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摘 要：连续3d给小鼠腹腔注射淀粉液，诱导并激活巨噬细胞，使用鱼红细胞为吞噬物，替代细胞实验教材所用的鸡红细胞、羊红细胞，探索和改进实验方法，以便更清晰、有效地观察小鼠腹腔巨噬细胞对外来异物的吞噬作用。取鼠腹腔液制备涂片并固定，用Giemsa染色法进行染色，显微观察巨噬细胞对鱼红细胞的吞噬作用。结果显示，采用鱼红细胞作为吞噬物，细胞染色清晰，吞噬结果明显，可清晰显示大量吞噬鱼红细胞的巨噬细胞，吞噬百分率高，便于实验观察和计数，有助于学生对巨噬细胞吞噬作用的理解和掌握。
关键词：巨噬细胞；鱼红细胞；实验方法；吞噬
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）23-17-02
高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干细胞分化而来，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。当病原微生物或其他异物侵入机体时，由于巨噬细胞具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。静息的巨噬细胞吞噬功能低下，只有活化状态下的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力。现在所用细胞实验教材[1-4]所编列吞噬实验大多用鸡红细胞、羊红细胞、墨水、杆菌[5]、荧光微球等作为吞噬物，本文首次使用鱼血细胞作为吞噬物，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬效果进行了探索和研究，以期避免使用家禽作为实验材料，并进一步完善了实验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 鱼血红细胞稀释液的制备 从市场上购买鲫鱼，用注射器尾静脉采血，或解剖后从鱼血窦或心脏抽取鱼血。抽取的鱼血，不添加抗凝剂，直接用无血清L15培养基（Gibco，invitrogen Corporation），稀释10倍。配成10%鱼血红细胞悬液备用。
1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制备 称取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理盐水中，混匀后121℃高压灭菌20min备用。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导 在实验前3d，连续3d定时给小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持针以45°斜角刺入，注意勿伤及内脏或注入肠内，注射后揉动腹部，分散淀粉粒，并观察注射后动物状态，以免小鼠死亡。
1.2.2 鱼红细胞的注射及腹腔液的收集 实验时，小鼠腹腔注射10%鱼红细胞悬液1mL，轻按小鼠腹部，使悬液分散。60min后，用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齿尖镊夹起皮肤层，用剪刀剪一环口，撕开腹部皮肤，充分暴露腹膜。此时，向腹腔注射1mL生理盐水，并轻揉腹部片刻。随后用剪刀剪开腹膜成一纵形口，用镊子将两边皮肤夹起来，以防腹腔液流出。把内脏推向一侧后，可用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔内血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血细胞。
1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于洁净的载玻片上，按血涂片制备法制备细胞涂片。空气干燥后，载片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的载片，采用扣染法，即用牙签架起载片，细胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸缓冲液9份）染色载片，染色时间为20min。染色完成后，揭起载片，用滴管吸取蒸馏水轻缓冲洗载片，洗去多余的染液。
1.2.4 显微观察及吞噬百分率和吞噬指数的计算 载片空气干燥后，在OLympus BX41显微镜下观察，用DP70摄像头进行显微拍摄，并用IPP5.0软件进行显微照片标尺标记。40倍物镜下已能观察到游离的鱼红细胞及吞噬鱼红细胞的巨噬细胞。实验共用小鼠5只，实验过程中未出现死亡，每只小鼠制备5片涂片。每片随机观察数个视野，记录100个吞噬细胞的吞噬结果，计算吞噬百分率、吞噬指数。吞噬百分率（%）=吞噬鱼红细胞的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指数=巨噬细胞中所吞噬的鱼红细胞数/计数的总巨噬细胞数。
2 实验结果
2.1 巨噬细胞吞噬状态 在普通光学显微镜下，可清晰观察到主要的三类细胞，鱼红细胞、未吞噬鱼红细胞的巨噬细胞（图1中1）及吞噬一个或数个鱼红细胞的巨噬细胞（图1中2～4）。鲫鱼红细胞多为长椭圆形，核常位于细胞中部，胞核染为深紫色。巨噬细胞大多呈不规则形状，胞体表面不光滑，常有突触，细胞核较大，呈肾形、圆形或其他不规则形状，染为紫红色。巨噬细胞吞噬鱼红细胞，常能观察到以下几种吞噬状态：巨噬细胞内鱼红细胞膜仍完整；巨噬细胞内鱼红细胞膜不完整或破裂；巨噬细胞内具有一个或数个大小不等的鱼红细胞细胞核；还可观察到巨噬细胞膜凹陷，鱼红细胞紧贴在凹陷处正在被吞噬。图1显示激活状态的巨噬细胞及多种吞噬鱼红细胞的状态。
2.2 吞噬率和吞噬指数 实验测得小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鱼红细胞的吞噬率为25.0%，吞噬指数为0.31。与鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数相近[6-7]。
3 讨论
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验是生物科学及医学专业本科层次细胞生物学课程开设的实验必修项目。近年来，由于禽流感[8]的流行，细胞生物学教学实验室通过多次试验、反复摸索和研究“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验”这一实验内容，在传统方法的基础上不断改进。主要的改进有以下3个方面：一是采用小鼠实验前连续3d定时免疫，有效增加了腹腔内处于激活状态的巨噬细胞数量。二是取鱼血红细胞作为吞噬物，且所取鱼血不用添加抗凝剂，直接用不加血清的L15细胞培养液来稀释血细胞，实验效果明显，完全符合实验要求。三是染色方法的好坏直接关系到对实验结果的观察，本实验应用Giemsa染色扣染法，巨噬细胞及鱼红细胞染色均清晰，细胞的形态结构更加明显，能有效地分辨各类细胞的细胞核、细胞浆及吞噬鱼红细胞的各种状态。此实验方法已用于我院本科生实验教学，师生们普遍认为实验结果便于学生观察和计数，有助于学生对吞噬细胞吞噬作用的理解和掌握，提高教学效果。
综上所述，采用鱼血细胞作为吞噬物，实验结果明显，吞噬率及吞噬指数均高于或接近于鸡红细胞的数据，并进一步完善了实验方法，实验结果更直观与清晰。同时巨噬细胞吞噬实验常用于免疫增强药物活性的测定，其中以体内法最能反应实际吞噬能力，这一方法常用鸡红细胞来进行测定，是否也可用便于取材的鱼红细胞来测定，值得进一步实验和探讨。
参考文献
[1]李素文.细胞生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2001.
[2]王金发，何炎明.细胞生物学实验教程[M].北京：科学出版社，2004.
[3]桑建利，谭信.细胞生物学实验指导[M].北京：科学出版社，2010.
[4]杨汉民.细胞生物学实验·二版[M].北京：高等教育出版社，1997.
[5]朱兆玲，周红，李美玉，等.吞噬细胞吞噬作用实验方法的改进[J].临床医学工程，2012，19（4）：524-525.
[6]张华，曲震寰，王莹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定[J].黑龙江医药科学，2007，30（5）：9.
[7]汤城，薛雅蓉，余飞，等.一种检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性新方法的建立[J].畜牧与兽医，2005，37（11）：47-48.
[8]徐德忠，张扬，王波，等.人感染H7N9禽流感分布异常及其异常起源之可能[J].中华疾病控制杂志，2013，17（8）：645-650.
（责编：施婷婷）
关键词：巨噬细胞；鱼红细胞；实验方法；吞噬
中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）23-17-02
高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干细胞分化而来，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。当病原微生物或其他异物侵入机体时，由于巨噬细胞具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解，这在机体非特异性免疫中具有重要意义。静息的巨噬细胞吞噬功能低下，只有活化状态下的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力。现在所用细胞实验教材[1-4]所编列吞噬实验大多用鸡红细胞、羊红细胞、墨水、杆菌[5]、荧光微球等作为吞噬物，本文首次使用鱼血细胞作为吞噬物，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬效果进行了探索和研究，以期避免使用家禽作为实验材料，并进一步完善了实验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 鱼血红细胞稀释液的制备 从市场上购买鲫鱼，用注射器尾静脉采血，或解剖后从鱼血窦或心脏抽取鱼血。抽取的鱼血，不添加抗凝剂，直接用无血清L15培养基（Gibco，invitrogen Corporation），稀释10倍。配成10%鱼血红细胞悬液备用。
1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制备 称取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理盐水中，混匀后121℃高压灭菌20min备用。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的诱导 在实验前3d，连续3d定时给小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持针以45°斜角刺入，注意勿伤及内脏或注入肠内，注射后揉动腹部，分散淀粉粒，并观察注射后动物状态，以免小鼠死亡。
1.2.2 鱼红细胞的注射及腹腔液的收集 实验时，小鼠腹腔注射10%鱼红细胞悬液1mL，轻按小鼠腹部，使悬液分散。60min后，用颈椎脱臼法处死小鼠。将小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齿尖镊夹起皮肤层，用剪刀剪一环口，撕开腹部皮肤，充分暴露腹膜。此时，向腹腔注射1mL生理盐水，并轻揉腹部片刻。随后用剪刀剪开腹膜成一纵形口，用镊子将两边皮肤夹起来，以防腹腔液流出。把内脏推向一侧后，可用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔内血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血细胞。
1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于洁净的载玻片上，按血涂片制备法制备细胞涂片。空气干燥后，载片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的载片，采用扣染法，即用牙签架起载片，细胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸缓冲液9份）染色载片，染色时间为20min。染色完成后，揭起载片，用滴管吸取蒸馏水轻缓冲洗载片，洗去多余的染液。
1.2.4 显微观察及吞噬百分率和吞噬指数的计算 载片空气干燥后，在OLympus BX41显微镜下观察，用DP70摄像头进行显微拍摄，并用IPP5.0软件进行显微照片标尺标记。40倍物镜下已能观察到游离的鱼红细胞及吞噬鱼红细胞的巨噬细胞。实验共用小鼠5只，实验过程中未出现死亡，每只小鼠制备5片涂片。每片随机观察数个视野，记录100个吞噬细胞的吞噬结果，计算吞噬百分率、吞噬指数。吞噬百分率（%）=吞噬鱼红细胞的巨噬细胞数/计数的总巨噬细胞数（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指数=巨噬细胞中所吞噬的鱼红细胞数/计数的总巨噬细胞数。
2 实验结果
2.1 巨噬细胞吞噬状态 在普通光学显微镜下，可清晰观察到主要的三类细胞，鱼红细胞、未吞噬鱼红细胞的巨噬细胞（图1中1）及吞噬一个或数个鱼红细胞的巨噬细胞（图1中2～4）。鲫鱼红细胞多为长椭圆形，核常位于细胞中部，胞核染为深紫色。巨噬细胞大多呈不规则形状，胞体表面不光滑，常有突触，细胞核较大，呈肾形、圆形或其他不规则形状，染为紫红色。巨噬细胞吞噬鱼红细胞，常能观察到以下几种吞噬状态：巨噬细胞内鱼红细胞膜仍完整；巨噬细胞内鱼红细胞膜不完整或破裂；巨噬细胞内具有一个或数个大小不等的鱼红细胞细胞核；还可观察到巨噬细胞膜凹陷，鱼红细胞紧贴在凹陷处正在被吞噬。图1显示激活状态的巨噬细胞及多种吞噬鱼红细胞的状态。
2.2 吞噬率和吞噬指数 实验测得小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鱼红细胞的吞噬率为25.0%，吞噬指数为0.31。与鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数相近[6-7]。
3 讨论
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验是生物科学及医学专业本科层次细胞生物学课程开设的实验必修项目。近年来，由于禽流感[8]的流行，细胞生物学教学实验室通过多次试验、反复摸索和研究“小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验”这一实验内容，在传统方法的基础上不断改进。主要的改进有以下3个方面：一是采用小鼠实验前连续3d定时免疫，有效增加了腹腔内处于激活状态的巨噬细胞数量。二是取鱼血红细胞作为吞噬物，且所取鱼血不用添加抗凝剂，直接用不加血清的L15细胞培养液来稀释血细胞，实验效果明显，完全符合实验要求。三是染色方法的好坏直接关系到对实验结果的观察，本实验应用Giemsa染色扣染法，巨噬细胞及鱼红细胞染色均清晰，细胞的形态结构更加明显，能有效地分辨各类细胞的细胞核、细胞浆及吞噬鱼红细胞的各种状态。此实验方法已用于我院本科生实验教学，师生们普遍认为实验结果便于学生观察和计数，有助于学生对吞噬细胞吞噬作用的理解和掌握，提高教学效果。
综上所述，采用鱼血细胞作为吞噬物，实验结果明显，吞噬率及吞噬指数均高于或接近于鸡红细胞的数据，并进一步完善了实验方法，实验结果更直观与清晰。同时巨噬细胞吞噬实验常用于免疫增强药物活性的测定，其中以体内法最能反应实际吞噬能力，这一方法常用鸡红细胞来进行测定，是否也可用便于取材的鱼红细胞来测定，值得进一步实验和探讨。
参考文献
[1]李素文.细胞生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2001.
[2]王金发，何炎明.细胞生物学实验教程[M].北京：科学出版社，2004.
[3]桑建利，谭信.细胞生物学实验指导[M].北京：科学出版社，2010.
[4]杨汉民.细胞生物学实验·二版[M].北京：高等教育出版社，1997.
[5]朱兆玲，周红，李美玉，等.吞噬细胞吞噬作用实验方法的改进[J].临床医学工程，2012，19（4）：524-525.
[6]张华，曲震寰，王莹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定[J].黑龙江医药科学，2007，30（5）：9.
[7]汤城，薛雅蓉，余飞，等.一种检测巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性新方法的建立[J].畜牧与兽医，2005，37（11）：47-48.
[8]徐德忠，张扬，王波，等.人感染H7N9禽流感分布异常及其异常起源之可能[J].中华疾病控制杂志，2013，17（8）：645-650.
（责编：施婷婷）