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[摘要]目的研究浙江温州地区汉族人群中染色体9p21上的rs1333049位点上的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与冠心病的相关性。方法对冠心病组（至少1支主要冠状动脉内径狭窄≥50.00%）181例和对照组173例，采用聚合酶链反应和基因测序方法，检测染色体9p21上rs1333049位点基因多态性。结果3种基因型均可在rs1333049位点上检测到，并且其基因型的分布亦符合Hardy_Weinberg平衡定律。冠心病组rs13330149位点的CC、CG基因型分布及C等位基因频率均高于对照组，差异有统计学意义（均P<0.01）。结论rs1333049位点G/C基因的多态性与冠心病发病相关，其中的C等位基因亦可能是浙江温州地区汉族人群冠心病患者的易感性标志之一。
[关键词]冠状动脉粥样硬化性心脏病；染色体9p21；单核苷酸多态性
中图分类号：R541.4文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）04_0298_03
doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.04.10冠心病是成年人死亡的重要原因，随着社会、经济的发展和变化，我国冠心病的发病率呈上升趋势。目前，大家普遍认为冠心病是由多种遗传因素和各种高危因素（疾病）共同作用而导致的多基因遗传性疾病。然而，得到确认的有关遗传因素对冠心病的影响研究成果并不多。近来，全基因组相关研究（genome_wide association studies GWAS）检测了成百上千个标志物或者重点相关基因，其中包含冠心病的易患基因和其多态性的研究。WTCCC[1]（The Wellcome Trust Case Control Consortium）等发现人类9号染色体上的9p21.3区域上的基因和冠心病发病显著相关。本文对354例冠状动脉造影检查患者进行了9p21区域多态位点rs1333049位点上的基因进行基因多态性测定，以探讨其是否与浙江温州地区汉族人群中的冠心病发病相关。
1资料与方法
1.1一般资料：入选对象均为2010年8月至2013年3月本院心内科的住院患者。所有患者入院后均常规检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖（Glu），并行冠状动脉造影检查。左右冠状动脉主干、回旋支、前降支及其主要分支中任何一支血管直径狭窄程度≥50%为冠状动脉造影阳性。依据造影结果分为两组：（1）冠心病组：共181例，男112例，女69例，年龄38～84岁，平均（64.76±10.59）岁。（2）对照组：冠状动脉造影阴性，共173例，男105例，女68例，年龄35～81岁，平均（63.20±11.33）岁。所有患者均为温州本地长期居住者，汉族且无亲缘关系，并排除脑血管病、外周血管病、恶性肿瘤病史者。两组患者年龄、性别等一般临床资料，比较差异无统计学意义，见表1。
1.2方法：
1.2.1染色体基因组DNA的采集：在征得患者或其家属的同意后，从外周静脉采取5ml的静脉血，置于常规抗凝管中（应用酸性的柠檬酸葡萄糖抗凝）。并取得白细胞（应用低渗溶血法），并提取基因组DNA，TE溶解（采用常规的酚/氯仿抽提法），并置于-20℃低温的冰箱中保存。
1.2.2引物设计：引物采用Primier 5软件自行设计，rs1333049上游引物：5'_GGCTGCTGACTCTGAAGATC_3'，下游引物：5'_CTTGCTTACCTCTGCGAGTG_3'，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.39p21基因聚合酶链反应（PCR）：扩增总体积为50μL，其中引物1.0μmol/L。扩增条件：95℃ 5min，92℃50s，60℃50s，72℃50s，72℃5min，共35个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4基因测序：PCR产物送长沙三济生物科技有限公司纯化后，采用ABI3730XLDNA分析系统进行测序分析。
1.3统计学处理：应用SPSS17.0版中文软件包进行统计分析。计量资料以（x-±s）表示，组间比较采用t检验；等位基因频率和基因型采用基因计数法进行统计计算，对基因型资料进行遗传平衡检验（采用Hardy_Weinberg法）；单个基因型及基因组组间的等位基因频率比较采用卡方检验，rs1333049基因多态性和冠心病的相关性采用多因素Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.19p21区域rs1333049位点多态性分析：rs1333049位点PCR扩增结果见图1。基因测序结果可见CC、CG及GG三种基因型。冠心病组和对照组的rs1333049位点上的观察数与期望数比较差异无统计学意义（P>0.05），表明本研究的人群符合Hardy_Weinberg平衡定律。
3讨论
冠心病是一种由多种遗传因素和各种高危因素（疾病）共同作用而导致的多基因遗传性疾病。年龄、性别、肥胖、高血压、高脂血症、糖尿病，吸烟等均是冠心病患病的重要危险因素[2]。但近年来，有研究表明基因在冠心病发病中扮演重要角色。关注于冠心病和心肌梗死所涉及的全基因组相关研究（GWAS）观察发现，冠心病和心肌梗死相关位点在染色体9p21位点最为常见。WTCCC研究入选了1926例冠心病病例以及2938例对照组病例，采用Affymetrix 500K基因芯片，在世界上首次发现多态位点rs1333049（位于9p21.3区域）与高加索人群冠心病的发病呈显著相关[1]。Schunkert H等荟萃分析了7个欧洲人群和参加早先冠心病全基因组相关研究的4个人群，证实了rs1333049位点的多态性与冠心病的发病关系明显相关[3]。此后该位点SNP和冠心病易感性的关联也相继在其它国家的其它人种人群中得到了印证。Hinohara等研究发现韩国和日本人群中染色体9p21区域上的rs1333049位点SNP和冠心病易感性的相关[4，5]。而中国的学者Wang等所做的研究结果亦提示rs1333049位点CC表型与中国汉族人群冠心病的早发性和严重性密切有关，且与患者的血糖，血胰岛素水平及炎症因子无关[6]。杜蓉等报道rs1333049位点CC与CG基因型为新疆维族人群心肌梗死的易感相关危险基因型[7]。本研究中所发现的冠心病患者和对照组患者的rs1333049位点基因型频率分布有显著差异（P<0.01），冠心病患者中的C等位基因的频率明显高于对照组（P<0.01），提示rs1333049位点多态性与冠心病的发病相关，C等位基因可能是浙江温州地区汉族人群冠心病发病的易感因素之一。 在染色体9p21上发现的且与冠心病关系密切的SNPs主要集中在染色体9p21.3的区域内。该区域存在2种抑癌基因CDKN2A和CDKN2B，分别编码细胞周期蛋白激酶抑制子CDK4家族中的抑制子p16NK4a、p15NK4b，在多种细胞增殖、衰老和凋亡中起重要作用[8～11]，而细胞增殖、衰老和凋亡是动脉粥样硬化形成的主要特征之一，而动脉粥样硬化是冠心病的病理基础。Cunnington等研究表明9p21.3位点基因可能影响细胞周期激酶抑制因子4b位点的反义非编码RNA ANRIL的调节，进而调节CDKN2A和CDKN2B的表达，这种调节可能促进细胞的增殖，引起动脉粥样硬化性改变[12]。
总之，SNP位点的突变型在不同人种，民族中的差异较大，并且其易感位点亦不同，而且目前世界上对染色体9p21上SNP位点如何影响患者患病机制尚不明确，根据本研究的结果，我们推测其可能作为一种遗传标志，通过其邻近的基因发挥作用，关于SNP影响冠心病患病机制有待进一步研究。
参考文献
[1]The Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome_wide association study of 14，000 cases of seven common diseases and 3，000 shared controls[J]. Nature，2007，447（7145）：661-678.
[2]Lanktree MB，Hegele RA. Gene_gene and gene_environm entinteractions： new insights into the prevention，detection and management of coronary artery disease[J]. Genome Med，2009，26（2）：28.
[3]Schunkert H， Gtz A， Braund P， et al. Repeated replication and a prospective meta_analysis of the association between chromosome 9p21.3 and coronary artery disease[J]. Circulation，2008，117（13）：1675-1684.
[4]Hinohara K， Nakajima T， Takahashi M， et al. Replication of the association between a chromosome 9p21 polymorphism and coronary artery disease in Japanese and Korean populations[J]. J Hum Genet，2008，53（4）：357-359.
[5]Palomaki GE， Melillo S， Bradley LA. Association between 9p21 genomic markers and heart disease： a meta_analysis[J]. JAMA，2010，303（7）：648-656.
[6]Wang W， Peng WH， Lu L， et al. Polymorphism on chromosome 9p21.3 contributes to early_onset and severity of coronary artery disease in non_diabetic and type 2 diabetic patients[J]. Chin Med J（Engl），2011，124（1）：66-71.
[7]杜蓉，李国庆，彭辉，等.染色体9p21上rs1333049单核苷酸多态性与新疆维吾尔族及汉族心肌梗死的相关性分析[J].中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（8）：763-765.
[8]Helgadottir A， Thorleifsson G， Manolescu A， et al. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction[J]. Science，2007，316（5830）：1491-1493.
[9]Mc Pherson R， Pertsemlidis A， Kavaslar N， et al. A common allele on chromosome 9p21 associated with coronary heart disease[J]. Science，2007，316（5830）：1488-1491.
[10]Kim WY， Sharpless NE. The regulation of INK4/ARF in cancer and aging[J]. Cell，2006，127（2）：265-275.
[11]张琦，钟光珍，王志军，等.染色体9p21上两个SNP位点与中国汉族人群心肌梗死的关系[J].山东医药，2010，50（5）：4-6.
[12]Cunnington MS， Keavney B. Genetic mechanisms mediating atherosclerosis susceptibility at the chromosome 9p21 locus[J]. Curr Atheroscler Rep，2011，13（3）：193-201.
（收稿日期：2014_4_7）
[关键词]冠状动脉粥样硬化性心脏病；染色体9p21；单核苷酸多态性
中图分类号：R541.4文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）04_0298_03
doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.04.10冠心病是成年人死亡的重要原因，随着社会、经济的发展和变化，我国冠心病的发病率呈上升趋势。目前，大家普遍认为冠心病是由多种遗传因素和各种高危因素（疾病）共同作用而导致的多基因遗传性疾病。然而，得到确认的有关遗传因素对冠心病的影响研究成果并不多。近来，全基因组相关研究（genome_wide association studies GWAS）检测了成百上千个标志物或者重点相关基因，其中包含冠心病的易患基因和其多态性的研究。WTCCC[1]（The Wellcome Trust Case Control Consortium）等发现人类9号染色体上的9p21.3区域上的基因和冠心病发病显著相关。本文对354例冠状动脉造影检查患者进行了9p21区域多态位点rs1333049位点上的基因进行基因多态性测定，以探讨其是否与浙江温州地区汉族人群中的冠心病发病相关。
1资料与方法
1.1一般资料：入选对象均为2010年8月至2013年3月本院心内科的住院患者。所有患者入院后均常规检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖（Glu），并行冠状动脉造影检查。左右冠状动脉主干、回旋支、前降支及其主要分支中任何一支血管直径狭窄程度≥50%为冠状动脉造影阳性。依据造影结果分为两组：（1）冠心病组：共181例，男112例，女69例，年龄38～84岁，平均（64.76±10.59）岁。（2）对照组：冠状动脉造影阴性，共173例，男105例，女68例，年龄35～81岁，平均（63.20±11.33）岁。所有患者均为温州本地长期居住者，汉族且无亲缘关系，并排除脑血管病、外周血管病、恶性肿瘤病史者。两组患者年龄、性别等一般临床资料，比较差异无统计学意义，见表1。
1.2方法：
1.2.1染色体基因组DNA的采集：在征得患者或其家属的同意后，从外周静脉采取5ml的静脉血，置于常规抗凝管中（应用酸性的柠檬酸葡萄糖抗凝）。并取得白细胞（应用低渗溶血法），并提取基因组DNA，TE溶解（采用常规的酚/氯仿抽提法），并置于-20℃低温的冰箱中保存。
1.2.2引物设计：引物采用Primier 5软件自行设计，rs1333049上游引物：5'_GGCTGCTGACTCTGAAGATC_3'，下游引物：5'_CTTGCTTACCTCTGCGAGTG_3'，由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.39p21基因聚合酶链反应（PCR）：扩增总体积为50μL，其中引物1.0μmol/L。扩增条件：95℃ 5min，92℃50s，60℃50s，72℃50s，72℃5min，共35个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4基因测序：PCR产物送长沙三济生物科技有限公司纯化后，采用ABI3730XLDNA分析系统进行测序分析。
1.3统计学处理：应用SPSS17.0版中文软件包进行统计分析。计量资料以（x-±s）表示，组间比较采用t检验；等位基因频率和基因型采用基因计数法进行统计计算，对基因型资料进行遗传平衡检验（采用Hardy_Weinberg法）；单个基因型及基因组组间的等位基因频率比较采用卡方检验，rs1333049基因多态性和冠心病的相关性采用多因素Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.19p21区域rs1333049位点多态性分析：rs1333049位点PCR扩增结果见图1。基因测序结果可见CC、CG及GG三种基因型。冠心病组和对照组的rs1333049位点上的观察数与期望数比较差异无统计学意义（P>0.05），表明本研究的人群符合Hardy_Weinberg平衡定律。
3讨论
冠心病是一种由多种遗传因素和各种高危因素（疾病）共同作用而导致的多基因遗传性疾病。年龄、性别、肥胖、高血压、高脂血症、糖尿病，吸烟等均是冠心病患病的重要危险因素[2]。但近年来，有研究表明基因在冠心病发病中扮演重要角色。关注于冠心病和心肌梗死所涉及的全基因组相关研究（GWAS）观察发现，冠心病和心肌梗死相关位点在染色体9p21位点最为常见。WTCCC研究入选了1926例冠心病病例以及2938例对照组病例，采用Affymetrix 500K基因芯片，在世界上首次发现多态位点rs1333049（位于9p21.3区域）与高加索人群冠心病的发病呈显著相关[1]。Schunkert H等荟萃分析了7个欧洲人群和参加早先冠心病全基因组相关研究的4个人群，证实了rs1333049位点的多态性与冠心病的发病关系明显相关[3]。此后该位点SNP和冠心病易感性的关联也相继在其它国家的其它人种人群中得到了印证。Hinohara等研究发现韩国和日本人群中染色体9p21区域上的rs1333049位点SNP和冠心病易感性的相关[4，5]。而中国的学者Wang等所做的研究结果亦提示rs1333049位点CC表型与中国汉族人群冠心病的早发性和严重性密切有关，且与患者的血糖，血胰岛素水平及炎症因子无关[6]。杜蓉等报道rs1333049位点CC与CG基因型为新疆维族人群心肌梗死的易感相关危险基因型[7]。本研究中所发现的冠心病患者和对照组患者的rs1333049位点基因型频率分布有显著差异（P<0.01），冠心病患者中的C等位基因的频率明显高于对照组（P<0.01），提示rs1333049位点多态性与冠心病的发病相关，C等位基因可能是浙江温州地区汉族人群冠心病发病的易感因素之一。 在染色体9p21上发现的且与冠心病关系密切的SNPs主要集中在染色体9p21.3的区域内。该区域存在2种抑癌基因CDKN2A和CDKN2B，分别编码细胞周期蛋白激酶抑制子CDK4家族中的抑制子p16NK4a、p15NK4b，在多种细胞增殖、衰老和凋亡中起重要作用[8～11]，而细胞增殖、衰老和凋亡是动脉粥样硬化形成的主要特征之一，而动脉粥样硬化是冠心病的病理基础。Cunnington等研究表明9p21.3位点基因可能影响细胞周期激酶抑制因子4b位点的反义非编码RNA ANRIL的调节，进而调节CDKN2A和CDKN2B的表达，这种调节可能促进细胞的增殖，引起动脉粥样硬化性改变[12]。
总之，SNP位点的突变型在不同人种，民族中的差异较大，并且其易感位点亦不同，而且目前世界上对染色体9p21上SNP位点如何影响患者患病机制尚不明确，根据本研究的结果，我们推测其可能作为一种遗传标志，通过其邻近的基因发挥作用，关于SNP影响冠心病患病机制有待进一步研究。
参考文献
[1]The Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome_wide association study of 14，000 cases of seven common diseases and 3，000 shared controls[J]. Nature，2007，447（7145）：661-678.
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[3]Schunkert H， Gtz A， Braund P， et al. Repeated replication and a prospective meta_analysis of the association between chromosome 9p21.3 and coronary artery disease[J]. Circulation，2008，117（13）：1675-1684.
[4]Hinohara K， Nakajima T， Takahashi M， et al. Replication of the association between a chromosome 9p21 polymorphism and coronary artery disease in Japanese and Korean populations[J]. J Hum Genet，2008，53（4）：357-359.
[5]Palomaki GE， Melillo S， Bradley LA. Association between 9p21 genomic markers and heart disease： a meta_analysis[J]. JAMA，2010，303（7）：648-656.
[6]Wang W， Peng WH， Lu L， et al. Polymorphism on chromosome 9p21.3 contributes to early_onset and severity of coronary artery disease in non_diabetic and type 2 diabetic patients[J]. Chin Med J（Engl），2011，124（1）：66-71.
[7]杜蓉，李国庆，彭辉，等.染色体9p21上rs1333049单核苷酸多态性与新疆维吾尔族及汉族心肌梗死的相关性分析[J].中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（8）：763-765.
[8]Helgadottir A， Thorleifsson G， Manolescu A， et al. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction[J]. Science，2007，316（5830）：1491-1493.
[9]Mc Pherson R， Pertsemlidis A， Kavaslar N， et al. A common allele on chromosome 9p21 associated with coronary heart disease[J]. Science，2007，316（5830）：1488-1491.
[10]Kim WY， Sharpless NE. The regulation of INK4/ARF in cancer and aging[J]. Cell，2006，127（2）：265-275.
[11]张琦，钟光珍，王志军，等.染色体9p21上两个SNP位点与中国汉族人群心肌梗死的关系[J].山东医药，2010，50（5）：4-6.
[12]Cunnington MS， Keavney B. Genetic mechanisms mediating atherosclerosis susceptibility at the chromosome 9p21 locus[J]. Curr Atheroscler Rep，2011，13（3）：193-201.
（收稿日期：2014_4_7）