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【文章摘要】
蛋白质与生命的起源、 存在和进化都密切相关， 蛋白质含量测定涉及到生产和科研的众多领域。 目前常用的方法有凯氏定氮法、 双缩脲法、 Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、HPLC法。 本文总结各种方法的特点及适用条件， 针对不同的待测样品以及对测定结果准确性的要求不同， 我们可以采用不同的方法来测定样品中蛋白质的含量。
【关键词】
蛋白质；凯氏定氮法；紫外吸收法；Bradford法；Lowry法；HPLC法
1 引言
蛋白质是复杂的含氮有机化合物， 主要是由各种氨基酸构成。它是谷物、食品、饲料及其它农副产品的重要成份，亦是重要的营养物质， 因此测定蛋白质含量以及对蛋白质组成的分析处于重要的位置，在农产品加工、营养卫生、国际贸易以及近代农作物育种等方面均受到高度重视，并不断改进蛋白质的测定方法。
2 凯氏定氮法
2.1原理
其原理是根据蛋白质是含氮的有机化合物，样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解产生氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。凯氏定氮法测定的是样品中含氮量。
2.2特点
凯氏定氮法是经典的测定蛋白质的方法，该法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等组成复杂样品的测定， 其测定准确率高，干扰小，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏高。且费时较长，一般需8～10小时。
3 双缩脲法（比色法）
3.1原理
其原理是双缩脲（NH3CONHCONH3）与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1～10mg蛋白质。
3.2特点
此法的优点是速度快，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干擾物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
4 Lowry法（比色法）
4.1原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的方法，此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即福林酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成复合物。福林酚试剂中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
4.2特点
此法测定的优点是灵敏度高，比双缩脲法高得多，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差。此法测定的干扰物质较多，对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多 。
5 紫外吸收法
5.1原理
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280 nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238 nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
5.2特点
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值[8]。
6 Bradford法（比色法）
6.1原理
其原理是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
6.2特点
蛋白质——染料复合具有很高分的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度。考马斯亮蓝法（Bradford法） 检测速度快，5～15分钟，干扰物质少；且颜色稳定，颜色深浅随蛋白质浓度不同变化。其突出的优点是： （1）灵敏度高。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰测定 。
7 HPLC法测定蛋白质含量
7.1原理
高效液相色谱（HPLC）法是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法，HPLC是以经典的液相色谱为基础，是以液体为流动相的色谱过程。传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小、传质快、柱效高。
7.2特点
这种方法虽然有游离氨基酸的干扰，但应该是最可靠的方法。此方法虽然检测率很高，但检测成本很高，仪器造价昂贵，目前不能进行广泛应用。
8 结论
通过以上对蛋白质定量分析的介绍 ， 我们了解到蛋白质定量测定的研究与应用是生物化学的重要组成部分。它己引起了生命科学各领域以及相关学科的极大重视。借助上述手段我们可以测定微量的蛋白质，并可以研究蛋白质结构与功能的关系、研究蛋白质与小分子配体的作用机理等。
【参考文献】
[1]李伟，王鑫，王刚等.食品中蛋白质测定方法的比较[J].广西质量监督导报2008，5（11）：73-74.
[2]陈智慧，史梅，王秋香等.用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量[J].新疆畜牧业， 2008，16（5）：22-24.
[3]张龙翔，张庭芳，李令媛等.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社， 1981，T164-169.
[4]吴文卫.双缩脲-分光光度法测定乳与乳制品中蛋白质含量[J].中国卫生检验杂志，2008，29（7）：121-123.
[5]罗芳.Folin - 酚试剂法蛋白质定量测定[J].黔南民族师范学院学报，2005，34（3）：46-47.
[6]李宁.几种蛋白质测定方法的比较[J].陕西农业大学学报，2006，（2）：132-134.
[7]曹红翠.紫外分光光度法测定蛋白质的含量[J].广东化工，2007，34（8）：93-94.
[8]石允生.食品中蛋白质吲哚酚分光光度法定量检测[J].中国公共卫生，2005，216（9）：1139-1140.
[9]食品中蛋白质的测定.GB/ T5009.5 - 2003 [S].北京：中国标准出版社，2003：109-112.
[10]甘淋， 李娟， 何涛等.几种蛋白质含量测定方法的比较研究[J].泸州医学院学报， 2004，27（6）：500-502.
[11]黄国宏.高效液相色谱技术在食品分析中的应用[J].食品工程，2006，（4）：47-50.
蛋白质与生命的起源、 存在和进化都密切相关， 蛋白质含量测定涉及到生产和科研的众多领域。 目前常用的方法有凯氏定氮法、 双缩脲法、 Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、HPLC法。 本文总结各种方法的特点及适用条件， 针对不同的待测样品以及对测定结果准确性的要求不同， 我们可以采用不同的方法来测定样品中蛋白质的含量。
【关键词】
蛋白质；凯氏定氮法；紫外吸收法；Bradford法；Lowry法；HPLC法
1 引言
蛋白质是复杂的含氮有机化合物， 主要是由各种氨基酸构成。它是谷物、食品、饲料及其它农副产品的重要成份，亦是重要的营养物质， 因此测定蛋白质含量以及对蛋白质组成的分析处于重要的位置，在农产品加工、营养卫生、国际贸易以及近代农作物育种等方面均受到高度重视，并不断改进蛋白质的测定方法。
2 凯氏定氮法
2.1原理
其原理是根据蛋白质是含氮的有机化合物，样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解产生氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。凯氏定氮法测定的是样品中含氮量。
2.2特点
凯氏定氮法是经典的测定蛋白质的方法，该法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等组成复杂样品的测定， 其测定准确率高，干扰小，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏高。且费时较长，一般需8～10小时。
3 双缩脲法（比色法）
3.1原理
其原理是双缩脲（NH3CONHCONH3）与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1～10mg蛋白质。
3.2特点
此法的优点是速度快，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干擾物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
4 Lowry法（比色法）
4.1原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的方法，此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即福林酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜离子结合生成复合物。福林酚试剂中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
4.2特点
此法测定的优点是灵敏度高，比双缩脲法高得多，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差。此法测定的干扰物质较多，对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多 。
5 紫外吸收法
5.1原理
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280 nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238 nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
5.2特点
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值[8]。
6 Bradford法（比色法）
6.1原理
其原理是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
6.2特点
蛋白质——染料复合具有很高分的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度。考马斯亮蓝法（Bradford法） 检测速度快，5～15分钟，干扰物质少；且颜色稳定，颜色深浅随蛋白质浓度不同变化。其突出的优点是： （1）灵敏度高。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰测定 。
7 HPLC法测定蛋白质含量
7.1原理
高效液相色谱（HPLC）法是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法，HPLC是以经典的液相色谱为基础，是以液体为流动相的色谱过程。传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小、传质快、柱效高。
7.2特点
这种方法虽然有游离氨基酸的干扰，但应该是最可靠的方法。此方法虽然检测率很高，但检测成本很高，仪器造价昂贵，目前不能进行广泛应用。
8 结论
通过以上对蛋白质定量分析的介绍 ， 我们了解到蛋白质定量测定的研究与应用是生物化学的重要组成部分。它己引起了生命科学各领域以及相关学科的极大重视。借助上述手段我们可以测定微量的蛋白质，并可以研究蛋白质结构与功能的关系、研究蛋白质与小分子配体的作用机理等。
【参考文献】
[1]李伟，王鑫，王刚等.食品中蛋白质测定方法的比较[J].广西质量监督导报2008，5（11）：73-74.
[2]陈智慧，史梅，王秋香等.用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量[J].新疆畜牧业， 2008，16（5）：22-24.
[3]张龙翔，张庭芳，李令媛等.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社， 1981，T164-169.
[4]吴文卫.双缩脲-分光光度法测定乳与乳制品中蛋白质含量[J].中国卫生检验杂志，2008，29（7）：121-123.
[5]罗芳.Folin - 酚试剂法蛋白质定量测定[J].黔南民族师范学院学报，2005，34（3）：46-47.
[6]李宁.几种蛋白质测定方法的比较[J].陕西农业大学学报，2006，（2）：132-134.
[7]曹红翠.紫外分光光度法测定蛋白质的含量[J].广东化工，2007，34（8）：93-94.
[8]石允生.食品中蛋白质吲哚酚分光光度法定量检测[J].中国公共卫生，2005，216（9）：1139-1140.
[9]食品中蛋白质的测定.GB/ T5009.5 - 2003 [S].北京：中国标准出版社，2003：109-112.
[10]甘淋， 李娟， 何涛等.几种蛋白质含量测定方法的比较研究[J].泸州医学院学报， 2004，27（6）：500-502.
[11]黄国宏.高效液相色谱技术在食品分析中的应用[J].食品工程，2006，（4）：47-50.