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摘 要 以康乃馨無菌苗为实验材料，以MS为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂NAA、6-BA，设不同的pH值，进行3因素4水平的正交设计实验，筛选康乃馨增殖的最佳培养条件；以1/2 MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂NAA、6-BA、GA3，设置不同的光照时间，进行4因素4水平的正交设计实验，筛选诱导康乃馨试管开花的最佳培养条件，建立无菌苗快速繁殖试管诱导开花体系。结果表明，康乃馨增殖的最佳培养条件为MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，pH6.2，增殖倍数达到11倍。诱导无菌苗试管开花的最佳培养条件为1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，培养温度20 ℃，开花率可达87%，单株花朵开花持续时间长可达16 d，光照时间对开花率影响不大，但总体来说光照时间长于12 h，有利于开花。
关键词 康乃馨；正交设计；组织培养；增殖；试管开花
中图分类号 Q813.1 文献标识码 A
An Orthogonal Design Study of Proliferation and Flowering
in vitro of Dianthus caryophyllus L.
CHEN Yulu1， PENG Jieping1 *， LIU Fang1， KUANG Ding3， TANG Yinghong1， 2，
YUAN Youmei1， 2， MAO Kaiquan1， CHEN Jianrong1 **
1 School of Biological Engineering and Environmental Sciences， Changsha University， Changsha， Hunan 410022， China
2 School of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China
3 Hunan Hi-tech Bio-Agro co.， Ltd. / National-local Joint Engineering Laboratory of Forestry Genetic Improved Seeds
in the Dongting Wetland， Yueyang， Hunan 414418， China
Abstract The method of rapid proliferation and in vitro flowering of D. caryophyllus L. were studied by an orthogonal design. The aseptic seedlings of D. caryophyllus L. were used as the materials. MS was used as the basic medium with different concentration of NAA and 6-BA under different pH values by an orthogonal experiment for four factors at three levels to determine the optimal condition to induce rapid proliferation of D. caryophyllus L. Meanwhile， 1/2 MS was used as the basic medium with different concentration of NAA， 6-BA， GA3 under different light time by an orthogonal experiment for four factors at four levels to determine the optimal condition to induce flowering in vitro of D. caryophyllus L. Then the optimum culture condition was established to induce the rapid proliferation and flowering in vitro of the aseptic seedling. These results showed that the optimal culture condition for inducing proliferation of D. caryophyllus L. was MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA， pH6.2， and the multiplication rate was 11 times. According to the orthogonal experiment results， the optimized culture condition for flowering in vitro was 1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA at 20 ℃， the flowering rate in vitro was 87%， and the flowering duration was 16 days. The time of lighting had little effect on the flowering rate in vitro， but in general no less than 12 hours of light time was propitious to the flowers developing. Key words Dianthus caryophyllus L.； orthogonal design； tissue culture； rapid propagation； in vitro flowering
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.10.022
康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）又名香石竹，麝香石竹，为石竹科石竹属多年生草本植物，是世界各国广为栽培的重要切花植物之一[1]。人们对室内栽培花卉的要求日趋多样化，小型化、易养护、安全的花卉倍受喜爱。
试管开花是指用组织培养的方法，使植物的开花过程在培养容器中完成。开花是植物发育过程中重要的阶段，国内外已有多种植物试管开花的报道[2]。由于试管内开花不受季节限制，对缩短育种周期，降低栽培设施的投入和生产管理费用都具有重要的意义[3-4]，并且人们普遍喜爱试管康乃馨花卉的玲珑小巧，有亲切之感，还因其无须水肥管理、观赏时间长，更受都市人青睐，同时，试管康乃馨花卉处于封闭空间内，可以避免花粉过敏，以满足花粉过敏者对花的喜爱之情。所以生产试管康乃馨花卉也为人们日益增长的鲜花要求开辟了广阔的市场前景。目前， 试管苗主要作为种苗、科学研究材料和种质资源之用， 而用于制作观赏性的试管花卉的报道较少[5]。本研究旨在利用正交试验设计方法[6-7]，在康乃馨组织培养的基础上，进行无菌苗的快速繁殖和试管开花诱导研究，对迅速发展试管康乃馨花卉生产工艺并使试管康乃馨花卉产业向专业化、规模化、产业化发展具有重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料
选取长势良好的康乃馨无菌苗（来源于长沙学院生物与环境工程学院植物资源与应用研究室）为实验材料。
1.2 方法
1.2.1 基本培养条件 以MS为基本培养基，培养基中均添加30 g/L蔗糖和8 g/L琼脂，pH6.0～6.5，光照强度1 600～2 000 lx。
1.2.2 无菌苗快速增殖 以MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂NAA、6-BA及不同pH值的培养基，采用正交实验方法，对各因素进行4水平实验筛选（表1），共设置16种处理组。将长势良好，大小相同的无菌植株接种于上述培养基。每瓶接种1株，每一个处理组设5次重复，每个处理接种的瓶数为5瓶。接种后置于25 ℃环境下，光照10～12 h。30 d后统计增殖倍数。
1.2.3 无菌苗试管诱导开花 以1/2 MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂NAA、 6-BA、GA3及不同光照时间4个因素应用正交实验法进行4水平实验筛选（表2），共设置16种处理组。将长势良好、叶绿茎粗的无菌植株接种于上述培养基。每瓶接种2株，每一个处理组设5次重复，每个处理接种的瓶数为5瓶。接种后置于20 ℃环境下培养。50 d后统计开花率。
1.3 统计分析
增殖倍数=增殖后的总株数/接种的无菌苗株数；开花率=（开花株数/接种有效株数）×100%。
该实验均用正交设计助手软件及SPSS 19.0数据统计软件设计并进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 不同因素对康乃馨无菌苗快速增殖的影响
由表3可知，在设定的16种处理组中，以处理13（A4B1C3）的增殖效果最好，平均增殖倍数可以达到11倍；且培养30 d后，叶片呈深绿色，增殖植株较为健壮。不同因素对康乃馨无菌苗增殖的结果显示，各因素的最优水平分别为：A4、B1和C3，即0.5 mg/L NAA，0.3 mg/L 6-BA和pH6.2。但根据正交设计的特点，此处理不能作为最优配比的选择，需参照康乃馨無菌苗增殖倍数正交试验直观分析表（表4）和方差分析表（表5）。结果表明影响康乃馨无菌苗增殖因素的主次顺序为A>B>C，即 NAA>6-BA>pH，各因素的最优水平分别为：A4、B4和C3，即0.5 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA和pH6.2。
NAA可促进芽增殖，在一定浓度范围内，随着NAA浓度的增大，增殖倍数在相应增加。6-BA也对芽增殖有促进作用，低浓度的6-BA（0.3 mg/L图1-A）和高浓度6-BA（2 mg/L 图1-B）均能促进无菌苗增殖。因此，通过比较并结合正交实验的优先选择原则及其分析结果，得出本实验3种因素最佳为A4B4C3，即MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，pH6.2。
2.2 不同因素对康乃馨无菌苗开花的影响
由表6可知，在设定的16种处理中，以处理13（D4E1F4G2）的开花效果最好，平均开花率可以达到87%；培养30 d后长出花苞，植株长势良好，叶片呈深绿色（图1-C）。且培养50 d后，叶片呈黄绿色，植株较为健壮，花朵较大，花色鲜艳（图1-D），部分实验组单株花朵开花持续时间较长。不同因素对康乃馨无菌苗开花的结果显示，各因素的最优水平分别为：D4、E1、F4、G2，即4 mg/L GA3，0.5 mg/L 6-BA，1 mg/L NAA，光照时间为12 h。但根据正交设计的特点，此处理不能作为最优配比的选择，需参照康乃馨无菌苗开花率正交试验直观分析表（表7）方差分析表（表8）。结果表明影响康乃馨无菌苗开花因素的主次顺序为D>F>E>G，即GA3> NAA>6-BA>光照时间，各因素的最优水平分别为：D4、E1、F3、G4，即4 mg/L GA3，0.5 mg/L 6-BA，0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h。
GA3可诱导无菌苗开花，在一定浓度范围内，随着GA3浓度的增大，开花率在逐渐增加，当浓度达到4 mg/L 时，开花率增加趋势减缓。NAA也对康乃馨开花有促进作用，低浓度的NAA促进开花效果不明显，并随NAA浓度增大，开花率增加，至浓度达到0.6 mg/L NAA后，NAA浓度增大而开花率维持在一定范围内不再增加。过高浓度的6-BA（2 mg/L）对康乃馨有一定的抑制作用。康乃馨无菌苗开花对光照时间敏感度不高，但长于12 h的光照时间有利于康乃馨开花。因此，通过比较并结合正交实验的优先选择原则及其分析结果，得出本实验4种因素最佳配比为D4E1F3G4，即1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h。 2.3 验证试验
选取长势良好的康乃馨无菌苗数棵，按最佳增殖条件MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，pH6.2进行3批验证试验，根据试验结果统计，康乃馨无菌苗增殖倍数为（10±2）倍，接近正交试验方案中的最高值，最佳增殖条件可行。
选取长势良好的康乃馨无菌苗数棵，按最佳开花条件1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h，进行3批验证试验，根据试验结果统计，康乃馨开花率为（85±5）%，接近正交试验方案中的最高值，最佳试管开花条件可行。
3 讨论
国内已有将正交设计实验法应用于植物组织培养的报道[8-12]。相关作者一致认为， 正交设计法是选择最佳实验方案的十分有效的工具， 其优越性在于能省时省力，但是正交设计在康乃馨组织培养增殖和试管开花的应用在国内外均鲜见报道。
大多数植物增殖的最佳组织培养配方均通过调节植物激素的浓度，基本培养基配方及生长环境来研究[13-15]。本实验中通过调节NAA、6-BA，设不同的pH值来进行研究获得了最适的康乃馨快速繁殖培养方案。
本实验已得到无菌苗试管开花最适培养方案，由于半量培养基有利于试管开花[16]，本实验开花培养方案启动培养基为1/2 MS培养基。本实验结果表明康乃馨试管开花对光照时间不敏感，李双跃等[16]也研究出香石竹对光周期表现不敏感，不能通过改变光周期来提高开花率，因此对于此种植物应采用改变其他影响因子来改善其试管开花水平和质量。许多研究者选择植物生长调节剂来诱导试管开花。有研究表明低浓度IBA对试管开花没有明显的影响，但较高浓度则抑制花的形成；BAP只促进营养芽的分化，完全抑制试管花的形成[17]。植物生长调节剂0.5 mg/L KT、0.5 mg/L IAA的浓度配比较好的促进试管苗开花[16]。并且0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的浓度配比和提高培养基中蔗糖浓度均能对诱导试管开花起较大作用[18]。本实验得出的最佳试管开花培养方案为1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h，且由结果表明在一定浓度内，随NAA浓度增加，诱导开花效果越好。其相对于前人新研究出GA3对诱导试管开花有一定的促进作用，相对于房丽晶[18]的研究方案，本研究得出的方案开花率更高，可达87%。同时，采用已得出最佳增殖条件和最佳开花条件对本次研究方案进行验证试验，验证了本次研究方案的稳定性，可使康乃馨增殖倍数稳定控制在8～12倍，开花率可稳定控制在80%～90%。此验证试验证明本次研究结果可行，能通过控制试管苗培养条件调控康乃馨试管开花。本次研究中实验组康乃馨单株花朵开花持续时间比康乃馨单株花朵在自然环境中自然开花持续时间有所延长，可为进一步研究影响康乃馨单株花朵开花持续时间的因素提供思路。
在本实验的结果基础上还可通过添加营养剂，改变培养中成分和各元素N、P、K比例，诱导开花分子机理或改变其他影响因子对康乃馨试管开花率和花期延长进行深入研究[19-26]。
参考文献
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关键词 康乃馨；正交设计；组织培养；增殖；试管开花
中图分类号 Q813.1 文献标识码 A
An Orthogonal Design Study of Proliferation and Flowering
in vitro of Dianthus caryophyllus L.
CHEN Yulu1， PENG Jieping1 *， LIU Fang1， KUANG Ding3， TANG Yinghong1， 2，
YUAN Youmei1， 2， MAO Kaiquan1， CHEN Jianrong1 **
1 School of Biological Engineering and Environmental Sciences， Changsha University， Changsha， Hunan 410022， China
2 School of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China
3 Hunan Hi-tech Bio-Agro co.， Ltd. / National-local Joint Engineering Laboratory of Forestry Genetic Improved Seeds
in the Dongting Wetland， Yueyang， Hunan 414418， China
Abstract The method of rapid proliferation and in vitro flowering of D. caryophyllus L. were studied by an orthogonal design. The aseptic seedlings of D. caryophyllus L. were used as the materials. MS was used as the basic medium with different concentration of NAA and 6-BA under different pH values by an orthogonal experiment for four factors at three levels to determine the optimal condition to induce rapid proliferation of D. caryophyllus L. Meanwhile， 1/2 MS was used as the basic medium with different concentration of NAA， 6-BA， GA3 under different light time by an orthogonal experiment for four factors at four levels to determine the optimal condition to induce flowering in vitro of D. caryophyllus L. Then the optimum culture condition was established to induce the rapid proliferation and flowering in vitro of the aseptic seedling. These results showed that the optimal culture condition for inducing proliferation of D. caryophyllus L. was MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA， pH6.2， and the multiplication rate was 11 times. According to the orthogonal experiment results， the optimized culture condition for flowering in vitro was 1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA at 20 ℃， the flowering rate in vitro was 87%， and the flowering duration was 16 days. The time of lighting had little effect on the flowering rate in vitro， but in general no less than 12 hours of light time was propitious to the flowers developing. Key words Dianthus caryophyllus L.； orthogonal design； tissue culture； rapid propagation； in vitro flowering
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.10.022
康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）又名香石竹，麝香石竹，为石竹科石竹属多年生草本植物，是世界各国广为栽培的重要切花植物之一[1]。人们对室内栽培花卉的要求日趋多样化，小型化、易养护、安全的花卉倍受喜爱。
试管开花是指用组织培养的方法，使植物的开花过程在培养容器中完成。开花是植物发育过程中重要的阶段，国内外已有多种植物试管开花的报道[2]。由于试管内开花不受季节限制，对缩短育种周期，降低栽培设施的投入和生产管理费用都具有重要的意义[3-4]，并且人们普遍喜爱试管康乃馨花卉的玲珑小巧，有亲切之感，还因其无须水肥管理、观赏时间长，更受都市人青睐，同时，试管康乃馨花卉处于封闭空间内，可以避免花粉过敏，以满足花粉过敏者对花的喜爱之情。所以生产试管康乃馨花卉也为人们日益增长的鲜花要求开辟了广阔的市场前景。目前， 试管苗主要作为种苗、科学研究材料和种质资源之用， 而用于制作观赏性的试管花卉的报道较少[5]。本研究旨在利用正交试验设计方法[6-7]，在康乃馨组织培养的基础上，进行无菌苗的快速繁殖和试管开花诱导研究，对迅速发展试管康乃馨花卉生产工艺并使试管康乃馨花卉产业向专业化、规模化、产业化发展具有重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料
选取长势良好的康乃馨无菌苗（来源于长沙学院生物与环境工程学院植物资源与应用研究室）为实验材料。
1.2 方法
1.2.1 基本培养条件 以MS为基本培养基，培养基中均添加30 g/L蔗糖和8 g/L琼脂，pH6.0～6.5，光照强度1 600～2 000 lx。
1.2.2 无菌苗快速增殖 以MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂NAA、6-BA及不同pH值的培养基，采用正交实验方法，对各因素进行4水平实验筛选（表1），共设置16种处理组。将长势良好，大小相同的无菌植株接种于上述培养基。每瓶接种1株，每一个处理组设5次重复，每个处理接种的瓶数为5瓶。接种后置于25 ℃环境下，光照10～12 h。30 d后统计增殖倍数。
1.2.3 无菌苗试管诱导开花 以1/2 MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂NAA、 6-BA、GA3及不同光照时间4个因素应用正交实验法进行4水平实验筛选（表2），共设置16种处理组。将长势良好、叶绿茎粗的无菌植株接种于上述培养基。每瓶接种2株，每一个处理组设5次重复，每个处理接种的瓶数为5瓶。接种后置于20 ℃环境下培养。50 d后统计开花率。
1.3 统计分析
增殖倍数=增殖后的总株数/接种的无菌苗株数；开花率=（开花株数/接种有效株数）×100%。
该实验均用正交设计助手软件及SPSS 19.0数据统计软件设计并进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 不同因素对康乃馨无菌苗快速增殖的影响
由表3可知，在设定的16种处理组中，以处理13（A4B1C3）的增殖效果最好，平均增殖倍数可以达到11倍；且培养30 d后，叶片呈深绿色，增殖植株较为健壮。不同因素对康乃馨无菌苗增殖的结果显示，各因素的最优水平分别为：A4、B1和C3，即0.5 mg/L NAA，0.3 mg/L 6-BA和pH6.2。但根据正交设计的特点，此处理不能作为最优配比的选择，需参照康乃馨無菌苗增殖倍数正交试验直观分析表（表4）和方差分析表（表5）。结果表明影响康乃馨无菌苗增殖因素的主次顺序为A>B>C，即 NAA>6-BA>pH，各因素的最优水平分别为：A4、B4和C3，即0.5 mg/L NAA，2 mg/L 6-BA和pH6.2。
NAA可促进芽增殖，在一定浓度范围内，随着NAA浓度的增大，增殖倍数在相应增加。6-BA也对芽增殖有促进作用，低浓度的6-BA（0.3 mg/L图1-A）和高浓度6-BA（2 mg/L 图1-B）均能促进无菌苗增殖。因此，通过比较并结合正交实验的优先选择原则及其分析结果，得出本实验3种因素最佳为A4B4C3，即MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，pH6.2。
2.2 不同因素对康乃馨无菌苗开花的影响
由表6可知，在设定的16种处理中，以处理13（D4E1F4G2）的开花效果最好，平均开花率可以达到87%；培养30 d后长出花苞，植株长势良好，叶片呈深绿色（图1-C）。且培养50 d后，叶片呈黄绿色，植株较为健壮，花朵较大，花色鲜艳（图1-D），部分实验组单株花朵开花持续时间较长。不同因素对康乃馨无菌苗开花的结果显示，各因素的最优水平分别为：D4、E1、F4、G2，即4 mg/L GA3，0.5 mg/L 6-BA，1 mg/L NAA，光照时间为12 h。但根据正交设计的特点，此处理不能作为最优配比的选择，需参照康乃馨无菌苗开花率正交试验直观分析表（表7）方差分析表（表8）。结果表明影响康乃馨无菌苗开花因素的主次顺序为D>F>E>G，即GA3> NAA>6-BA>光照时间，各因素的最优水平分别为：D4、E1、F3、G4，即4 mg/L GA3，0.5 mg/L 6-BA，0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h。
GA3可诱导无菌苗开花，在一定浓度范围内，随着GA3浓度的增大，开花率在逐渐增加，当浓度达到4 mg/L 时，开花率增加趋势减缓。NAA也对康乃馨开花有促进作用，低浓度的NAA促进开花效果不明显，并随NAA浓度增大，开花率增加，至浓度达到0.6 mg/L NAA后，NAA浓度增大而开花率维持在一定范围内不再增加。过高浓度的6-BA（2 mg/L）对康乃馨有一定的抑制作用。康乃馨无菌苗开花对光照时间敏感度不高，但长于12 h的光照时间有利于康乃馨开花。因此，通过比较并结合正交实验的优先选择原则及其分析结果，得出本实验4种因素最佳配比为D4E1F3G4，即1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h。 2.3 验证试验
选取长势良好的康乃馨无菌苗数棵，按最佳增殖条件MS+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，pH6.2进行3批验证试验，根据试验结果统计，康乃馨无菌苗增殖倍数为（10±2）倍，接近正交试验方案中的最高值，最佳增殖条件可行。
选取长势良好的康乃馨无菌苗数棵，按最佳开花条件1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h，进行3批验证试验，根据试验结果统计，康乃馨开花率为（85±5）%，接近正交试验方案中的最高值，最佳试管开花条件可行。
3 讨论
国内已有将正交设计实验法应用于植物组织培养的报道[8-12]。相关作者一致认为， 正交设计法是选择最佳实验方案的十分有效的工具， 其优越性在于能省时省力，但是正交设计在康乃馨组织培养增殖和试管开花的应用在国内外均鲜见报道。
大多数植物增殖的最佳组织培养配方均通过调节植物激素的浓度，基本培养基配方及生长环境来研究[13-15]。本实验中通过调节NAA、6-BA，设不同的pH值来进行研究获得了最适的康乃馨快速繁殖培养方案。
本实验已得到无菌苗试管开花最适培养方案，由于半量培养基有利于试管开花[16]，本实验开花培养方案启动培养基为1/2 MS培养基。本实验结果表明康乃馨试管开花对光照时间不敏感，李双跃等[16]也研究出香石竹对光周期表现不敏感，不能通过改变光周期来提高开花率，因此对于此种植物应采用改变其他影响因子来改善其试管开花水平和质量。许多研究者选择植物生长调节剂来诱导试管开花。有研究表明低浓度IBA对试管开花没有明显的影响，但较高浓度则抑制花的形成；BAP只促进营养芽的分化，完全抑制试管花的形成[17]。植物生长调节剂0.5 mg/L KT、0.5 mg/L IAA的浓度配比较好的促进试管苗开花[16]。并且0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的浓度配比和提高培养基中蔗糖浓度均能对诱导试管开花起较大作用[18]。本实验得出的最佳试管开花培养方案为1/2 MS+4 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，光照时间为18 h，且由结果表明在一定浓度内，随NAA浓度增加，诱导开花效果越好。其相对于前人新研究出GA3对诱导试管开花有一定的促进作用，相对于房丽晶[18]的研究方案，本研究得出的方案开花率更高，可达87%。同时，采用已得出最佳增殖条件和最佳开花条件对本次研究方案进行验证试验，验证了本次研究方案的稳定性，可使康乃馨增殖倍数稳定控制在8～12倍，开花率可稳定控制在80%～90%。此验证试验证明本次研究结果可行，能通过控制试管苗培养条件调控康乃馨试管开花。本次研究中实验组康乃馨单株花朵开花持续时间比康乃馨单株花朵在自然环境中自然开花持续时间有所延长，可为进一步研究影响康乃馨单株花朵开花持续时间的因素提供思路。
在本实验的结果基础上还可通过添加营养剂，改变培养中成分和各元素N、P、K比例，诱导开花分子机理或改变其他影响因子对康乃馨试管开花率和花期延长进行深入研究[19-26]。
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