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关键词菊花；花色嵌合体；差异蛋白质组；双向电泳；质谱分析
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-087-03
收稿日期20141126花色是观赏植物最重要的经济性状之一，花色的形成涉及体内复杂的生理代谢过程，受基因型及环境因素影响而呈现丰富多彩的花色表型[1]。近年来，有关观赏植物花色变异机理的研究主要集中在核酸分子水平上，如采用定量PCR技术探讨不同花色品种花色素代谢相关基因的差异表达情况[2-3]，而利用花色嵌合体进行差异蛋白质组研究相对较少。由于蛋白质组学技术在研究特定功能蛋白方面具有很强的针对性，能快速、直观、全面反映植物组织或细胞内的蛋白质种类、表达水平、修饰状态以及蛋白质之间的相互作用，有利于从整体水平上研究蛋白质的组成和调控规律[4]，迄今在拟南芥[5]、水稻[6]、玉米[7]等植物中已有较多研究。该研究供试的菊花花色嵌合体表现为紫红-黄色镶嵌，扦插繁殖时仍表现为嵌合性状。为探讨其花色变异的形成机理，笔者采用蛋白质凝胶电泳和生物质谱技术，分析与鉴定了嵌合花色相关的差异表达蛋白质，以便为阐明菊花花色变异的分子机理提供试验依据。
1材料与方法
1.1植物材料菊花花色嵌合体材料‘su07’取自苏州大学苗圃基地，在盛花期分别采取黄色和紫色花瓣，用蒸馏水洗净后，滤纸吸干水分备用。
1.2叶片和花瓣蛋白质的提取分别取黄色和紫色花瓣各1 g，液氮研磨后，参照文献[8]的方法提取蛋白质样品，重悬于适量样品缓冲液（8 mol/L尿素、2%CHAPS、15 mmol/L DTT、0.5% IPG Buffer）备用。
1.3蛋白质的双向电泳双向电泳的第1向为固相pH梯度等电聚焦电泳，采用IPGphor等电聚焦仪（GE公司）进行，IPG胶条长17 cm，pH3～10 （NL），蛋白质样品上样量为1 mg。水化时，用水化液（8 mol/L Urea，2% CHAPS，15 mmol/L DTT，0.5% IPG Buffer）补足至350 μl，根据IPG等电聚焦仪使用指南进行操作。等电聚焦结束后，IPG胶条平衡2次，每次15 min。平衡缓冲液Ⅰ为0.05 mol/L TrisHCl （pH8.8），6 mol/L Urea，30% 甘油，2% SDS，1% DTT；平衡缓冲液Ⅱ用1.25%碘乙酰胺代替DTT。第2向SDSPAGE的聚丙烯凝胶浓度为12%分离胶，电泳结束后，采用考马斯亮蓝R250进行染色。
1.4蛋白质点的质谱鉴定采用2DE图像分析软件Image Master 2D Platinum 5.0对凝胶图谱进行分析，从中选取差异蛋白质斑点，委托上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析和鉴定。
2结果与分析
2.1菊花嵌合体花瓣蛋白质的SDSPAGE分析供试的菊花花色嵌合体在不同枝条上发育形成2种不同颜色的花瓣，表现为“双色花”与“双色花瓣”类型，花色差异显著。从花瓣蛋白质的SDSPAGE图谱看（图1），紫色花瓣与黄色蛋白质的种类和含量差异较大，如在黄色花瓣中（图1P1），分子量73 kD、22 kD左右的蛋白质组分表达量较高，并多了一种分子量66 kD左右的蛋白组分，而在14～31 kD的低分子量区域内蛋白质组分的表达量较低。与此不同的是，不同花色花瓣着生部位的叶片蛋白质种类和含量几乎完全相同（图1L1、L2），说明两者在基因表达方面并无差异。
注：M.蛋白质分子量标准，L1.黄色菊花叶片，L2紫色菊花叶片，p1.黄色花瓣，p2.紫色菊花花瓣。
图1菊花叶片和花瓣蛋白质SDSPAGE图谱2.2菊花嵌合体花瓣蛋白质的双向电泳分析由于不同花色花瓣蛋白质的SDSPAGE图谱存在差异，该研究进一步应用双向电泳技术对黄色与紫色花瓣的蛋白质组分进行了分离与鉴定，其双向电泳结果见图2。由图2可知，花瓣蛋白质的2DE分离效果良好，蛋白质斑点主要分布在等电点pI 50～9.0、分子量31～97 kD。在黄色和紫色花瓣2DE图像中，分别检测到了500和523个蛋白斑点，其中匹配斑点474个，匹配率92.67%，其中表达量差异达到2倍及以上的蛋白斑点有139个。
2.3花色相关差异蛋白质的质谱分析与鉴定从表达差异2倍以上的斑点中，选择16个表达量较丰富且分离效果良好的蛋白质斑点进行MALDITOFTOF质谱分析，结果成功鉴定了其中的10个组分，可将其分为3种类型：①糖代谢相关蛋白，如甘油醛3磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、转酮醇酶等；②花色素代谢相关蛋白，如黄烷酮3羟化酶、查尔酮异构酶；③基因调控相关蛋白，如富含甘氨酸RNA结合蛋白、真核翻译起始因子、polyA结合蛋白等（表1）。
3讨论
植物性状是基因控制和环境影响的结果，而蛋白质既是图2菊花不同花色花瓣蛋白质的双向电泳图谱表1菊花花色差异相关蛋白质组分的鉴定结果
基因表达的最终产物，也参与基因的表达和调控。在该研究中，供试材料的双色花瓣具有相同的基因组结构，但2DE图谱显示的蛋白质表达谱及表达量存在一定差异，鉴定的10个差异蛋白质分别涉及到糖代谢、花色素代谢及基因调控等生命过程。
在鉴定的差异蛋白质中，F3H、CHI和SAMS与花色素合成直接相关，其中F3H是花色素苷合成过程中的关键酶，影响原花青素、花色素苷等的形成[9]。在该研究中，F3H在紫色花瓣中显示了特异表达的特征，表明嵌合花瓣在花色素苷合成代谢方面存在差异。其次，CHI是黄酮代谢途径中一个关键酶，降低或抑制CHI活性会使花色苷合成途径上游产物的积累和下游反应底物的缺乏[10]。在供试嵌合体的黄色花瓣中，CHI的表达量高于紫色花瓣，这与黄色花瓣的显色特点有关。另外，还检测到SAMS在紫色花瓣中的表达量明显高于黄色花瓣，而SAMS是植物体内的甲基供体，参与植物的转甲基反应[11- 12]，且有研究表明随着花色素甲基化和糖基化程度的增加，其共色效应也相应增加，从而加强花色素苷的呈色[13]，说明紫色表型与花色素苷的甲基化修饰有关。
此外，在鉴定的其他蛋白质中（表1），磷酸甘油酸变位酶、甘油醛3磷酸脱氢酶及转酮醇酶在糖代谢过程中起着重要作用[14]，但尚未见与菊花花瓣显色差异相关的报道，推测与花色素的糖基化有关；此外，鉴定的蛋白质如富含甘氨酸RNA结合蛋白、Poly（A）结合蛋白、真核细胞翻译起始因子涉及基因的表达调控，但对菊花嵌合体花色素合成相关基因表达的作用机理目前尚不清楚，有待今后进一步研究。
参考文献
[1] 王小菁，孟祥春，彭建宗. 花色形成与花生长的调控[J]. 西北植物学报，2003，23（7）：1105-1110.
[2] 葛静，严海燕. 花色素苷形成中的基因表达和调控[J]. 植物生理学通讯， 2006，42（2）：374-379.
[3] 张玉进，孟祥春，潘瑞炽，等. 非洲菊苯基苯乙烯酮合成酶CHS基因表达模式的初步研究[J]. 华南农业大学学报：自然科学版， 2002，23（2）：89-90.
[4] 高华，高述民，孙芳芳. 蛋白质组学及其在植物研究中的应用[J]. 安徽农学通报，2010，16（8）：31-32.
[5] LINDERMAYR C， SAALBACH G， DUNIER J. Proteomic identification of nitrosylated proteins in Ara Mdopsis [J]. Plant Physiology，2005，137（3）：921-930.
[6] 柴小清，靳飞，张艳萍，等. 缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析[J]. 首都师范大学学报， 2004，25（3）：46-51.
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-087-03
收稿日期20141126花色是观赏植物最重要的经济性状之一，花色的形成涉及体内复杂的生理代谢过程，受基因型及环境因素影响而呈现丰富多彩的花色表型[1]。近年来，有关观赏植物花色变异机理的研究主要集中在核酸分子水平上，如采用定量PCR技术探讨不同花色品种花色素代谢相关基因的差异表达情况[2-3]，而利用花色嵌合体进行差异蛋白质组研究相对较少。由于蛋白质组学技术在研究特定功能蛋白方面具有很强的针对性，能快速、直观、全面反映植物组织或细胞内的蛋白质种类、表达水平、修饰状态以及蛋白质之间的相互作用，有利于从整体水平上研究蛋白质的组成和调控规律[4]，迄今在拟南芥[5]、水稻[6]、玉米[7]等植物中已有较多研究。该研究供试的菊花花色嵌合体表现为紫红-黄色镶嵌，扦插繁殖时仍表现为嵌合性状。为探讨其花色变异的形成机理，笔者采用蛋白质凝胶电泳和生物质谱技术，分析与鉴定了嵌合花色相关的差异表达蛋白质，以便为阐明菊花花色变异的分子机理提供试验依据。
1材料与方法
1.1植物材料菊花花色嵌合体材料‘su07’取自苏州大学苗圃基地，在盛花期分别采取黄色和紫色花瓣，用蒸馏水洗净后，滤纸吸干水分备用。
1.2叶片和花瓣蛋白质的提取分别取黄色和紫色花瓣各1 g，液氮研磨后，参照文献[8]的方法提取蛋白质样品，重悬于适量样品缓冲液（8 mol/L尿素、2%CHAPS、15 mmol/L DTT、0.5% IPG Buffer）备用。
1.3蛋白质的双向电泳双向电泳的第1向为固相pH梯度等电聚焦电泳，采用IPGphor等电聚焦仪（GE公司）进行，IPG胶条长17 cm，pH3～10 （NL），蛋白质样品上样量为1 mg。水化时，用水化液（8 mol/L Urea，2% CHAPS，15 mmol/L DTT，0.5% IPG Buffer）补足至350 μl，根据IPG等电聚焦仪使用指南进行操作。等电聚焦结束后，IPG胶条平衡2次，每次15 min。平衡缓冲液Ⅰ为0.05 mol/L TrisHCl （pH8.8），6 mol/L Urea，30% 甘油，2% SDS，1% DTT；平衡缓冲液Ⅱ用1.25%碘乙酰胺代替DTT。第2向SDSPAGE的聚丙烯凝胶浓度为12%分离胶，电泳结束后，采用考马斯亮蓝R250进行染色。
1.4蛋白质点的质谱鉴定采用2DE图像分析软件Image Master 2D Platinum 5.0对凝胶图谱进行分析，从中选取差异蛋白质斑点，委托上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱分析和鉴定。
2结果与分析
2.1菊花嵌合体花瓣蛋白质的SDSPAGE分析供试的菊花花色嵌合体在不同枝条上发育形成2种不同颜色的花瓣，表现为“双色花”与“双色花瓣”类型，花色差异显著。从花瓣蛋白质的SDSPAGE图谱看（图1），紫色花瓣与黄色蛋白质的种类和含量差异较大，如在黄色花瓣中（图1P1），分子量73 kD、22 kD左右的蛋白质组分表达量较高，并多了一种分子量66 kD左右的蛋白组分，而在14～31 kD的低分子量区域内蛋白质组分的表达量较低。与此不同的是，不同花色花瓣着生部位的叶片蛋白质种类和含量几乎完全相同（图1L1、L2），说明两者在基因表达方面并无差异。
注：M.蛋白质分子量标准，L1.黄色菊花叶片，L2紫色菊花叶片，p1.黄色花瓣，p2.紫色菊花花瓣。
图1菊花叶片和花瓣蛋白质SDSPAGE图谱2.2菊花嵌合体花瓣蛋白质的双向电泳分析由于不同花色花瓣蛋白质的SDSPAGE图谱存在差异，该研究进一步应用双向电泳技术对黄色与紫色花瓣的蛋白质组分进行了分离与鉴定，其双向电泳结果见图2。由图2可知，花瓣蛋白质的2DE分离效果良好，蛋白质斑点主要分布在等电点pI 50～9.0、分子量31～97 kD。在黄色和紫色花瓣2DE图像中，分别检测到了500和523个蛋白斑点，其中匹配斑点474个，匹配率92.67%，其中表达量差异达到2倍及以上的蛋白斑点有139个。
2.3花色相关差异蛋白质的质谱分析与鉴定从表达差异2倍以上的斑点中，选择16个表达量较丰富且分离效果良好的蛋白质斑点进行MALDITOFTOF质谱分析，结果成功鉴定了其中的10个组分，可将其分为3种类型：①糖代谢相关蛋白，如甘油醛3磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、转酮醇酶等；②花色素代谢相关蛋白，如黄烷酮3羟化酶、查尔酮异构酶；③基因调控相关蛋白，如富含甘氨酸RNA结合蛋白、真核翻译起始因子、polyA结合蛋白等（表1）。
3讨论
植物性状是基因控制和环境影响的结果，而蛋白质既是图2菊花不同花色花瓣蛋白质的双向电泳图谱表1菊花花色差异相关蛋白质组分的鉴定结果
基因表达的最终产物，也参与基因的表达和调控。在该研究中，供试材料的双色花瓣具有相同的基因组结构，但2DE图谱显示的蛋白质表达谱及表达量存在一定差异，鉴定的10个差异蛋白质分别涉及到糖代谢、花色素代谢及基因调控等生命过程。
在鉴定的差异蛋白质中，F3H、CHI和SAMS与花色素合成直接相关，其中F3H是花色素苷合成过程中的关键酶，影响原花青素、花色素苷等的形成[9]。在该研究中，F3H在紫色花瓣中显示了特异表达的特征，表明嵌合花瓣在花色素苷合成代谢方面存在差异。其次，CHI是黄酮代谢途径中一个关键酶，降低或抑制CHI活性会使花色苷合成途径上游产物的积累和下游反应底物的缺乏[10]。在供试嵌合体的黄色花瓣中，CHI的表达量高于紫色花瓣，这与黄色花瓣的显色特点有关。另外，还检测到SAMS在紫色花瓣中的表达量明显高于黄色花瓣，而SAMS是植物体内的甲基供体，参与植物的转甲基反应[11- 12]，且有研究表明随着花色素甲基化和糖基化程度的增加，其共色效应也相应增加，从而加强花色素苷的呈色[13]，说明紫色表型与花色素苷的甲基化修饰有关。
此外，在鉴定的其他蛋白质中（表1），磷酸甘油酸变位酶、甘油醛3磷酸脱氢酶及转酮醇酶在糖代谢过程中起着重要作用[14]，但尚未见与菊花花瓣显色差异相关的报道，推测与花色素的糖基化有关；此外，鉴定的蛋白质如富含甘氨酸RNA结合蛋白、Poly（A）结合蛋白、真核细胞翻译起始因子涉及基因的表达调控，但对菊花嵌合体花色素合成相关基因表达的作用机理目前尚不清楚，有待今后进一步研究。
参考文献
[1] 王小菁，孟祥春，彭建宗. 花色形成与花生长的调控[J]. 西北植物学报，2003，23（7）：1105-1110.
[2] 葛静，严海燕. 花色素苷形成中的基因表达和调控[J]. 植物生理学通讯， 2006，42（2）：374-379.
[3] 张玉进，孟祥春，潘瑞炽，等. 非洲菊苯基苯乙烯酮合成酶CHS基因表达模式的初步研究[J]. 华南农业大学学报：自然科学版， 2002，23（2）：89-90.
[4] 高华，高述民，孙芳芳. 蛋白质组学及其在植物研究中的应用[J]. 安徽农学通报，2010，16（8）：31-32.
[5] LINDERMAYR C， SAALBACH G， DUNIER J. Proteomic identification of nitrosylated proteins in Ara Mdopsis [J]. Plant Physiology，2005，137（3）：921-930.
[6] 柴小清，靳飞，张艳萍，等. 缺铁逆境胁迫下水稻叶蛋白质组的双向电泳分析[J]. 首都师范大学学报， 2004，25（3）：46-51.