论文部分内容阅读
摘 要 为快速、准确地鉴别中粒种与小粒种咖啡，以不同种源的中粒种和小粒种咖啡为试验材料，对514对SSR引物进行中、小粒种咖啡种间特异性引物筛选，最终筛选到1对特异性引物，该引物在小粒种咖啡样本中扩增出90 bp和110 bp双带产物，而在中粒种咖啡样本中只扩增出90 bp或100 bp的单带产物，根据产物条带的数目即可对中粒种和小粒种咖啡进行鉴别。经随机抽取中、小粒种咖啡样本进行种类鉴别准确性验证，验证结果与实际结果一致。
关键词 中粒种咖啡；小粒种咖啡；SSR；鉴别
中图分类号 S571.2 文献标识码 A
Distinguishing Analysis Between Coffea canephora and
C. arabica Species by SSR Markers
WANG Xiaoyang1， DONG Yunping1 *， HUANG Lifang1， YAN Lin1
ZHOU Hua2， CHEN Jinhuan3， SUN Yan1， LIN Xingjun1
1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，
Ministry of Agriculture / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice
and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China
2 Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan 678600， China
3 Tropical and Subtropical Economic Crops Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Baoshan，
Yunnan 678025， China
Abstract This study was conducted to provide an efficient method to distinguish between C. canephora and C. arabica. One pair of coffee species-specific SSR primers were selected from 514 pairs of SSR primers. The results of PCR amplifying analysis demonstrated that two fragments of 90 and 110 bp from C. arabica and one fragment of 90 or 100 bp from C. canephora were respectively amplified by the primers， meaning C. arabica and C. Canephora coffee could be identified according to the number of amplified fragments. The result of the method was proved to be reliable through our verification test.
Key words Coffea canephora； Coffea arabica； SSR； Distinguishing
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.002
咖啡为世界三大饮料之首，是国际贸易中非常重要的原料产品[1-2]。咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）植物，该属植物共100多种，而生产性栽培的主要为小粒种和中粒种，小粒种约占栽培面积的70%，中粒种约占30%[3-5]。小粒种咖啡因其品质优于中粒种咖啡，其国际市场交易价格也经常是中粒种咖啡的2～3倍，因此，在咖啡贸易过程中常常出现将中粒种咖啡冒充小粒种咖啡进行销售的不法行为，损害消费者的利益[6]；另外，两种咖啡适合种植的生长环境也有差异，小粒种适合种植于高海拔温热地带，而中粒种适合种植于低海拔的高温湿热地区，如果两种咖啡的种子或苗木发生混淆，则会造成咖啡减产并影响咖啡品质，给咖啡种植者带来很大影响[7-8]。因此，生产和市场贸易上急需一种快速、方便、可靠的鉴别中、小粒种咖啡的检测方法。
传统方法鉴别中、小粒种咖啡主要通过将咖啡培炒后进行杯品品尝，这种方法容易受主观人为因素及培炒条件等影响，鉴别结果不准确，且需要专业杯品师参与，可操作性差。现有中、小粒种咖啡鉴别技术主要包括化学分析法及DNA分子标记检测法。化学分析法主要基于两种咖啡内含特定化学物质含量存在差异，通过测定这些化学物质含量，如固醇类、脂肪酸、绿原酸及咖啡因等，再与标准样品进行比较鉴别，由于这类化学物质含量都处于一个幅度范围，没有固定值，且含量差异不是十分明显，同时，某些化学物质含量容易受栽培条件、代谢生理等因素的影响，检测结果精确性较差[9-11]。
基于检测DNA分子水平多态性的分子标记技术的发展为种间鉴别提供了有效途径，DNA分子标记可以直接反映DNA水平上的遗传多态性，表现为核苷酸序列上的差异，这种方法不受人为及环境因素的影响，检测结果非常精确。在所有分子标记中，SSR分子标记由于具有染色体上分布均匀、多态性丰富、共显性、分辨率高和易于检测等优点，自开发以来就成为最为有效构建许多作物指纹图谱的工具，被广泛应用于品种鉴定等方面[12-14]。目前尚未有利用SSR 分子标记鉴别咖啡种类的方法，因此，本研究拟开发出一种利用SSR分子标记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡的方法，为咖啡生产上种子、苗木种类鉴定及咖啡市场贸易中产品的真伪鉴别提供有效的工具。 1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为中粒种和小粒种咖啡不同种质叶片，分别取自中国热带农业科学院香料饮料研究所（以下简称“香饮所”）、云南省德宏热带农业科学研究所（以下简称“德热所”）和云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（以下简称“热经所”）咖啡种质资源圃。材料分两部分，一部分用于筛选中粒种、小粒种咖啡种间特异性SSR引物（表1），另一部分用于验证所筛选引物在中粒种与小粒种之间的种间特异性。取上述种质样本的新鲜无病斑嫩叶，置于-70 ℃超低温冰箱保存备用或利用硅胶干燥剂干样保存。
1.2 方法
2 结果与分析
2.1 引物初筛
特异性引物筛选所用引物来源于文献及数据库已发表、公布的咖啡种属特异性SSR引物[15-24]，共514对。利用中、小粒种咖啡样本各2个（中粒种：越南、泰国；小粒种：卡蒂姆7963、铁毕卡）进行筛选，剔除无扩增产物或无多态性引物，选留扩增条带清晰、重复性好、种内一致性较高、种间差别明显的引物作为候选引物，初步筛选出种间特异性候选引物10对（图1）。
2.2 引物复筛
利用中、小粒种咖啡样本各20个，对初步筛选出的10对SSR引物进行复筛，最终筛选出中、小粒种咖啡种间特异性SSR引物1对，引物名称为：SSR124195，引物序列为：Forward primer（5′-3′）：ATCCCCATCAGAAGACCTCA；Reverse primer（5′-3′）：CCTCCACCGCCTGTTTATTA。该引物在小粒种咖啡样本中扩增出90 bp和110 bp双带产物，而在中粒种咖啡样本中只扩增出90 bp或100 bp的单带产物（图2），因此，根据产物条带的数目即可对中粒种和小粒种咖啡进行鉴别，即双带为小粒种咖啡，单带为中粒种咖啡。中、小粒种咖啡样本及SSR124195对样本的扩增情况见表2。
2.3 种属鉴别验证
田间随机抽取中、小粒种咖啡样本各23份，利用SSR124195引物进行种属鉴别，结果显示，中粒种样本扩增条带全部为90 bp或100 bp的单带产物（图3），小粒种全部为90 bp和110 bp的双带产物（图4），验证结果与实际结果一致。
3 讨论与结论
分子标记技术因直接检测DNA分子水平上的遗传差异，不受人为及环境因素的影响，相比其他鉴别中、小粒种咖啡的方法，分子标记在检测精度上具有非常明显的优势。Spaniolas[25]等利用PCR-RFLP技术对中、小粒种咖啡进行了鉴别研究。该方法基于咖啡trnL-trnF基因中长度为251 bp的一段序列，该序列包含一限制性酶切位点，能够被限制性酶Psul酶切成92和159 bp两个片段。小粒种在该酶切位点上存在1个SNP，因而不能被酶切，电泳检测结果为251 bp一条条带，而中粒种不存在该SNP，电泳检测结果为92和195 bp两条条带，因此，根据酶切后电泳检测结果能够很好地区分中、小粒种咖啡，然而，该方法因检测过程中需要使用限制性酶酶切，操作过程复杂且成本较高，在使用上受到较大限制。与前人的方法相比，本研究操作简便、快速，且重复性好、鉴定结果准确可靠，具有较好的应用前景。
本研究筛选出的SSR124195引物为中粒种、小粒种咖啡的鉴别提供了一种有效途径，如何保证鉴别效果的准确性和稳定性是本研究最为关心的问题，这就要求引物筛选所采用的样本必须具有足够的信息量和代表性。本研究采用的中、小粒种咖啡样本均取自中国热带农业科学院香料饮料研究所、云南省德宏热带农业科学研究所和云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所三家国内最主要的咖啡种质资源保存单位，收集保存了国内外大部分咖啡主栽品种及遗传资源，样本具有足够的信息量和广泛的代表性。本研究引物筛选及鉴别验证所用样本既包括了当前国内外咖啡主栽品种，如小粒种的卡帝莫7963、卡杜拉、T5175、T8667、波邦、铁毕卡，中粒种的6号、24号、26号、兴28等，这增加了所筛选引物在咖啡商品贸易真伪及种子、苗木种属类别鉴别过程中的适用性；同时也包括了不同种源、不同性状，遗传差异显著的种质样本，如来自巴西、哥伦比亚、危地马拉、墨西哥、坦桑尼亚、厄瓜多尔、巴布亚新几内亚、哥斯达黎加、夏威夷、澳大利亚、肯尼亚等国家的不同种源及黄果、紫叶、矮种等性状显著差异的样本，提高了所筛选引物的可靠性和稳定性。
参考文献
[1] 黄家雄， 李贵平. 中国咖啡遗传育种研究进展[J]. 西南农业学报， 2008， 21（4）： 1 178-1 181.
[2] Davis A P， Tosh J， Ruch N， et al. Growing coffee： On the bases of plastid and nuclear DNA sequenes； implication for the size， morphology， distribution and evolutionary history of coffea[J]. Botanical J. Linnean soc， 2011， 167（4）： 357-377.
[3] Amidou N D， Michel N， Serge H， et al. Genetic basis of species differentiation between Coffea liberica Hiern and C. canephora Pierre： Analysis of an interspecific cross[J]. Genet Resour Crop Evol， 2007， 54： 1 011-1 021.
[4] Aggarwal R K， Hendre P S， Varshney R K， et al. Identification， characterization and utilization of EST-derived genic microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species[J]. Theor Appl Genet， 2007， 114： 359-372. [5] Al-Arequi AHNA， Chliyeh M， Sghir F， et al. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosphere of Coffea Arabica in the Republic of Yemen[J]. J. Appl. Biosci， 2013， 64： 4 888-4 901.
[6] Tornincasa P， Furlan M， Pallavicini A， et al. Coffee species and varietal identification[J]. Tools for identifying Biodiversity： Progress and Problems， 2010， 307-313.
[7] 李晓霞， 张吉光， 杨天武， 等. 云南不同海拔小粒种咖啡生长发育情况调查[J]. 云南热作科技， 2002， 25（4）： 8-16.
[8] 黄家雄， 李贵平， 杨世贵. 咖啡种类及优良品种简介[J]. 农村实用技术， 2009（1）： 42-43.
[9] Carrera F， Leon-Camacho M， Pablos F， et al. Authentication of green coffee varieties according to their sterolic profile[J]. Anal Chim Acta， 1998， 370： 131-139.
[10] Martin M J， Pablos F， Gonzalez A G， et al. Fatty acid profiles as discriminant parameters for coffee varieties differentiation[J]. Talanta， 2001， 54： 291-297.
[11] Jham G N， Winkler J K， Berhow M A， et al. γ-Tocopherol as a marker of Brazilian coffee（Coffea arabica L.）adulteration by corn[J]. J Agric Food Chem， 2007， 55： 5 995-5 999.
[12] Kumar P， Gupta V K， Misra A K， et al. Potential of Molecular Markers in Plant Biotechnology[J]. Plant Omics Journal， 2009， 2（4）： 141-162.
[13] 王凤格， 赵久然， 郭景伦， 等. 中国玉米新品种DNA指纹库建立系统研究Ⅰ. 玉米品种纯度及真伪鉴定中SSR技术标准实验体系的建立[J]. 玉米科学， 2003， 11（1）： 3-6.
[14] 辛业芸， 张 展， 熊易平. 应用SSR分子标记鉴定超级杂交水稻组合及其纯度[J]. 中国水稻科学， 2005， 19（2）： 95-100.
[15] Coulibaly I， Revol B， Noirot M， et al. AFLP and SSR polymorphism in a Coffea interspecific backcross progeny[（C. heterocalyx × C. canephora）][J]. Theor Appl Genet， 2003， 107： 1 148-1 155.
[16] Combes M C， Andrzejewski S， Anthony F， et al. Characterization of microsatellite loci in Coffea arabica and related coffee species[J]. Molecular Ecology[J]， 2000， 9： 1 171-1 193.
[17] Poncet V， Dufour M， Hamon P， et al. Development of genomic microsatellite markers in Coffea canephora and their transferability to other coffee species[J]. Genome， 2007， 50： 1 156-1 161.
[18] Hendre P S， Phanindranath R， Annapurna V， et al. Development of new genomic microsatellite markers from robusta coffee （Coffea canephora Pierre ex A. Froehner）showing broad cross-species transferability and utility in genetic studies[J]. BMC Plant biology， 2008， 8： 51.
[19] Cubry P， Musoli P， Legnate H， et al. Diversity in coffee assessed with SSR markers： structure of the genus Coffea and perspectives for breeding[J]. Genome， 2008， 51： 50-63.
[20] Silvestrini M， Junqueira M G， Favarin A C， et al. Genetic diversity and structure of Ethiopian， Yemen and Brazilian Coffea Arabica L. accessions using microsatellites markers[J]. Genet Resour Crop Evol， 2007， 54： 1 367-1 379. [21] Bhat P R， Krishnakumar V， Hendre P S， et al. Identification and characterization of expressed sequence tags-derived simple sequence repeats markers from robusta coffee variety ‘CxR’（an interspecific hybrid of Coffea canephora × Coffea congensis）[J]. Molecular Ecology Notes， 2005， 5： 80-83.
[22] Baruah A， Naik V， Hendre P S， et al. Isolation and characterization of nine microsatellite markers from Coffea arabica L.， showing wide cross-species amplifications[J]. Molecular Ecology notes， 2003， 3： 647-650.
[23] Moncada P， McCouch S. Simple sequence repeat diversity in diploid and tetraploid Coffea species[J]. Genome， 2004， 47： 501-509.
[24] Poncet V， Hamon P， Minier J， et al. SSR cross-amplification and variation within coffee trees（Coffea spp.）[J]. Genome， 2004， 47： 1 071-1 081.
[25] Spaniolas S， May S T， Bennett M J， et al， Authentication of Coffee by Means of PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54（20）： 7 466-7 470.
关键词 中粒种咖啡；小粒种咖啡；SSR；鉴别
中图分类号 S571.2 文献标识码 A
Distinguishing Analysis Between Coffea canephora and
C. arabica Species by SSR Markers
WANG Xiaoyang1， DONG Yunping1 *， HUANG Lifang1， YAN Lin1
ZHOU Hua2， CHEN Jinhuan3， SUN Yan1， LIN Xingjun1
1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，
Ministry of Agriculture / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice
and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China
2 Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan 678600， China
3 Tropical and Subtropical Economic Crops Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Baoshan，
Yunnan 678025， China
Abstract This study was conducted to provide an efficient method to distinguish between C. canephora and C. arabica. One pair of coffee species-specific SSR primers were selected from 514 pairs of SSR primers. The results of PCR amplifying analysis demonstrated that two fragments of 90 and 110 bp from C. arabica and one fragment of 90 or 100 bp from C. canephora were respectively amplified by the primers， meaning C. arabica and C. Canephora coffee could be identified according to the number of amplified fragments. The result of the method was proved to be reliable through our verification test.
Key words Coffea canephora； Coffea arabica； SSR； Distinguishing
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.002
咖啡为世界三大饮料之首，是国际贸易中非常重要的原料产品[1-2]。咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）植物，该属植物共100多种，而生产性栽培的主要为小粒种和中粒种，小粒种约占栽培面积的70%，中粒种约占30%[3-5]。小粒种咖啡因其品质优于中粒种咖啡，其国际市场交易价格也经常是中粒种咖啡的2～3倍，因此，在咖啡贸易过程中常常出现将中粒种咖啡冒充小粒种咖啡进行销售的不法行为，损害消费者的利益[6]；另外，两种咖啡适合种植的生长环境也有差异，小粒种适合种植于高海拔温热地带，而中粒种适合种植于低海拔的高温湿热地区，如果两种咖啡的种子或苗木发生混淆，则会造成咖啡减产并影响咖啡品质，给咖啡种植者带来很大影响[7-8]。因此，生产和市场贸易上急需一种快速、方便、可靠的鉴别中、小粒种咖啡的检测方法。
传统方法鉴别中、小粒种咖啡主要通过将咖啡培炒后进行杯品品尝，这种方法容易受主观人为因素及培炒条件等影响，鉴别结果不准确，且需要专业杯品师参与，可操作性差。现有中、小粒种咖啡鉴别技术主要包括化学分析法及DNA分子标记检测法。化学分析法主要基于两种咖啡内含特定化学物质含量存在差异，通过测定这些化学物质含量，如固醇类、脂肪酸、绿原酸及咖啡因等，再与标准样品进行比较鉴别，由于这类化学物质含量都处于一个幅度范围，没有固定值，且含量差异不是十分明显，同时，某些化学物质含量容易受栽培条件、代谢生理等因素的影响，检测结果精确性较差[9-11]。
基于检测DNA分子水平多态性的分子标记技术的发展为种间鉴别提供了有效途径，DNA分子标记可以直接反映DNA水平上的遗传多态性，表现为核苷酸序列上的差异，这种方法不受人为及环境因素的影响，检测结果非常精确。在所有分子标记中，SSR分子标记由于具有染色体上分布均匀、多态性丰富、共显性、分辨率高和易于检测等优点，自开发以来就成为最为有效构建许多作物指纹图谱的工具，被广泛应用于品种鉴定等方面[12-14]。目前尚未有利用SSR 分子标记鉴别咖啡种类的方法，因此，本研究拟开发出一种利用SSR分子标记快速鉴别中粒种与小粒种咖啡的方法，为咖啡生产上种子、苗木种类鉴定及咖啡市场贸易中产品的真伪鉴别提供有效的工具。 1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为中粒种和小粒种咖啡不同种质叶片，分别取自中国热带农业科学院香料饮料研究所（以下简称“香饮所”）、云南省德宏热带农业科学研究所（以下简称“德热所”）和云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（以下简称“热经所”）咖啡种质资源圃。材料分两部分，一部分用于筛选中粒种、小粒种咖啡种间特异性SSR引物（表1），另一部分用于验证所筛选引物在中粒种与小粒种之间的种间特异性。取上述种质样本的新鲜无病斑嫩叶，置于-70 ℃超低温冰箱保存备用或利用硅胶干燥剂干样保存。
1.2 方法
2 结果与分析
2.1 引物初筛
特异性引物筛选所用引物来源于文献及数据库已发表、公布的咖啡种属特异性SSR引物[15-24]，共514对。利用中、小粒种咖啡样本各2个（中粒种：越南、泰国；小粒种：卡蒂姆7963、铁毕卡）进行筛选，剔除无扩增产物或无多态性引物，选留扩增条带清晰、重复性好、种内一致性较高、种间差别明显的引物作为候选引物，初步筛选出种间特异性候选引物10对（图1）。
2.2 引物复筛
利用中、小粒种咖啡样本各20个，对初步筛选出的10对SSR引物进行复筛，最终筛选出中、小粒种咖啡种间特异性SSR引物1对，引物名称为：SSR124195，引物序列为：Forward primer（5′-3′）：ATCCCCATCAGAAGACCTCA；Reverse primer（5′-3′）：CCTCCACCGCCTGTTTATTA。该引物在小粒种咖啡样本中扩增出90 bp和110 bp双带产物，而在中粒种咖啡样本中只扩增出90 bp或100 bp的单带产物（图2），因此，根据产物条带的数目即可对中粒种和小粒种咖啡进行鉴别，即双带为小粒种咖啡，单带为中粒种咖啡。中、小粒种咖啡样本及SSR124195对样本的扩增情况见表2。
2.3 种属鉴别验证
田间随机抽取中、小粒种咖啡样本各23份，利用SSR124195引物进行种属鉴别，结果显示，中粒种样本扩增条带全部为90 bp或100 bp的单带产物（图3），小粒种全部为90 bp和110 bp的双带产物（图4），验证结果与实际结果一致。
3 讨论与结论
分子标记技术因直接检测DNA分子水平上的遗传差异，不受人为及环境因素的影响，相比其他鉴别中、小粒种咖啡的方法，分子标记在检测精度上具有非常明显的优势。Spaniolas[25]等利用PCR-RFLP技术对中、小粒种咖啡进行了鉴别研究。该方法基于咖啡trnL-trnF基因中长度为251 bp的一段序列，该序列包含一限制性酶切位点，能够被限制性酶Psul酶切成92和159 bp两个片段。小粒种在该酶切位点上存在1个SNP，因而不能被酶切，电泳检测结果为251 bp一条条带，而中粒种不存在该SNP，电泳检测结果为92和195 bp两条条带，因此，根据酶切后电泳检测结果能够很好地区分中、小粒种咖啡，然而，该方法因检测过程中需要使用限制性酶酶切，操作过程复杂且成本较高，在使用上受到较大限制。与前人的方法相比，本研究操作简便、快速，且重复性好、鉴定结果准确可靠，具有较好的应用前景。
本研究筛选出的SSR124195引物为中粒种、小粒种咖啡的鉴别提供了一种有效途径，如何保证鉴别效果的准确性和稳定性是本研究最为关心的问题，这就要求引物筛选所采用的样本必须具有足够的信息量和代表性。本研究采用的中、小粒种咖啡样本均取自中国热带农业科学院香料饮料研究所、云南省德宏热带农业科学研究所和云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所三家国内最主要的咖啡种质资源保存单位，收集保存了国内外大部分咖啡主栽品种及遗传资源，样本具有足够的信息量和广泛的代表性。本研究引物筛选及鉴别验证所用样本既包括了当前国内外咖啡主栽品种，如小粒种的卡帝莫7963、卡杜拉、T5175、T8667、波邦、铁毕卡，中粒种的6号、24号、26号、兴28等，这增加了所筛选引物在咖啡商品贸易真伪及种子、苗木种属类别鉴别过程中的适用性；同时也包括了不同种源、不同性状，遗传差异显著的种质样本，如来自巴西、哥伦比亚、危地马拉、墨西哥、坦桑尼亚、厄瓜多尔、巴布亚新几内亚、哥斯达黎加、夏威夷、澳大利亚、肯尼亚等国家的不同种源及黄果、紫叶、矮种等性状显著差异的样本，提高了所筛选引物的可靠性和稳定性。
参考文献
[1] 黄家雄， 李贵平. 中国咖啡遗传育种研究进展[J]. 西南农业学报， 2008， 21（4）： 1 178-1 181.
[2] Davis A P， Tosh J， Ruch N， et al. Growing coffee： On the bases of plastid and nuclear DNA sequenes； implication for the size， morphology， distribution and evolutionary history of coffea[J]. Botanical J. Linnean soc， 2011， 167（4）： 357-377.
[3] Amidou N D， Michel N， Serge H， et al. Genetic basis of species differentiation between Coffea liberica Hiern and C. canephora Pierre： Analysis of an interspecific cross[J]. Genet Resour Crop Evol， 2007， 54： 1 011-1 021.
[4] Aggarwal R K， Hendre P S， Varshney R K， et al. Identification， characterization and utilization of EST-derived genic microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species[J]. Theor Appl Genet， 2007， 114： 359-372. [5] Al-Arequi AHNA， Chliyeh M， Sghir F， et al. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosphere of Coffea Arabica in the Republic of Yemen[J]. J. Appl. Biosci， 2013， 64： 4 888-4 901.
[6] Tornincasa P， Furlan M， Pallavicini A， et al. Coffee species and varietal identification[J]. Tools for identifying Biodiversity： Progress and Problems， 2010， 307-313.
[7] 李晓霞， 张吉光， 杨天武， 等. 云南不同海拔小粒种咖啡生长发育情况调查[J]. 云南热作科技， 2002， 25（4）： 8-16.
[8] 黄家雄， 李贵平， 杨世贵. 咖啡种类及优良品种简介[J]. 农村实用技术， 2009（1）： 42-43.
[9] Carrera F， Leon-Camacho M， Pablos F， et al. Authentication of green coffee varieties according to their sterolic profile[J]. Anal Chim Acta， 1998， 370： 131-139.
[10] Martin M J， Pablos F， Gonzalez A G， et al. Fatty acid profiles as discriminant parameters for coffee varieties differentiation[J]. Talanta， 2001， 54： 291-297.
[11] Jham G N， Winkler J K， Berhow M A， et al. γ-Tocopherol as a marker of Brazilian coffee（Coffea arabica L.）adulteration by corn[J]. J Agric Food Chem， 2007， 55： 5 995-5 999.
[12] Kumar P， Gupta V K， Misra A K， et al. Potential of Molecular Markers in Plant Biotechnology[J]. Plant Omics Journal， 2009， 2（4）： 141-162.
[13] 王凤格， 赵久然， 郭景伦， 等. 中国玉米新品种DNA指纹库建立系统研究Ⅰ. 玉米品种纯度及真伪鉴定中SSR技术标准实验体系的建立[J]. 玉米科学， 2003， 11（1）： 3-6.
[14] 辛业芸， 张 展， 熊易平. 应用SSR分子标记鉴定超级杂交水稻组合及其纯度[J]. 中国水稻科学， 2005， 19（2）： 95-100.
[15] Coulibaly I， Revol B， Noirot M， et al. AFLP and SSR polymorphism in a Coffea interspecific backcross progeny[（C. heterocalyx × C. canephora）][J]. Theor Appl Genet， 2003， 107： 1 148-1 155.
[16] Combes M C， Andrzejewski S， Anthony F， et al. Characterization of microsatellite loci in Coffea arabica and related coffee species[J]. Molecular Ecology[J]， 2000， 9： 1 171-1 193.
[17] Poncet V， Dufour M， Hamon P， et al. Development of genomic microsatellite markers in Coffea canephora and their transferability to other coffee species[J]. Genome， 2007， 50： 1 156-1 161.
[18] Hendre P S， Phanindranath R， Annapurna V， et al. Development of new genomic microsatellite markers from robusta coffee （Coffea canephora Pierre ex A. Froehner）showing broad cross-species transferability and utility in genetic studies[J]. BMC Plant biology， 2008， 8： 51.
[19] Cubry P， Musoli P， Legnate H， et al. Diversity in coffee assessed with SSR markers： structure of the genus Coffea and perspectives for breeding[J]. Genome， 2008， 51： 50-63.
[20] Silvestrini M， Junqueira M G， Favarin A C， et al. Genetic diversity and structure of Ethiopian， Yemen and Brazilian Coffea Arabica L. accessions using microsatellites markers[J]. Genet Resour Crop Evol， 2007， 54： 1 367-1 379. [21] Bhat P R， Krishnakumar V， Hendre P S， et al. Identification and characterization of expressed sequence tags-derived simple sequence repeats markers from robusta coffee variety ‘CxR’（an interspecific hybrid of Coffea canephora × Coffea congensis）[J]. Molecular Ecology Notes， 2005， 5： 80-83.
[22] Baruah A， Naik V， Hendre P S， et al. Isolation and characterization of nine microsatellite markers from Coffea arabica L.， showing wide cross-species amplifications[J]. Molecular Ecology notes， 2003， 3： 647-650.
[23] Moncada P， McCouch S. Simple sequence repeat diversity in diploid and tetraploid Coffea species[J]. Genome， 2004， 47： 501-509.
[24] Poncet V， Hamon P， Minier J， et al. SSR cross-amplification and variation within coffee trees（Coffea spp.）[J]. Genome， 2004， 47： 1 071-1 081.
[25] Spaniolas S， May S T， Bennett M J， et al， Authentication of Coffee by Means of PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54（20）： 7 466-7 470.