目的:建立采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定人胰岛素及其类似物全序列的方法。方法:该方法以人胰岛素为主要研究对象，首先对其进行还原烷基化前处理，后进行UPLC-MS/MS分析。采用ACQUITY UPLC peptide BEH C18（100 mm×2.1 mm, 1.7μm, 300?）色谱柱，流动相A为0.1%甲酸/水溶液，流动相B为0.1%甲酸/乙腈溶液，梯度洗脱（0～10 min, 3%B→60%B;10～10.5 min, 60%B→95%B;10.5～14 min, 95%B;14～14.5 min, 95%B→3%B;14.5～20 min, 3%B）,流速0.3 mL·min-1,柱温50℃;采用电喷雾离子源正离子（ESI+）扫描，通过优化质谱参数，对人胰岛素及其类似物进行“top-town”全序列的测定分析，并对人胰岛素的序列测定方法进行了深入的研究，同时考察该方法对门冬胰岛素和赖脯胰岛素的适用性。结果:该方法能够较好地覆盖人胰岛素A和B链的全序列，通过b/y离子分析，5个高强度b/y离子的离子强度RSD在20%之内，A链与B链一级质量数准确，其精密度、准确度良好；该方法可区分与其他胰岛素类似物的序列的不同，专属性良好，且对门冬胰岛素和赖脯胰岛素具有良好的适用性。结论:该方法操作简便，准确性好，专属性强，为胰岛素及其类似物的全序列测定提供了数据支持。