【摘 要】
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海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用.通过生物信息学分
【机 构】
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江苏科技大学生物技术学院,江苏镇江,212018;江苏科技大学生物技术学院,江苏镇江212018;中国农业科学院蚕业研究所,江苏镇江212018
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海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用.通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(NbTre1、Nb Tre2、NbTre3和Nb Tre4),除了NbTre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区.基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了NbTre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 kD,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点.通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得NbTre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合NbTre1蛋白,其分子质量与预期值一致.融合NbTre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600.通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等.
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