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【摘要】目的：分析茉莉酸甲酯（MJ）对栽培甘西鼠尾草叶丹参酮类成分含量的影响，为甘西鼠尾草的开发提供依据。方法：采用液-质联用的方法，对MJ处理的甘西鼠尾草叶样品进行检测。结果：甘西鼠尾草经MJ处理后的120h内丹参酮IIA的含量均高于对照组，丹参酮I的含量从120h开始高于对照组。结论：MJ能促进甘西鼠尾草叶中丹参酮I及丹参酮IIA含量的积累，可以考虑在人工种植中加以应用。
【关键词】茉莉酸甲酯；甘西鼠尾草；丹参酮
【中图分类号】R2822【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）03-0029-01
使用非生物诱导子茉莉酸甲酯对甘西鼠尾草进行处理，研究处理后0～240h内甘西鼠尾草叶片丹参酮I及丹参酮IIA的含量变化，旨在为今后在甘西鼠尾草种植过程中提高丹参酮类的含量提供实验依据。
1仪器及材料
11仪器人工气候室；Agilent 1100型系列高效液相色谱仪（G1312A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A DAD检测器以及色谱工作站，美国Agilent公司）；Agilent 1100 LC-ESI-TARP高效液相色谱-质谱联用仪（盘式自动进样器、柱温箱、DAD检测器、二元泵、在线脱气机以及Analyst MSD工作站，美国Agilent公司）；旋转薄膜蒸发仪（瑞士Büchi公司）；Sovall Evolution RC型高速离心机。
12材料甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim 种苗，采自青海省同仁县中藏药种植基地；茉莉酸甲酯（批号：P05202）购自美国Sigma公司。
2方法
21MJ的配制以无水乙醇为助溶剂，配制50%的母液。
22实验设计及处理设3个重复（并相应设立对照组）分别将幼苗移栽至人工气候室，待幼苗长出三片复叶时在叶片上均匀喷施MJ和蒸馏水，喷后立即套上保鲜袋，分别于MJ处理后0、12、24、48、120、240h后收获叶片材料，将叶片置于60℃烘箱烘干6h，取出粉碎，过50目筛后用棕色瓶保存。
23甘西鼠尾草丹参酮类成分的测定
231对照品溶液的制备称取2个丹参对照品适量，混合，用70%甲醇适量溶解，作为丹参对照品溶液，用于化合物对照确认。
232供试品溶液的制备取约30mg的药材粉末，置于11ml不锈钢管中，采用高压溶剂萃取（ASE）按以下条件提取：提取溶剂为100%甲醇；压力1500Pa；温度150℃；提取时间10min；置换体积60%；提取次数1次。提取液减压浓缩至10ml，加水定容至25ml。045μm滤膜过滤，续滤液保存于4℃冰箱用于HPLC分析。
233色谱分离条件色谱柱：Prevail C18 rocket column（33mm×7mm，30μm）；柱温30℃；检测波长280nm；进样量10μl；溶剂组成：20mM Ammonium Acetate（A），ACN（B）；流速：25ml/min。梯度洗脱：0～15min，5%～15%B；15～30min，15%～80%B，30～35min，80%～5%B，35～40min，5%～5%B。
234质谱检测条件质谱条件：雾化压力40Pa；干燥气流速10ml/min；干燥温度325℃；化合物稳定性（compound stability）10%；扫描范围100～800amu；0～15min，负离子检测；15～30min，正离子检测。
235线性关系及检测限取对照品混合溶液分别进样，色谱条件下分析，以各种化合物峰面积Y为纵坐标，化合物含量X为横坐标，得到线性回归方程如表1所示。在线性范围内，各种进样量对数值与峰面积的对数值呈现良好的线性关系。当信噪比为3时，测定各种化合物含量的检测限在0002～80mg/ml之间。
235精密度实验在“234”项色谱条件下，精密吸取对照品混合溶液10μl，连续进样6次，测定。峰面积的RSD在1%～4%，说明本法精密度良好。
236重现性实验取同一批样品按供试品溶液制备方法平行制备5份，分别进样10μl，测得峰面积的RSD在4%～5%。
237供试品溶液稳定性在“234”项色谱条件下，取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样5次，测得RSD在3%～5%，说明样品在24h内稳定。
238回收率实验按供试品溶液制备方法操作后，测定，计算，结果平均回收率为912%～1102%，RSD为3%～60%。
3结果
实验应用液质联用方法，测定了茉莉酸甲酯作用下0～240h内甘西鼠尾草中丹参酮I（Tanshinone I）、丹参酮IIA（Tanshinone IIA）成分的含量，本方法提取回收率均在912%～1102%之内，日内和日间精密度RSD均小于10%，最低检测限在0002～80 mg/ml，标准曲线在测量浓度范围内线性良好（r>099）。故此法具有较高的灵敏度和专属性，可用于复杂样品中上述成分的含量测定。
4讨论
茉莉酸甲酯是茉莉属素馨花中香精油的有气味化合物，也是茉莉中特殊香味的重要组成成分，它在其他植物中亦有广泛分布。研究发现它在植物细胞的多种逆境反应中起信号介导的作用，引起细胞抗逆反应产物的表达[1-2]。王学勇等[3]用茉莉酸甲酯诱导丹参毛状根，采用高效液相色谱法检测处理2d、6d、9d后丹参毛状根中隐丹参酮、丹参酮II A的含量以及其在培养基中的含量，结果表明茉莉酸甲酯能显著提高丹参酮类成分在丹参毛状根中的积累并刺激其向培养基中释放。李明等[4]对茉莉酸甲酯处理的丹参茎叶中丹酚酸和丹酚酸B含量进行检测，结果表明外施茉莉酸甲酯能促进甘西鼠尾草叶片中丹参酮类成分的积累。本实验对甘西鼠尾草幼苗喷施MJ，如图1所示，与对照组相比，甘西鼠尾草被MJ处理后，丹参酮IIA的含量从12h开始呈增长趋势，在处理后240h，其含量达到最高。丹参酮I的含量从120h开始呈增长趋势，在240h，其含量达到最高。在MJ处理240h，甘西鼠尾草中丹参酮IIA的含量是对照组的297倍，丹参酮I的含量达到对照组的63倍。由此可见，MJ可以显著提高甘西鼠尾草中丹参酮I及丹参酮IIA的含量，在甘西鼠尾草人工种植过程中，MJ可以考虑加以应用。
参考文献
[1] Parchmann S，Gundlach H，Mueller M J.Induction of 12-Oxo-phytodienoic acid in wounded plants and elicited plant cell cultures[J].Plant Physl，1997，115（3）：1057.
[2] Bohland C，Balkenhohl T，Loers G，et al.Differential induction of lipoxyfenase isoforms in wheat upon treatment with rust fungus elicitor， chitin oligosaccharides chitosan and methyl jasmonate[J].Plant Physl，1997，114（2）：679.
[3]王学勇.丹参毛状根基因诱导表达分析及其有效成分生物合成基因的克隆研究[D].北京：中国中医科学院，2007.
[4] 李明，冯世阳.茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量的影响[J].时珍国医国药，2009，20（8）：1921.
（收稿日期：20141028）
【关键词】茉莉酸甲酯；甘西鼠尾草；丹参酮
【中图分类号】R2822【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）03-0029-01
使用非生物诱导子茉莉酸甲酯对甘西鼠尾草进行处理，研究处理后0～240h内甘西鼠尾草叶片丹参酮I及丹参酮IIA的含量变化，旨在为今后在甘西鼠尾草种植过程中提高丹参酮类的含量提供实验依据。
1仪器及材料
11仪器人工气候室；Agilent 1100型系列高效液相色谱仪（G1312A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A DAD检测器以及色谱工作站，美国Agilent公司）；Agilent 1100 LC-ESI-TARP高效液相色谱-质谱联用仪（盘式自动进样器、柱温箱、DAD检测器、二元泵、在线脱气机以及Analyst MSD工作站，美国Agilent公司）；旋转薄膜蒸发仪（瑞士Büchi公司）；Sovall Evolution RC型高速离心机。
12材料甘西鼠尾草Salvia przewalskii Maxim 种苗，采自青海省同仁县中藏药种植基地；茉莉酸甲酯（批号：P05202）购自美国Sigma公司。
2方法
21MJ的配制以无水乙醇为助溶剂，配制50%的母液。
22实验设计及处理设3个重复（并相应设立对照组）分别将幼苗移栽至人工气候室，待幼苗长出三片复叶时在叶片上均匀喷施MJ和蒸馏水，喷后立即套上保鲜袋，分别于MJ处理后0、12、24、48、120、240h后收获叶片材料，将叶片置于60℃烘箱烘干6h，取出粉碎，过50目筛后用棕色瓶保存。
23甘西鼠尾草丹参酮类成分的测定
231对照品溶液的制备称取2个丹参对照品适量，混合，用70%甲醇适量溶解，作为丹参对照品溶液，用于化合物对照确认。
232供试品溶液的制备取约30mg的药材粉末，置于11ml不锈钢管中，采用高压溶剂萃取（ASE）按以下条件提取：提取溶剂为100%甲醇；压力1500Pa；温度150℃；提取时间10min；置换体积60%；提取次数1次。提取液减压浓缩至10ml，加水定容至25ml。045μm滤膜过滤，续滤液保存于4℃冰箱用于HPLC分析。
233色谱分离条件色谱柱：Prevail C18 rocket column（33mm×7mm，30μm）；柱温30℃；检测波长280nm；进样量10μl；溶剂组成：20mM Ammonium Acetate（A），ACN（B）；流速：25ml/min。梯度洗脱：0～15min，5%～15%B；15～30min，15%～80%B，30～35min，80%～5%B，35～40min，5%～5%B。
234质谱检测条件质谱条件：雾化压力40Pa；干燥气流速10ml/min；干燥温度325℃；化合物稳定性（compound stability）10%；扫描范围100～800amu；0～15min，负离子检测；15～30min，正离子检测。
235线性关系及检测限取对照品混合溶液分别进样，色谱条件下分析，以各种化合物峰面积Y为纵坐标，化合物含量X为横坐标，得到线性回归方程如表1所示。在线性范围内，各种进样量对数值与峰面积的对数值呈现良好的线性关系。当信噪比为3时，测定各种化合物含量的检测限在0002～80mg/ml之间。
235精密度实验在“234”项色谱条件下，精密吸取对照品混合溶液10μl，连续进样6次，测定。峰面积的RSD在1%～4%，说明本法精密度良好。
236重现性实验取同一批样品按供试品溶液制备方法平行制备5份，分别进样10μl，测得峰面积的RSD在4%～5%。
237供试品溶液稳定性在“234”项色谱条件下，取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样5次，测得RSD在3%～5%，说明样品在24h内稳定。
238回收率实验按供试品溶液制备方法操作后，测定，计算，结果平均回收率为912%～1102%，RSD为3%～60%。
3结果
实验应用液质联用方法，测定了茉莉酸甲酯作用下0～240h内甘西鼠尾草中丹参酮I（Tanshinone I）、丹参酮IIA（Tanshinone IIA）成分的含量，本方法提取回收率均在912%～1102%之内，日内和日间精密度RSD均小于10%，最低检测限在0002～80 mg/ml，标准曲线在测量浓度范围内线性良好（r>099）。故此法具有较高的灵敏度和专属性，可用于复杂样品中上述成分的含量测定。
4讨论
茉莉酸甲酯是茉莉属素馨花中香精油的有气味化合物，也是茉莉中特殊香味的重要组成成分，它在其他植物中亦有广泛分布。研究发现它在植物细胞的多种逆境反应中起信号介导的作用，引起细胞抗逆反应产物的表达[1-2]。王学勇等[3]用茉莉酸甲酯诱导丹参毛状根，采用高效液相色谱法检测处理2d、6d、9d后丹参毛状根中隐丹参酮、丹参酮II A的含量以及其在培养基中的含量，结果表明茉莉酸甲酯能显著提高丹参酮类成分在丹参毛状根中的积累并刺激其向培养基中释放。李明等[4]对茉莉酸甲酯处理的丹参茎叶中丹酚酸和丹酚酸B含量进行检测，结果表明外施茉莉酸甲酯能促进甘西鼠尾草叶片中丹参酮类成分的积累。本实验对甘西鼠尾草幼苗喷施MJ，如图1所示，与对照组相比，甘西鼠尾草被MJ处理后，丹参酮IIA的含量从12h开始呈增长趋势，在处理后240h，其含量达到最高。丹参酮I的含量从120h开始呈增长趋势，在240h，其含量达到最高。在MJ处理240h，甘西鼠尾草中丹参酮IIA的含量是对照组的297倍，丹参酮I的含量达到对照组的63倍。由此可见，MJ可以显著提高甘西鼠尾草中丹参酮I及丹参酮IIA的含量，在甘西鼠尾草人工种植过程中，MJ可以考虑加以应用。
参考文献
[1] Parchmann S，Gundlach H，Mueller M J.Induction of 12-Oxo-phytodienoic acid in wounded plants and elicited plant cell cultures[J].Plant Physl，1997，115（3）：1057.
[2] Bohland C，Balkenhohl T，Loers G，et al.Differential induction of lipoxyfenase isoforms in wheat upon treatment with rust fungus elicitor， chitin oligosaccharides chitosan and methyl jasmonate[J].Plant Physl，1997，114（2）：679.
[3]王学勇.丹参毛状根基因诱导表达分析及其有效成分生物合成基因的克隆研究[D].北京：中国中医科学院，2007.
[4] 李明，冯世阳.茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量的影响[J].时珍国医国药，2009，20（8）：1921.
（收稿日期：20141028）