－04
1963年，Ledbetter、Poter和slautterback几乎同时分别在植物和动物细胞的超薄切片中发现细胞质中存在一种超微结构，该结构就是细胞骨架之一——微管。从微管被发现并被确认后，它一直是细胞生物学研究的热点。然而，植物细胞微管体积较小，其外径仅3～12 mm，且构成微管的微管蛋白始终处于动态变化之中，因此观察到清晰而又完整的微管形态成为这一研究领域的难题。本实验以水稻根尖为材料，通过免疫荧光的方法，应用共聚焦显微镜对微管结构进行观察，并在传统的免疫荧光制片方法的基础上对样品酶解和压片等步骤进行了改进，最终观察到形态清晰、结构比较完整的微管。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻“中花11”(Oryza sativa L cv.Zhonghua11)在人工气候箱培养，采用水培方法，生长的光暗周期为16h(光照)/8h(黑暗)，生长温度为(30±0.5)℃，相对湿度为70％。待水稻幼苗长出5d后，取初生根根尖部位进行微管结构观察。
1.2 主要试剂
免疫荧光实验中用到的主要试剂为纤维素酶、果胶酶和β－微管蛋白一抗(马抗小鼠，产品货号：19026)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(产品货号：F0257)，均购自Sigma公司(Mis，souri，USA)。其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.3 材料处理及应用共聚焦显微镜对微管结构的观察
1.3.1 取样及固定用解剖刀切下水稻根尖约5 mm，将其放入含有1.5％多聚甲醛的PEMT缓冲液(50 mmol/L PIPES、5 mnM/L EGTA、5 mmol/LMgSO4、O.05％(V/V)Triton X-100，pH 7.2)中固定1 h，用PEMT缓冲液洗涤3次，每次10 min。
1.3.2 酶解传统方法：用含有0.5％(W/V)果胶酶和lI 5％(W/V)纤维素酶的PEM缓冲液(50mmol/L PIPES、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgSO4，pH 7.2)37℃条件下酶解70 min；改进后：用含有0.5％(W/V)果胶酶和1％(W/V)纤维素酶的PEM缓冲液37℃条件下酶解1 h，用PEM缓冲液洗涤3次，每次10 min。
1.3.3 压片传统方法：把处理好的材料放到载玻片上，并用镊子弄碎，盖上盖玻片。改进后：将根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的盖玻片上，将两张盖玻片交错相叠，夹在滤纸中间，压片，弄好后要室温干燥5 min。
1.3.4 孵育以含有50 mmol/L GIy的PBS溶液(16 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L NaH2POd、150mmol/L NaCl，pH 7.2)处理材料30 min。
1.3.5 抗体标记材料加入到一抗(a－tubulin抗体1：600)中，4℃反应过夜，用PBS洗涤3次，每次10 min，之后加入二抗(1：200)，孵育3 h然后用PBS洗涤3次，每次10 min。
1.3.6 封片 将处理好的材料置于含有0.1％(W/V)间苯二胺的PBS一甘油(1：1，pH 9.0)的防荧光淬灭的载玻片上，以盖玻片压好封片。
1.3.7 观察用激光扫描共聚焦显微镜观察、采集图像。FITC所带的绿色荧光激发波长为488nln，用Carl Zeiss LSM META 510激光扫描共聚焦显微镜观察，激发波长范围为595～530 nm，以40倍油镜(Plan－APOCHROMAT，NA1.3)采集数据。图像存储为1024×1024像素类型，ZOOM设为1.0，用26％的激发光强度扫描。采集到的微管图像用Photoshop 6.0进行处理。
2 结果与分析
应用传统方法与改进方法对水稻根尖细胞内的微管结构进行了观察，结果如图1。图1－a显示，在酶解70 min的情况下，用含1.5％纤维素酶的酶解液酶解，很容易破坏细胞形态，进而破坏微管完整性，导致观察到错误结果。经过反复地摸索和不断尝试，最终发现1.0％纤维素酶加0.5％果胶酶最适于水稻5～10 d的根尖细胞内微管结构的固定及观察，并且酶解时间要根据水稻根的生长时间而定，萌发5 d幼苗所需最佳酶解时间为1 h。这个处理时间既能够充分保证细胞壁的酶解，又不破坏细胞形态，如同时加入0.4 mol/L露醇，则酶解溶液的渗透势与细胞内的渗透势相近，更有利于酶解后细胞形态完整性的保持(图1－b)。
显微观察过程中，如果要在共聚焦激光显微镜下得到清楚的图像，就必须尽可能地使所观察物处于同一个聚焦平面上，即如果观察细胞内结构，则用单细胞层观察的效果比较好。所以应用传统的压片方法时，不同细胞层之间的相互干扰比较严重，很难看到单细胞层及细胞内的超微结构，且抗体反应也不明显，特异性不强，看不到清晰的微管结构(图1－c)。我们将压片方法进行了改进，即将根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的盖玻片上，将两张盖玻片交错相叠，夹在滤纸中间进行压片，并将压好后的片子于室温下干燥5 min后再加入抗体进行免疫。这样做既保证了抗体与细胞间的充分接触，对材料的机械伤害也较小，最终获得了比较好的观察效果(图1－d)。
通过摸索和试验，我们最终总结出一套适合于观察水稻根尖部细胞内微管形态的免疫荧光组织染色方法，利用该方法制备的样品，细胞内微管形态完整，图像清晰，观察效果较好。可清晰地看到经抗体免疫后呈垂直于细胞壁方向排列的微管结构(图2)。
3 讨论与结论
水稻是广泛应用于植物生物学及相关研究领域的模式植物，对其根部细胞骨架动态变化的观察及研究，不仅可阐明水稻根部发育的细胞学机制，对研究其它植物根部发育也具有指导作用。同时，水稻根部的结构较简单，叶绿素含量少，因此可以作为观察微管形态的理想材料。以往对水稻根部细胞骨架结构的观察主要通过显微观察、电镜切片及冰冻蚀刻等方法，但这些方法存在操作复杂、目的性差、图片清晰度不高等不足，难以满足试验的要求。随研究手段的不断提高，目前认为，观察微管形态的最好方法之一是免疫荧光组织化学染色法。
本实验结果表明，应用传统方法获得的水稻根尖部细胞内微管形态结构的图像整体比较模糊，结构不清晰，不能用来说明问题。免疫荧光组织化学制片过程中，酶解是关键步骤之一，如果酶解时间不够，则与微管相免疫的抗体就无法充分进入细胞内，最终无法观察到微管的形态；如果酶解时间过长或酶解程度过高，如应用1.5％纤维素酶酶解，则会破坏细胞形态，从而破坏微管结构，导致实验失败。本实验将酶解方法进行了改进，取得了较好的效果。同时，我们还对压片的方法进行了改进。传统方法中，压片不彻底，导致细胞层间相互干扰，抗体免疫专一性差。改进后，我们将水稻根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的盖玻片上进行压片，之后再加入抗体，在保证抗体与细胞充分接触的条件下保证了细胞结构的完整，对微管的显微观察效果也比较好。
微管是细胞骨架的重要组成成分，在植物生长发育过程中具有重要的生理功能。随着人们对其研究越来越深入，其在维持细胞形态、染色体迁移、细胞有丝分裂、细胞壁构建和信号传导等中的作用也越来越受到重视。目前，荧光免疫技术和分子生物学的发展使得进一步从组织、细胞和分子水平上揭示它的结构和功能成为了可能。而在显微水平上对细胞内骨架结构的制样及观察可为该方面研究的深入提供技术保证。在显微结构的静态观察成为可能后，如何实现对微管解聚和聚合这一动态过程的活体观察，了解与之相关的胞内信息传递及所传递信号如何影响生物体的生长发育，将是进一步工作中亟待解决并阐明的问题。