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摘要 [目的]研究大曲中占主要贡献的风味物质，探究各风味物质间的相关性，为研究大曲及大曲酒中风味物质提供参考。[方法]从车间随机选取12块大曲作为样品，应用顶空-固相微萃取（HS-SPME）结合三重四级杆气质联用（GC-QQQ）全扫描技术分析大曲中挥发性组分，以峰面积作为原始数据矩阵，使用DRAUG算法计算出数据中的主要组分数，然后使用奇异值分解计算出原始数据的特征值、特征向量，经特征向量将原始数据转化为一系列主成分，对这些曲块进行分类，最终以综合得分的形式对各块大曲进行排序。[结果]大曲的主要风味物质主要指向2-戊基呋喃、酚类物质、酯类物质；供试样品中B17号样品风味最好，B33号样品风味最差；酯类物质间的相关系数大于0.8。[结论]大曲的主要风味物质为酚类物质、酯类物质，酯类物质间的相关性强。
关键词 大曲；顶空-固相微萃取；特征值；特征向量
中图分类号 TS261 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-056-04
大曲是以小麦为主的谷物原料通过生物发酵而得到，经粗粉碎后加水压成砖状曲块，人工控制在一定温度、湿度下培育而成的生物制剂。大曲经发酵后富含多种微生物，如芽孢杆菌、曲霉菌、酿酒酵母等；以及各种酶系，如糖化酶、蛋白酶等。利用大曲酿造白酒是我国白酒酿造的关键和区别于世界上其他知名蒸馏酒的重要技术特征[1]。大曲是白酒酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气物质前体物质的主要来源，其质量直接关系到白酒的出酒率和品质。因此，大曲本身就是一种香味物质的富集物，所谓的曲香正是一种表现。因此，研究大曲的主要香味物质，具有重要意义。
对于大曲中风味物质的研究，吕云怀等[2]使用顶空-固相微萃取（HS-SPME）分析了大曲中挥发性成分的种类，而该试验从统计学的角度，采用化学计量学手段和HS-SPME技术提取中大曲中挥发性成分的主要信息。
笔者从酿酒车间随机选取了12块大曲作为样品，应用HS-SPME结合三重四级杆气质联用（GC-QQQ）全扫描技术分析了大曲中挥发性组分[3-4]，以各样本中解析出的挥发性组分峰面积作为原始数据矩阵，使用DRAUG算法计算出数据中的主要组分数，然后使用奇异值分解计算出原始数据的特征值、特征向量，经特征向量将原始数据转化为一系列主成分，对这些曲块进行分类，最终以综合得分的形式将结果展现出来，可为研究大曲及大曲酒中风味物质提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料 大曲样品，古井贡酒制曲车间提供。挑选12块大曲，序号分别以B5、B9、B15、B17、B25、B33、C6、C8、C33、C34、C42、C43表示，分别粉碎过40目筛，混合均匀。
50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头，手动SPME进样器，20 mL顶空瓶，固相微萃取仪，Agilent 7000C三重四级杆气质联用仪。
1.2 方法
1.2.1 顶空固相微萃取（SPME）条件。
选取50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头，第1次使用时需于气相色谱进样口250老化1 h。
样品处理：取8 g样品溶于25 mL酒精度为10%的乙醇溶液中，浸泡过夜后，在10 000 r/min，15 ℃条件下离心15 min，取8 mL上清液于顶空瓶中，加入1 g盐和磁子，置于加热温度50 ℃、转速800 r/min的固相萃取仪下加热平衡20 min，然后插入萃取头，再萃取40 min，GC-QQQ进样口解析7 min，进行全扫描分析。
1.2.2 三重四级杆气质联用仪（GC-QQQ）分析条件。气相色谱条件：毛细管色谱柱为CP-Wax，规格50 m×250 μm×0.2 μm；手动无分流进样，进样口温度230 ℃；程序升温条件：初始温度为35 ℃，以2 ℃/min的速率升温到60 ℃，保持4 min，再以4 ℃/min的速率升温到90 ℃，保持4 min，最后以6 ℃/min的速率升温到195 ℃，保持15 min；载气：高纯度氦气，流速为1 mL/min[5]。
质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，质量扫描范围为30～500 amu，离子源温度为230 ℃，传输线温度为195 ℃。
1.2.3 定性分析。
检出挥发性组分物质的质谱图，通过与标准谱图（Nist11.L）对比鉴定，可能性大于70%的予以确认。该试验以峰面积粗略表示各物质的含量，最终选择出34种挥发性物质作为大曲样品的变量。
1.3 数据处理方法
主成分分析有多种数值计算方法，可采用计算协方差矩阵的特征向量，奇异值分解（Singular Value Decomposition，SVD）是其中一种普遍的算法，其基本原理是谱分解原理。主成分分析的最终效果是，对原始数据中的变量进行降维，在尽可能保留原始数据中信息的同时，获得少数变量[6]。
DRAUG算法[7]的基本思路是构造一个与原始数据矩阵相同大小、秩为1的矩阵，与原始数据矩阵相加，得到增广矩阵。外加矩阵的信息干扰了原始数据矩阵中的主因子信息，而与随机误差有关的次要因子信息未受影响。对原始矩阵和增广矩阵分别进行PCA，然后在不同因子水平下比较各自残余矩阵的方差，如果不存在显著性差异，说明残余矩阵基本包含全部次要因子信息，此时的因子水平即是主因子数（主成分数）。相比于其他的主因子数估计方法，DRAUG算法在信号重叠程度，组分的微量或痕量程度以及噪声水平方面所能承受的极限较强，是一种较准确的主因子数计算方法。
该试验首先使用DRAUG算法确定原始数据的主因子数，然后经过奇异值分解，得到特征值和特征向量，由特征向量可判断出各主成分所反映的指标物质；将原始数据矩阵进行转置，对转置矩阵进行奇异值分解，根据得到的第1主成分、第2主成分，对大曲样品进行分类；转置矩阵奇异值分解后，根据得到的主成分向量和相应的方差比（各因子贡献率），得到各样品的综合得分；使用相关性函数计算各物质间的相关系数。 2 结果与分析
2.1 特征组分
构造数据矩阵，矩阵的行向量为同一样品、不同物质的峰面积数据，列向量为同一物质、不同样品的峰面积数据，矩阵大小为12×34，使用DRAUG算法对其进行处理，rank = 6，stdrank = 0，再使用奇异值分解算法，计算荷载向量矩阵。表1中各列的荷载向量即各列向量，由表1可知，第1主成分（PC1）反映的组分指标主要有2-戊基呋喃、2，6-二叔丁基-1，4-苯二酚、2，6-二叔丁基-4-（1-）异丁基苯酚、2-甲基丁酸乙酯、2-辛酮、苯乙烯、2，5-二甲基-3-n戊基吡嗪、1-壬醛、石竹烯等，主要指向呋喃、酚类物质、酮类物质；第2主成分（PC2）反映的组分指标主要有棕榈酸乙酯、己酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、苯甲醛、亚油酸乙酯、十五酸乙酯、十二酸乙酯等，主要指向酯类物质、醛类物质；第3主成分（PC3）反映的组分主要有喇叭醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、5-甲基-2-己酮等，主要指向醇类物质；第4主成分（PC4）反映的组分主要有3-辛醇、壬酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯、癸酸乙酯。因此，可以初步判断以上挥发性物质为大曲的主要风味物质，主要指向2-戊基呋喃、酚类物质、酯类物质。
2.2 样品分类
表2是12个大曲样品的第1主成分、第2主成分数据，图1是由12个大曲样品的第1主成分为横坐标，第2主成分为纵坐标，作散点图而得。由图1可知，12个大曲样本可分为5簇，4号（B17）样和其他样品分开较远，单独为一簇，命为1簇；2号（B9）、7号（C6）、12号（C43）、10号（C34）样比较接近，可分为一簇，命为2簇；1号（B5）、3号（B15）、9号（C33）、11号（C42）样比较接近，命为3簇；8号（C8）单独为一簇，命为4簇；5号（B25）、6号（B33）比较接近，命为5簇。
2.3 综合得分
以每个主成分所对应的特征值占所提取的主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算主成分综合得分，再根据综合得分值对12个大曲样品进行排序，综合得分越高，说明大曲风味越好，由此可以对大曲风味进行评定。由表3可得，B17号样品得分最高，风味最好，其次是B9号样品，再其次是C43号样品，得分最低的是B33号样，该号样大曲风味最差。
2.4 物质间的相关系数
当相关系数小于0.3时，两指标无相关；当相关系数介于0.3 ～ 0.5时，两指标低度相关；当相关系数介于0.5 ～ 0.8时，两指标显著相关；当相关系数大于0.8时，两指标高度相关。由表4可看出，酯类物质间的相关系数较高，即相关性较强。也就是说，当同一样品中某种酯含量较高时，其他酯类物质的含量一般也会较高。
3 结论与讨论
该试验通过采用DRAUG算法来确定需提取的主成分个数，相比于仅按方差贡献率来人为地判断待提取的主成分数，解决了现有技术中的主观性问题，从而使最终计算的综合得分更加准确。根据对大曲样品进行全扫描的定性数据，初步推断出大曲中的主要风味物质为酚类物质、酯类物质，而且，酯类物质的相关性较强。
该试验仅是对大曲中挥发性组分进行定性的初步探究，后期会继续采集样本，对前期结果进行验证，并尝试建立定量方法，以对主要风味物质的判断更加准确。
参考文献
[1]邢钢，敖宗华，王松涛，等.大曲挥发性成分动态变化研究[J].酿酒科技，2014（9）：1-4，8.
[2]吕云怀，王莉，汪地强，等.不同香型白酒大曲风味物质与其产品风格特征关系的分析[J].酿酒科技，2012（7）：72-75.
[3]陈勇，陈泽军，周瑞平，等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法测定大曲中的挥发性组分[J].中国调味品，2013（2）：70-75.
[4]张春林，敖宗华，炊伟强，等.固相微萃取-气相色谱-质谱法分析中高温大曲发酵、贮存过程中挥发性风味成分的变化[J].食品与发酵工业，2011（4）：198-203.
[5]邓静，王远兴，陈赟喆，等.顶空-三重串联四极杆气-质联用法测定靖安白茶香气成分[J].食品科学，2013（22）：115-118.
[6]XU L， TANG L J， CAI C B， et al.Chemometric methods for evaluation of chromatographic separation quality from two-way data：A review[J].Analytical chimica acta， 2008，613（2）： 121-134.
[7]MALINOWSKI E R.Deter mination of rank by augmentation（DRAUG）[J].Journal of chemometrics，2011，25（6）： 323-358.
关键词 大曲；顶空-固相微萃取；特征值；特征向量
中图分类号 TS261 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-056-04
大曲是以小麦为主的谷物原料通过生物发酵而得到，经粗粉碎后加水压成砖状曲块，人工控制在一定温度、湿度下培育而成的生物制剂。大曲经发酵后富含多种微生物，如芽孢杆菌、曲霉菌、酿酒酵母等；以及各种酶系，如糖化酶、蛋白酶等。利用大曲酿造白酒是我国白酒酿造的关键和区别于世界上其他知名蒸馏酒的重要技术特征[1]。大曲是白酒酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气物质前体物质的主要来源，其质量直接关系到白酒的出酒率和品质。因此，大曲本身就是一种香味物质的富集物，所谓的曲香正是一种表现。因此，研究大曲的主要香味物质，具有重要意义。
对于大曲中风味物质的研究，吕云怀等[2]使用顶空-固相微萃取（HS-SPME）分析了大曲中挥发性成分的种类，而该试验从统计学的角度，采用化学计量学手段和HS-SPME技术提取中大曲中挥发性成分的主要信息。
笔者从酿酒车间随机选取了12块大曲作为样品，应用HS-SPME结合三重四级杆气质联用（GC-QQQ）全扫描技术分析了大曲中挥发性组分[3-4]，以各样本中解析出的挥发性组分峰面积作为原始数据矩阵，使用DRAUG算法计算出数据中的主要组分数，然后使用奇异值分解计算出原始数据的特征值、特征向量，经特征向量将原始数据转化为一系列主成分，对这些曲块进行分类，最终以综合得分的形式将结果展现出来，可为研究大曲及大曲酒中风味物质提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料 大曲样品，古井贡酒制曲车间提供。挑选12块大曲，序号分别以B5、B9、B15、B17、B25、B33、C6、C8、C33、C34、C42、C43表示，分别粉碎过40目筛，混合均匀。
50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头，手动SPME进样器，20 mL顶空瓶，固相微萃取仪，Agilent 7000C三重四级杆气质联用仪。
1.2 方法
1.2.1 顶空固相微萃取（SPME）条件。
选取50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头，第1次使用时需于气相色谱进样口250老化1 h。
样品处理：取8 g样品溶于25 mL酒精度为10%的乙醇溶液中，浸泡过夜后，在10 000 r/min，15 ℃条件下离心15 min，取8 mL上清液于顶空瓶中，加入1 g盐和磁子，置于加热温度50 ℃、转速800 r/min的固相萃取仪下加热平衡20 min，然后插入萃取头，再萃取40 min，GC-QQQ进样口解析7 min，进行全扫描分析。
1.2.2 三重四级杆气质联用仪（GC-QQQ）分析条件。气相色谱条件：毛细管色谱柱为CP-Wax，规格50 m×250 μm×0.2 μm；手动无分流进样，进样口温度230 ℃；程序升温条件：初始温度为35 ℃，以2 ℃/min的速率升温到60 ℃，保持4 min，再以4 ℃/min的速率升温到90 ℃，保持4 min，最后以6 ℃/min的速率升温到195 ℃，保持15 min；载气：高纯度氦气，流速为1 mL/min[5]。
质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，质量扫描范围为30～500 amu，离子源温度为230 ℃，传输线温度为195 ℃。
1.2.3 定性分析。
检出挥发性组分物质的质谱图，通过与标准谱图（Nist11.L）对比鉴定，可能性大于70%的予以确认。该试验以峰面积粗略表示各物质的含量，最终选择出34种挥发性物质作为大曲样品的变量。
1.3 数据处理方法
主成分分析有多种数值计算方法，可采用计算协方差矩阵的特征向量，奇异值分解（Singular Value Decomposition，SVD）是其中一种普遍的算法，其基本原理是谱分解原理。主成分分析的最终效果是，对原始数据中的变量进行降维，在尽可能保留原始数据中信息的同时，获得少数变量[6]。
DRAUG算法[7]的基本思路是构造一个与原始数据矩阵相同大小、秩为1的矩阵，与原始数据矩阵相加，得到增广矩阵。外加矩阵的信息干扰了原始数据矩阵中的主因子信息，而与随机误差有关的次要因子信息未受影响。对原始矩阵和增广矩阵分别进行PCA，然后在不同因子水平下比较各自残余矩阵的方差，如果不存在显著性差异，说明残余矩阵基本包含全部次要因子信息，此时的因子水平即是主因子数（主成分数）。相比于其他的主因子数估计方法，DRAUG算法在信号重叠程度，组分的微量或痕量程度以及噪声水平方面所能承受的极限较强，是一种较准确的主因子数计算方法。
该试验首先使用DRAUG算法确定原始数据的主因子数，然后经过奇异值分解，得到特征值和特征向量，由特征向量可判断出各主成分所反映的指标物质；将原始数据矩阵进行转置，对转置矩阵进行奇异值分解，根据得到的第1主成分、第2主成分，对大曲样品进行分类；转置矩阵奇异值分解后，根据得到的主成分向量和相应的方差比（各因子贡献率），得到各样品的综合得分；使用相关性函数计算各物质间的相关系数。 2 结果与分析
2.1 特征组分
构造数据矩阵，矩阵的行向量为同一样品、不同物质的峰面积数据，列向量为同一物质、不同样品的峰面积数据，矩阵大小为12×34，使用DRAUG算法对其进行处理，rank = 6，stdrank = 0，再使用奇异值分解算法，计算荷载向量矩阵。表1中各列的荷载向量即各列向量，由表1可知，第1主成分（PC1）反映的组分指标主要有2-戊基呋喃、2，6-二叔丁基-1，4-苯二酚、2，6-二叔丁基-4-（1-）异丁基苯酚、2-甲基丁酸乙酯、2-辛酮、苯乙烯、2，5-二甲基-3-n戊基吡嗪、1-壬醛、石竹烯等，主要指向呋喃、酚类物质、酮类物质；第2主成分（PC2）反映的组分指标主要有棕榈酸乙酯、己酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、苯甲醛、亚油酸乙酯、十五酸乙酯、十二酸乙酯等，主要指向酯类物质、醛类物质；第3主成分（PC3）反映的组分主要有喇叭醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、5-甲基-2-己酮等，主要指向醇类物质；第4主成分（PC4）反映的组分主要有3-辛醇、壬酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯、癸酸乙酯。因此，可以初步判断以上挥发性物质为大曲的主要风味物质，主要指向2-戊基呋喃、酚类物质、酯类物质。
2.2 样品分类
表2是12个大曲样品的第1主成分、第2主成分数据，图1是由12个大曲样品的第1主成分为横坐标，第2主成分为纵坐标，作散点图而得。由图1可知，12个大曲样本可分为5簇，4号（B17）样和其他样品分开较远，单独为一簇，命为1簇；2号（B9）、7号（C6）、12号（C43）、10号（C34）样比较接近，可分为一簇，命为2簇；1号（B5）、3号（B15）、9号（C33）、11号（C42）样比较接近，命为3簇；8号（C8）单独为一簇，命为4簇；5号（B25）、6号（B33）比较接近，命为5簇。
2.3 综合得分
以每个主成分所对应的特征值占所提取的主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算主成分综合得分，再根据综合得分值对12个大曲样品进行排序，综合得分越高，说明大曲风味越好，由此可以对大曲风味进行评定。由表3可得，B17号样品得分最高，风味最好，其次是B9号样品，再其次是C43号样品，得分最低的是B33号样，该号样大曲风味最差。
2.4 物质间的相关系数
当相关系数小于0.3时，两指标无相关；当相关系数介于0.3 ～ 0.5时，两指标低度相关；当相关系数介于0.5 ～ 0.8时，两指标显著相关；当相关系数大于0.8时，两指标高度相关。由表4可看出，酯类物质间的相关系数较高，即相关性较强。也就是说，当同一样品中某种酯含量较高时，其他酯类物质的含量一般也会较高。
3 结论与讨论
该试验通过采用DRAUG算法来确定需提取的主成分个数，相比于仅按方差贡献率来人为地判断待提取的主成分数，解决了现有技术中的主观性问题，从而使最终计算的综合得分更加准确。根据对大曲样品进行全扫描的定性数据，初步推断出大曲中的主要风味物质为酚类物质、酯类物质，而且，酯类物质的相关性较强。
该试验仅是对大曲中挥发性组分进行定性的初步探究，后期会继续采集样本，对前期结果进行验证，并尝试建立定量方法，以对主要风味物质的判断更加准确。
参考文献
[1]邢钢，敖宗华，王松涛，等.大曲挥发性成分动态变化研究[J].酿酒科技，2014（9）：1-4，8.
[2]吕云怀，王莉，汪地强，等.不同香型白酒大曲风味物质与其产品风格特征关系的分析[J].酿酒科技，2012（7）：72-75.
[3]陈勇，陈泽军，周瑞平，等.顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法测定大曲中的挥发性组分[J].中国调味品，2013（2）：70-75.
[4]张春林，敖宗华，炊伟强，等.固相微萃取-气相色谱-质谱法分析中高温大曲发酵、贮存过程中挥发性风味成分的变化[J].食品与发酵工业，2011（4）：198-203.
[5]邓静，王远兴，陈赟喆，等.顶空-三重串联四极杆气-质联用法测定靖安白茶香气成分[J].食品科学，2013（22）：115-118.
[6]XU L， TANG L J， CAI C B， et al.Chemometric methods for evaluation of chromatographic separation quality from two-way data：A review[J].Analytical chimica acta， 2008，613（2）： 121-134.
[7]MALINOWSKI E R.Deter mination of rank by augmentation（DRAUG）[J].Journal of chemometrics，2011，25（6）： 323-358.