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摘要
[目的]构建FMDV乳酸杆菌穿梭表达载体。[方法]从A型FMDV中克隆出VP1基因后，根据乳酸杆菌密码子偏好性对VP1进行优化，与表达载体pSIP411进行连接，并将连接产物转化到DH5α中筛选出阳性克隆菌，重组质粒酶切和PCR鉴定成功后再转化到BL21中，采用杆菌肽进行诱导表达。[结果]表达产物经SDSPAGE和Western blottmy 检测在24 kD处有明显的条带，证明VP1pSIP411重组表达载体构建成功并在BL21中成功表达。[结论]为后续乳酸杆菌表达VP1蛋白研究奠定了基础。
关键词口蹄疫病毒；VP1；pSIP；乳酸菌；大肠杆菌
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-025-03
口蹄疫（FootandMouth Disease，FMD）是一种高度传染性和经济破坏性的家畜疫病，能够引起家畜生产性能降低，患病仔畜高死亡率，对畜牧行业造成巨大损失。除对动物贸易的扰动外，FMD的暴发还会造成严重的经济和社会影响，包括对饲料行业、兽药行业和旅游相关产业的破坏。尤其重要的是，它制约了发展中国家的畜牧业发展，特别对无FMD病原的国家和地区能够造成巨大的经济损失。如2001年荷兰和英国、2007年英国暴发的FMD造成的惨重损失[1]。
FMD的病原是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus， FMDV），是单链正义RNA病毒，属于微小RNA病毒科口蹄疫病毒属。病毒基因组全长约 8.5 kb，有 7 个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亚洲1型），型间无交叉保护。其开放阅读框由 L 基因、P1 结构蛋白基因（包括VP4、VP2、VP3、VP1基因）、P2非结构蛋白基因（包括2A、2B、2C基因）和P3非结构蛋白基因（3A、3B、3C、3D基因）组成。其中，VP1蛋白带有诱导FMD免疫反应的关键表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸。VP1基因全长636 nt，是编码FMDVVP1蛋白的免疫原性基因。围绕VP1分子，目前研究较热的FMD基因工程疫苗包括亚单位疫苗、可饲疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等[2-3]。
pSIP表达系统是目前研究最为深入、机理最为清楚、使用最为广泛的乳酸菌表达系统之一，能很好地表达外源性抗原，且以乳酸杆菌作为外源保护性抗原基因的受体菌株，可将乳酸菌的益生作用和表达外源功能抗原基因的特异性免疫功能相结合，最大程度地发挥免疫调节功能[4]。因此，构建重组FMDV VP1基因乳酸杆菌表达载体，是研究乳酸杆菌活载体疫苗的前体和保障。該试验旨在为后续乳酸杆菌表达VP1蛋白研究奠定基础。
1材料与方法
1.1毒株、菌株和载体
乳酸杆菌穿梭表达质粒pSIP411由挪威Nofima研究所的Lars Axelsson教授惠赠，大肠杆菌DH5α和BL21购自于TaKaRa公司，A型FMDV和猪FMDV阳性血清为中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室保存。
1.2主要试剂
T4 DNA连接酶、Nco I限制性内切酶、Xho I 限制性内切酶均购自NEB公司；Ex Taq DNA 聚合酶、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；红霉素购自amresco公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Millipore公司；HRP标记山羊抗猪IgG抗体购自美国Abbkine公司；预染蛋白质分子量标准购自北京康润诚业生物科技有限公司；革兰氏阳性菌质粒提取试剂盒购自北京索莱宝公司；革兰氏阴性菌质粒提取试剂盒购自上海捷瑞公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 试验方法
1.3.1
A型FMDV总RNA提取。 取于-70 ℃保存的猪水泡皮毒0.1 g，无菌条件下置于研钵中剪碎，加入适量石英砂后边研磨边加DMEM细胞培养液，研磨至无肉眼可见组织块时加双抗，收集后于4 ℃冰箱过夜。取上清后，按照Qiagen RNeasy Mini Kit （50） 说明书进行总RNA提取。相关器皿经高温烘烤，试剂、耗材均使用无RNase产品。
1.3.2
cDNA合成及A型FMDV VP1基因的扩增。通过比对NCBI上已经收录的A型FMDV VP1基因，利用软件Primer 5.0设计特异性引物。
VP1F： 5′GACATGTCCTCCTGCATCT3′；
VP1R： 5′CACAAATGTACAGGGATGGGT3′。
采用TaKaRa PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2.0 进行反转录和扩增VP1基因，按照表1程序进行。
利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。将PCR产物送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。
1.3.3
A型FMDV VP1基因序列分析。用DNA Star软件的MegAlign对VP1基因进行测序，测序结果与GenBank中的参考序列进行同源性比对。
1.3.4
目的基因的设计与合成。根据乳酸菌密码子偏好对VP1进行优化，改造后序列由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，并克隆到载体pUC57上。并在目的序列两侧加入限制性内切酶NcoI和XhoI的酶切位点。
1.3.5
重组表达载体的构建。将人工合成的含有pUC57VP1的大肠杆菌DH5α涂布于LB固体培养基（含有氨苄青霉素）上进行分离培养，37 ℃培养过夜。12 h后挑取单个菌落，于5 ml液体LB培养基（含氨苄青霉素），200 r/min、37 ℃振荡培养10～14 h。按照捷瑞公司革兰氏阴性菌质粒小提试剂盒说明书进行操作。 将含有pSIP411阳性质粒的乳酸球菌MG1363涂布于M17固体培养基（含有10 μg/ml Em）上，恒温箱37 ℃培养24～36 h。用无菌小枪头挑取单个菌落转接到5 ml M17液体培养基（含有10 μg/ml Em）中，37 ℃静置培养12 h。按照索莱宝公司革兰氏阳性菌质粒小提试剂盒说明书进行操作。
采用限制性内切酶NcoI和XhoI分别对VP1和pSIP411表达载体进行双酶切，37 ℃水浴5 h后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定成功之后胶回收，回收后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将回收后的VP1基因和pSIP411载体片段用T4 DNA连接酶进行连接。将重组质粒导入DH5α中进行扩增，在LB平板上挑取疑似阳性重组克隆子，分别接种于5 ml含200 μg/ml红霉素LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h。然后进行重组质粒提取，将可能的阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。
1.3.6
A型FMDV VP1基因在大肠杆菌BL21中的表达。
经过双酶切鉴定和PCR鉴定均为阳性的BL21阳性克隆子接种于5 ml （含200 μg/ml Em） LB液体培养基中，2 000 r/min 、37 ℃培养12 h，将上述菌液以1∶100的接种率接种于10 ml LB液体培养基中，37 ℃培养至OD值为0.6～08，此时记为0 h诱导，在培养基中加入诱导物SppIP （100 ng/ml），之后每隔1 h取菌液至7 h。同样诱导含有空载体pSIP411的BL21，以此作对照，分别取2 ml各个时间收集的诱导菌液，12 000 r/min离心10 min，弃去上清留菌体沉淀，进行SDSPAGE电泳。
1.3.7
Westernblotting分析。SDSPAGE凝胶电泳后，进行电转。用PBS冲洗NC膜3次，然后将膜浸泡于含10%脱脂奶粉的PBST中，37 ℃摇动封闭2 h；封闭结束后PBST清洗NC膜3次，再加入1∶200稀释的猪抗FMDV A型血清，37 ℃轻摇孵育1 h；取出后用PBST清洗3次，每次15 min；洗完后加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗猪IgG，37 ℃轻摇孵育1 h，PBST清洗3次，每次15 min。将膜取出后进行ECL显色。
2 结果与分析
2.1VP1序列分析及密码子优化
用DNA Star软件的MegAlign对VP1基因测序结果与GenBank中的参考序列进行同源性比对，结果显示，该试验所用VP1序列与参考序列（KF450794、HQ116363、HQ268510、HQ116298、EU667455、HQ116293、EU667458、KC588943和F792355）核苷酸一致性均大于91%，其中与2013年广东茂名所分离的A型毒株核苷酸一致性达到99.5%（图1）。
对野生型VP1基因进行密码子优化，调整的序列占原序列的66.04%，从而使G+C含量由59.53%降低到47.49%，212個密码子中，改变140个密码子，优化密码子占66.04%。
2.2重组表达质粒的鉴定
使用XhoI和NcoI对含有已优化好VP1基因的重组质粒pUC57进行PCR鉴定和双酶切鉴定。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR扩增片段和酶切片段与预期大小一致（图2、3）。将已优化的VP1与pSIP411载体16 ℃连接过夜后，分别转化到大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞中，挑取的单个菌落提取质粒后进行PCR鉴定和双酶切鉴定。通过电泳鉴定目的片段大小与预期结果相符（图2）。
2.3重组大肠杆菌的SDSPAGE分析
将诱导的重组菌pSIP411VP1BL21和对照菌pSIP411BL21、未诱导的pSIP411VP1BL21处理进行SDSPAGE分析，结果表明，经诱导的重组菌pSIP411VP1BL21在24 kD处有一条模糊的条带，而对照菌pSIP411BL21和未诱导的pSIP411VP1BL21在24 kD处没有条带，说明重组菌pSIP411VP1BL21经诱导后表达了目的蛋白，但表达量很低，利用SDSPAGE观察效果不明显，进一步采用Western blotting进行鉴定，结果见图3。
2.4重组大肠杆菌的Western blotting结果鉴定
将诱导的重组菌pSIP411VP1BL21和对照菌pSIP411BL21、未诱导的pSIP411VP1BL21处理进行Western blotting分析，结果表明经诱导的重组菌pSIP411VP1BL21在24 kD处有一条明显的条带，而对照菌pSIP411BL21和未诱导的pSIP411VP1BL21在24 kD处没有条带，说明重组菌pSIP411VP1BL21经诱导后表达的目的蛋白具有反应原性（图4）。
2.经诱导的质粒pSIP411在BL21中的表达产物转印结果；3.未经诱导的重组质粒pSIP411VP1在BL21中的表达产物转印结果。
3结论与讨论
一直以来，FMD严重制约世界畜牧业的发展，尤其在FMD流行地区仍将传统疫苗免疫作为防控的主要措施。随着科学技术的进步，新型疫苗的研制也在迅猛发展，但仍处于试验探索阶段。将黏膜免疫应用在FMD疫苗的研究中也开始兴起[5]。通过黏膜免疫途径将表达出的FMD VP1与霍乱毒素b亚单位结合后免疫猪和小鼠，发现黏膜免疫能够诱导产生IgA，以半数感染量的剂量对猪攻毒后，保护率可达80%[6]。以牛IL6基因作为黏膜分子佐剂，通过鼻免疫将制备好的吸附壳聚糖PLGA纳米/微球载FMD DNA疫苗免疫豚鼠，保护率可达60%[7]。将构建好的吸附壳聚糖海藻糖载FMD灭活抗原纳米微球和吸附壳聚糖载聚乳酸-羟基乙酸共聚物载FMD质粒纳米微球分别鼻黏膜免疫牛，结果发现2种纳米微球都能诱导局部的鼻黏膜免疫应答，且还能诱导机体产生系统性的体液免疫和细胞免疫应答[8]。特别是乳酸杆菌活载体疫苗的研究进入高速发展时期，多种表达系统被构建，多种外源蛋白及抗原被表达。相信不久的将来以乳酸杆菌为代表的黏膜免疫新型疫苗的研制会有质的突变，并将给FMD的防控带来新的革命。 43卷21期王 淼等重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达
FMDV 的VP1基因编码的蛋白带有诱导FMD免疫反应的关键表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸，是编码FMDVVP蛋白的免疫原性基因。其多肽序列上含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（ArgGlyAsp），即RGD序列，是病毒吸附宿主细胞所必须的氨基酸序列。通过基因工程表达出来VP1编码的蛋白能够诱导与感染性FMD病毒粒子相同的免疫作用。围绕VP1分子，目前研究较热的FMD基因工程疫苗包括亚单位疫苗、可饲疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等。
抗原受体菌株有多种可以选择，沙门氏菌、李氏杆菌等减毒细菌常被应用于递呈抗原，但这些菌株却有毒力返祖的潜在危险。而乳酸菌是人和动物肠道内正常存在的菌群，抑制腐败菌生长繁殖，调节肠道内微生态平衡，对宿主免疫系统有很强的调节功能，进入宿主体内能适应胃部酸性环境和耐受肠道内各种消化酶，能很好地在肠道内定植。质粒载体的作用是将目的DNA片段运送到受体细胞中，但如果質粒到达宿主洗白基因组内，就会造成基因紊乱、表达失控、细胞转型等不良后果。因此要选择研究透彻的表达系统[4]。
该试验所用的载体是研究和应用较多的pSIP411大肠
杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体。该研究构建的pSIP411VP1重组质粒在大肠杆菌BL21中进行表达，首要的原因是BL21是该载体的表达菌株，可以鉴定表达载体构建成功并测定是否具有表达功能，其次是因为该表达载体在大肠杆菌中的表达操作程序更容易，通过从BL21中提取出已鉴定表达成功的重组质粒导入到乳酸杆菌中进行表达，操作更具有目的性，为乳酸菌的表达进行了初步性探究，对重组大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pSIP411VP1的表达效果进行初期验证。该表达系统是乳酸菌表达系统，虽然不如大肠杆菌表达系统蛋白表达量高，但该系统诱导的是黏膜免疫，通过口服给药，在肠道相关淋巴组织处被M细胞递呈抗原或直接被抗原递呈细胞递呈，产生的是级联反应，很少的抗原量就可激发机体较强的免疫应答。
参考文献
[1]
PERRY B D，RICH K M.Poverty impacts of footandmouth disease and the poverty reduction implications of its control[J].Vet Rec，2007，160：238-241.
[2] LUDI A，RODRIGUEZ L.Novel approaches to footandmouth disease vaccine development[J].Dev Biol （Basel），2013，135：107-116.
[3] ZHANG Z，PAN L，DING Y，et al.Efficacy of synthetic peptide candidate vaccines against serotypeA footandmouth disease virus in cattle[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：1389-1398.
[4] KLEEREBEZEM M，BOEKHORST J，VAN KRANENBURG R.Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：1990-1995.
[5] OGRA P L，FADEN H，WELLIVER R C.Vaccination strategies for mucosal immune responses[J].Clin Microbiol Rev，2001，14：430-445.
[6] SONG H，WANG Z，ZHENG D，et al.A novel mucosal vaccine against footandmouth disease virus induces protection in mice and swine[J].Biotechnol Lett，2005，27：，1669-1674.
[7] WANG G，PAN L，ZHANG Y，et al.Intranasal delivery of cationic PLGA nano/microparticlesloaded FMDV DNA vaccine encoding IL6 elicited protective immunity against FMDV challenge[J].PLoS One，2011，6：27605.
[8] PAN L，ZHANG Z，LV J，et al.Induction of mucosal immune responses and protection of cattle against directcontact challenge by intranasal delivery with footandmouth disease virus antigen mediated by nanoparticles[J].Int J Nanomedicine，2014，9：5603-5618.
[目的]构建FMDV乳酸杆菌穿梭表达载体。[方法]从A型FMDV中克隆出VP1基因后，根据乳酸杆菌密码子偏好性对VP1进行优化，与表达载体pSIP411进行连接，并将连接产物转化到DH5α中筛选出阳性克隆菌，重组质粒酶切和PCR鉴定成功后再转化到BL21中，采用杆菌肽进行诱导表达。[结果]表达产物经SDSPAGE和Western blottmy 检测在24 kD处有明显的条带，证明VP1pSIP411重组表达载体构建成功并在BL21中成功表达。[结论]为后续乳酸杆菌表达VP1蛋白研究奠定了基础。
关键词口蹄疫病毒；VP1；pSIP；乳酸菌；大肠杆菌
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-025-03
口蹄疫（FootandMouth Disease，FMD）是一种高度传染性和经济破坏性的家畜疫病，能够引起家畜生产性能降低，患病仔畜高死亡率，对畜牧行业造成巨大损失。除对动物贸易的扰动外，FMD的暴发还会造成严重的经济和社会影响，包括对饲料行业、兽药行业和旅游相关产业的破坏。尤其重要的是，它制约了发展中国家的畜牧业发展，特别对无FMD病原的国家和地区能够造成巨大的经济损失。如2001年荷兰和英国、2007年英国暴发的FMD造成的惨重损失[1]。
FMD的病原是口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus， FMDV），是单链正义RNA病毒，属于微小RNA病毒科口蹄疫病毒属。病毒基因组全长约 8.5 kb，有 7 个血清型，即O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亚洲1型），型间无交叉保护。其开放阅读框由 L 基因、P1 结构蛋白基因（包括VP4、VP2、VP3、VP1基因）、P2非结构蛋白基因（包括2A、2B、2C基因）和P3非结构蛋白基因（3A、3B、3C、3D基因）组成。其中，VP1蛋白带有诱导FMD免疫反应的关键表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸。VP1基因全长636 nt，是编码FMDVVP1蛋白的免疫原性基因。围绕VP1分子，目前研究较热的FMD基因工程疫苗包括亚单位疫苗、可饲疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等[2-3]。
pSIP表达系统是目前研究最为深入、机理最为清楚、使用最为广泛的乳酸菌表达系统之一，能很好地表达外源性抗原，且以乳酸杆菌作为外源保护性抗原基因的受体菌株，可将乳酸菌的益生作用和表达外源功能抗原基因的特异性免疫功能相结合，最大程度地发挥免疫调节功能[4]。因此，构建重组FMDV VP1基因乳酸杆菌表达载体，是研究乳酸杆菌活载体疫苗的前体和保障。該试验旨在为后续乳酸杆菌表达VP1蛋白研究奠定基础。
1材料与方法
1.1毒株、菌株和载体
乳酸杆菌穿梭表达质粒pSIP411由挪威Nofima研究所的Lars Axelsson教授惠赠，大肠杆菌DH5α和BL21购自于TaKaRa公司，A型FMDV和猪FMDV阳性血清为中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室保存。
1.2主要试剂
T4 DNA连接酶、Nco I限制性内切酶、Xho I 限制性内切酶均购自NEB公司；Ex Taq DNA 聚合酶、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；红霉素购自amresco公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Millipore公司；HRP标记山羊抗猪IgG抗体购自美国Abbkine公司；预染蛋白质分子量标准购自北京康润诚业生物科技有限公司；革兰氏阳性菌质粒提取试剂盒购自北京索莱宝公司；革兰氏阴性菌质粒提取试剂盒购自上海捷瑞公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 试验方法
1.3.1
A型FMDV总RNA提取。 取于-70 ℃保存的猪水泡皮毒0.1 g，无菌条件下置于研钵中剪碎，加入适量石英砂后边研磨边加DMEM细胞培养液，研磨至无肉眼可见组织块时加双抗，收集后于4 ℃冰箱过夜。取上清后，按照Qiagen RNeasy Mini Kit （50） 说明书进行总RNA提取。相关器皿经高温烘烤，试剂、耗材均使用无RNase产品。
1.3.2
cDNA合成及A型FMDV VP1基因的扩增。通过比对NCBI上已经收录的A型FMDV VP1基因，利用软件Primer 5.0设计特异性引物。
VP1F： 5′GACATGTCCTCCTGCATCT3′；
VP1R： 5′CACAAATGTACAGGGATGGGT3′。
采用TaKaRa PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2.0 进行反转录和扩增VP1基因，按照表1程序进行。
利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。将PCR产物送至南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。
1.3.3
A型FMDV VP1基因序列分析。用DNA Star软件的MegAlign对VP1基因进行测序，测序结果与GenBank中的参考序列进行同源性比对。
1.3.4
目的基因的设计与合成。根据乳酸菌密码子偏好对VP1进行优化，改造后序列由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，并克隆到载体pUC57上。并在目的序列两侧加入限制性内切酶NcoI和XhoI的酶切位点。
1.3.5
重组表达载体的构建。将人工合成的含有pUC57VP1的大肠杆菌DH5α涂布于LB固体培养基（含有氨苄青霉素）上进行分离培养，37 ℃培养过夜。12 h后挑取单个菌落，于5 ml液体LB培养基（含氨苄青霉素），200 r/min、37 ℃振荡培养10～14 h。按照捷瑞公司革兰氏阴性菌质粒小提试剂盒说明书进行操作。 将含有pSIP411阳性质粒的乳酸球菌MG1363涂布于M17固体培养基（含有10 μg/ml Em）上，恒温箱37 ℃培养24～36 h。用无菌小枪头挑取单个菌落转接到5 ml M17液体培养基（含有10 μg/ml Em）中，37 ℃静置培养12 h。按照索莱宝公司革兰氏阳性菌质粒小提试剂盒说明书进行操作。
采用限制性内切酶NcoI和XhoI分别对VP1和pSIP411表达载体进行双酶切，37 ℃水浴5 h后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定成功之后胶回收，回收后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将回收后的VP1基因和pSIP411载体片段用T4 DNA连接酶进行连接。将重组质粒导入DH5α中进行扩增，在LB平板上挑取疑似阳性重组克隆子，分别接种于5 ml含200 μg/ml红霉素LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养12 h。然后进行重组质粒提取，将可能的阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。
1.3.6
A型FMDV VP1基因在大肠杆菌BL21中的表达。
经过双酶切鉴定和PCR鉴定均为阳性的BL21阳性克隆子接种于5 ml （含200 μg/ml Em） LB液体培养基中，2 000 r/min 、37 ℃培养12 h，将上述菌液以1∶100的接种率接种于10 ml LB液体培养基中，37 ℃培养至OD值为0.6～08，此时记为0 h诱导，在培养基中加入诱导物SppIP （100 ng/ml），之后每隔1 h取菌液至7 h。同样诱导含有空载体pSIP411的BL21，以此作对照，分别取2 ml各个时间收集的诱导菌液，12 000 r/min离心10 min，弃去上清留菌体沉淀，进行SDSPAGE电泳。
1.3.7
Westernblotting分析。SDSPAGE凝胶电泳后，进行电转。用PBS冲洗NC膜3次，然后将膜浸泡于含10%脱脂奶粉的PBST中，37 ℃摇动封闭2 h；封闭结束后PBST清洗NC膜3次，再加入1∶200稀释的猪抗FMDV A型血清，37 ℃轻摇孵育1 h；取出后用PBST清洗3次，每次15 min；洗完后加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗猪IgG，37 ℃轻摇孵育1 h，PBST清洗3次，每次15 min。将膜取出后进行ECL显色。
2 结果与分析
2.1VP1序列分析及密码子优化
用DNA Star软件的MegAlign对VP1基因测序结果与GenBank中的参考序列进行同源性比对，结果显示，该试验所用VP1序列与参考序列（KF450794、HQ116363、HQ268510、HQ116298、EU667455、HQ116293、EU667458、KC588943和F792355）核苷酸一致性均大于91%，其中与2013年广东茂名所分离的A型毒株核苷酸一致性达到99.5%（图1）。
对野生型VP1基因进行密码子优化，调整的序列占原序列的66.04%，从而使G+C含量由59.53%降低到47.49%，212個密码子中，改变140个密码子，优化密码子占66.04%。
2.2重组表达质粒的鉴定
使用XhoI和NcoI对含有已优化好VP1基因的重组质粒pUC57进行PCR鉴定和双酶切鉴定。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR扩增片段和酶切片段与预期大小一致（图2、3）。将已优化的VP1与pSIP411载体16 ℃连接过夜后，分别转化到大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞中，挑取的单个菌落提取质粒后进行PCR鉴定和双酶切鉴定。通过电泳鉴定目的片段大小与预期结果相符（图2）。
2.3重组大肠杆菌的SDSPAGE分析
将诱导的重组菌pSIP411VP1BL21和对照菌pSIP411BL21、未诱导的pSIP411VP1BL21处理进行SDSPAGE分析，结果表明，经诱导的重组菌pSIP411VP1BL21在24 kD处有一条模糊的条带，而对照菌pSIP411BL21和未诱导的pSIP411VP1BL21在24 kD处没有条带，说明重组菌pSIP411VP1BL21经诱导后表达了目的蛋白，但表达量很低，利用SDSPAGE观察效果不明显，进一步采用Western blotting进行鉴定，结果见图3。
2.4重组大肠杆菌的Western blotting结果鉴定
将诱导的重组菌pSIP411VP1BL21和对照菌pSIP411BL21、未诱导的pSIP411VP1BL21处理进行Western blotting分析，结果表明经诱导的重组菌pSIP411VP1BL21在24 kD处有一条明显的条带，而对照菌pSIP411BL21和未诱导的pSIP411VP1BL21在24 kD处没有条带，说明重组菌pSIP411VP1BL21经诱导后表达的目的蛋白具有反应原性（图4）。
2.经诱导的质粒pSIP411在BL21中的表达产物转印结果；3.未经诱导的重组质粒pSIP411VP1在BL21中的表达产物转印结果。
3结论与讨论
一直以来，FMD严重制约世界畜牧业的发展，尤其在FMD流行地区仍将传统疫苗免疫作为防控的主要措施。随着科学技术的进步，新型疫苗的研制也在迅猛发展，但仍处于试验探索阶段。将黏膜免疫应用在FMD疫苗的研究中也开始兴起[5]。通过黏膜免疫途径将表达出的FMD VP1与霍乱毒素b亚单位结合后免疫猪和小鼠，发现黏膜免疫能够诱导产生IgA，以半数感染量的剂量对猪攻毒后，保护率可达80%[6]。以牛IL6基因作为黏膜分子佐剂，通过鼻免疫将制备好的吸附壳聚糖PLGA纳米/微球载FMD DNA疫苗免疫豚鼠，保护率可达60%[7]。将构建好的吸附壳聚糖海藻糖载FMD灭活抗原纳米微球和吸附壳聚糖载聚乳酸-羟基乙酸共聚物载FMD质粒纳米微球分别鼻黏膜免疫牛，结果发现2种纳米微球都能诱导局部的鼻黏膜免疫应答，且还能诱导机体产生系统性的体液免疫和细胞免疫应答[8]。特别是乳酸杆菌活载体疫苗的研究进入高速发展时期，多种表达系统被构建，多种外源蛋白及抗原被表达。相信不久的将来以乳酸杆菌为代表的黏膜免疫新型疫苗的研制会有质的突变，并将给FMD的防控带来新的革命。 43卷21期王 淼等重组A型FMDV VP1基因乳酸杆菌穿梭表达质粒的构建及在大肠杆菌BL21中的表达
FMDV 的VP1基因编码的蛋白带有诱导FMD免疫反应的关键表位，包括VP1的141～160，200～213和21～40位氨基酸，是编码FMDVVP蛋白的免疫原性基因。其多肽序列上含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（ArgGlyAsp），即RGD序列，是病毒吸附宿主细胞所必须的氨基酸序列。通过基因工程表达出来VP1编码的蛋白能够诱导与感染性FMD病毒粒子相同的免疫作用。围绕VP1分子，目前研究较热的FMD基因工程疫苗包括亚单位疫苗、可饲疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等。
抗原受体菌株有多种可以选择，沙门氏菌、李氏杆菌等减毒细菌常被应用于递呈抗原，但这些菌株却有毒力返祖的潜在危险。而乳酸菌是人和动物肠道内正常存在的菌群，抑制腐败菌生长繁殖，调节肠道内微生态平衡，对宿主免疫系统有很强的调节功能，进入宿主体内能适应胃部酸性环境和耐受肠道内各种消化酶，能很好地在肠道内定植。质粒载体的作用是将目的DNA片段运送到受体细胞中，但如果質粒到达宿主洗白基因组内，就会造成基因紊乱、表达失控、细胞转型等不良后果。因此要选择研究透彻的表达系统[4]。
该试验所用的载体是研究和应用较多的pSIP411大肠
杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体。该研究构建的pSIP411VP1重组质粒在大肠杆菌BL21中进行表达，首要的原因是BL21是该载体的表达菌株，可以鉴定表达载体构建成功并测定是否具有表达功能，其次是因为该表达载体在大肠杆菌中的表达操作程序更容易，通过从BL21中提取出已鉴定表达成功的重组质粒导入到乳酸杆菌中进行表达，操作更具有目的性，为乳酸菌的表达进行了初步性探究，对重组大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pSIP411VP1的表达效果进行初期验证。该表达系统是乳酸菌表达系统，虽然不如大肠杆菌表达系统蛋白表达量高，但该系统诱导的是黏膜免疫，通过口服给药，在肠道相关淋巴组织处被M细胞递呈抗原或直接被抗原递呈细胞递呈，产生的是级联反应，很少的抗原量就可激发机体较强的免疫应答。
参考文献
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