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[摘要]微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。
[关键词]生物合成技术
中图分类号:[Q528+.2] 文獻标识码:A 文章编号:1009-914X(2013)28-0296-01
微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)和代谢工程(metabolic engineering)成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。
一、微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因，以及随后克隆的榴菌素、红霉素、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。除此之外，微生物次级代谢产物生物合成基因簇还具有以下几个特点：①生物合成基因一般形成几个不同的转录单位；②通常含有一个以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因表达之间有一定的相互调节；③绝大多数基因表达的调控发生在转录水平，除了受特异的途径专一性调节因子调控外，还受到同时影响胞内其他产物合成甚至细胞分化的全局性调节因子的调控［7］。微生物次级代谢产物生物合成基因的成簇排列特征为相应生物合成基因的克隆提供了方便，也就是说，几乎任何一个结构基因、耐药性基因、转运蛋白基因或途径专一性调节基因的克隆都有可能导致整个生物合成基因簇的获得。
二、微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆情况根据微生物次级代谢产物生物合成基因簇的上述特点，大量的生物合成基因簇从不同的微生物种群中克隆出来，其中主要的克隆方法有突变株回补(如放线紫红素)、利用同源性较高的异源DNA作为探针的杂交法(如榴菌素)、耐药性基因的克隆(如红霉素)、从蛋白质分离到反推编码DNA的反向遗传(如利福霉素)、根据同源蛋白保守区设计的兼并性引物扩增法(如阿卡波糖)以及整个生物合成基因簇的异源表达(如肠球菌素)等。通过上述克隆方法，迄今为止已经克隆了超过150种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇，一方面进一步证明了微生物次级代谢产物成簇排列的特点，另一方面也揭示了结构上不同的代谢产物在编码基因上的相关性，例如β内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)合成。因此根据编码基因种类的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的类别来归类。
三、次级代谢产物生物合成基因簇资源的定向利用如此众多生物合成基因簇的克隆为微生物次级代谢产物的比较研究打下了坚实的基础。1985年Hopwood等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素，标志着微生物次级代谢产物组合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程。迄今为止，组合生物合成的理论基础和技术储备已经相当丰富，并且产生了数百种非天然的“天然产物”(nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了将化学合成和酶催化进行有机结合的体外糖类随机化(in vitro glycorandomization，IVG)的新概念，即把通过化学方法高效合成的多种自由糖基，在定向进化产生的具有底物识别广谱性糖基激酶、核苷转移酶和糖基转移酶的级联催化下，在体外转移到多种糖基受体，从而大量产生多种新结构、新活性衍生物的过程。他们利用万古霉素的糖基转移酶GtfE和许多非天然的NDP糖基供体一次性获得了32种携带有不同糖基的万古霉素衍生物，充分显示了该项技术的高效性和巨大潜力。微生物次级代谢产物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途径及生物合成调控机理的阐明成为可能，从而揭示生物合成途径的限速步骤和调控节点，并进行相应的遗传操作来显著提高次级代谢产物的产量或提高活性组分的比例、降低消除低活性组分的含量。因此在基因簇克隆和遗传分析基础上的代谢工程研究也变得目的性更强、效率更高。例如，Malmberg等在利用棒状链霉菌研究头霉素C的生物合成过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸向头霉素前体α氨基己二酸转化的赖氨酸ε氨基转移酶(LAT)是头霉素C生物合成的限速酶，额外拷贝LAT向棒状链霉菌的引入致使头孢霉素C的产量提高了2～5倍。
四、小结
多种微生物次级代谢产物生物合成途径的克隆、序列测定、基因功能分析和组合生物合成探索，使我们初步构建了微生物次级代谢产物基因工程操作平台。
[关键词]生物合成技术
中图分类号:[Q528+.2] 文獻标识码:A 文章编号:1009-914X(2013)28-0296-01
微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。以上多种多样抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等，在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。随着大量微生物次级代谢产物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物分离的重复性很高。另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。分子生物学基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)和代谢工程(metabolic engineering)成为解决上述问题的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。
一、微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了放线紫红素的全部生物合成基因，以及随后克隆的榴菌素、红霉素、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。除此之外，微生物次级代谢产物生物合成基因簇还具有以下几个特点：①生物合成基因一般形成几个不同的转录单位；②通常含有一个以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因表达之间有一定的相互调节；③绝大多数基因表达的调控发生在转录水平，除了受特异的途径专一性调节因子调控外，还受到同时影响胞内其他产物合成甚至细胞分化的全局性调节因子的调控［7］。微生物次级代谢产物生物合成基因的成簇排列特征为相应生物合成基因的克隆提供了方便，也就是说，几乎任何一个结构基因、耐药性基因、转运蛋白基因或途径专一性调节基因的克隆都有可能导致整个生物合成基因簇的获得。
二、微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆情况根据微生物次级代谢产物生物合成基因簇的上述特点，大量的生物合成基因簇从不同的微生物种群中克隆出来，其中主要的克隆方法有突变株回补(如放线紫红素)、利用同源性较高的异源DNA作为探针的杂交法(如榴菌素)、耐药性基因的克隆(如红霉素)、从蛋白质分离到反推编码DNA的反向遗传(如利福霉素)、根据同源蛋白保守区设计的兼并性引物扩增法(如阿卡波糖)以及整个生物合成基因簇的异源表达(如肠球菌素)等。通过上述克隆方法，迄今为止已经克隆了超过150种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇，一方面进一步证明了微生物次级代谢产物成簇排列的特点，另一方面也揭示了结构上不同的代谢产物在编码基因上的相关性，例如β内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)合成。因此根据编码基因种类的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的类别来归类。
三、次级代谢产物生物合成基因簇资源的定向利用如此众多生物合成基因簇的克隆为微生物次级代谢产物的比较研究打下了坚实的基础。1985年Hopwood等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素，标志着微生物次级代谢产物组合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程。迄今为止，组合生物合成的理论基础和技术储备已经相当丰富，并且产生了数百种非天然的“天然产物”(nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了将化学合成和酶催化进行有机结合的体外糖类随机化(in vitro glycorandomization，IVG)的新概念，即把通过化学方法高效合成的多种自由糖基，在定向进化产生的具有底物识别广谱性糖基激酶、核苷转移酶和糖基转移酶的级联催化下，在体外转移到多种糖基受体，从而大量产生多种新结构、新活性衍生物的过程。他们利用万古霉素的糖基转移酶GtfE和许多非天然的NDP糖基供体一次性获得了32种携带有不同糖基的万古霉素衍生物，充分显示了该项技术的高效性和巨大潜力。微生物次级代谢产物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途径及生物合成调控机理的阐明成为可能，从而揭示生物合成途径的限速步骤和调控节点，并进行相应的遗传操作来显著提高次级代谢产物的产量或提高活性组分的比例、降低消除低活性组分的含量。因此在基因簇克隆和遗传分析基础上的代谢工程研究也变得目的性更强、效率更高。例如，Malmberg等在利用棒状链霉菌研究头霉素C的生物合成过程中发现，控制从初级代谢产物赖氨酸向头霉素前体α氨基己二酸转化的赖氨酸ε氨基转移酶(LAT)是头霉素C生物合成的限速酶，额外拷贝LAT向棒状链霉菌的引入致使头孢霉素C的产量提高了2～5倍。
四、小结
多种微生物次级代谢产物生物合成途径的克隆、序列测定、基因功能分析和组合生物合成探索，使我们初步构建了微生物次级代谢产物基因工程操作平台。