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摘要：目的 观察左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA receptor，NR）2A及NR2B表达的影响，探讨其对糖尿病并发抑郁症大鼠海马损伤的保护机制。方法 建立糖尿病并发抑郁症大鼠模型，随机分为模型组、阳性药组及左归降糖解郁方高、中、低剂量组，以正常大鼠为正常组，每组16只，各给药组给予相应药物灌胃，连续28 d。采用Open-field实验评价大鼠行为变化，ELISA检测海马谷氨酸含量，免疫荧光法检测海马NR2A、NR2B表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠自主活动次数明显减少（P<0.01），海马谷氨酸含量明显升高（P<0.01），NR2A、NR2B表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠自主活动次数明显增加（P<0.01），海马谷氨酸含量明显下降（P<0.01）， NR2A、NR2B表达降低（P<0.05）。结论 左归降糖解郁方可明显改善糖尿病并发抑郁症大鼠的抑郁行为，其药效作用可能与调控大鼠海马谷氨酸含量及NR2A、NR2B表达有关。
关键词：左归降糖解郁方；糖尿病；抑郁症；谷氨酸；N-甲基-D-天冬氨酸受体2A；N-甲基-D-天冬氨酸受体2B；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0070-04
Abstract：Objective To observe the effect of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on the expressions of glutamate， NR2A and NR2B in hippocampus of diabetic rats with depression；To explore the mechanism of protective effect. Methods Diabetes with depression rat models were established and then were randomly divided into the model group， positive medicine group， high-， medium- and low-dose Zuogui Jiangtang Jieyu Formula groups. Normal rats acted as normal group， 16 rats per group. After 28 days of administration， Open-field test was used to detect the behavior of the rats；glutamate content of hippocampus was detected by ELISA；the expressions of NR2A and NR2B in rat hippocampus were detected by immunofluorescence. Results Compared with normal group， automatic activity times of rats in model group decreased significantly （P<0.01）；both glutamate content （P<0.01） and expressions of NR2A， NR2B （P<0.01） increased significantly. Compared with the model group， automatic activity times of rats in positive medicine group and high-dose Zuogui Jiangtang Jieyu Formula group significantly increased （P<0.01）；glutamate content dropped （P<0.01）；expressions of NR2A and NR2B decreased （P<0.05）. Conclusion Zuogui Jiangtang Jieyu Formula can improve depressive behavior of diabetic rats with depression， which may be related to the regulation of glutamate content and expressions of NR2A and NR2B in hippocampus.
Key words：Zuogui Jiangtang Jieyu Formula；diabetes；depression；glutamate；NR2A；NR2B；rats
糖尿病作为全球性的慢性疾病，发病率正迅速上升。预计2035年，糖尿病可影响5.39亿人口[1]。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致一系列慢性并发症，而糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus with depression，DD）已成为严重危害人类健康的又一杀手，正在隐匿地侵蚀着患者的身体状况和生活质量。目前，临床上治疗DD尚无特效药，多采取联合用药模式，但存在一定不良反应。
本课题组前期研究显示，海马是DD的重要靶器官，左归降糖解郁方可改善DD的抑郁行为，并对海马损伤起到保护作用[2-3]。另有文献报道，糖尿病患者海马谷氨酸含量明显升高[4]，谷氨酸堆积并释放到胞外，可使兴奋性氨基酸受体N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA receptor，NR）2A、2B亚基水平及受体通道结合位点数目增加，引起海马的神经兴奋性毒性进而导致抑郁的发生[5]。因此，本实验以谷氨酸和关键蛋白NR2A、NR2B的表达为切入点，探讨左归降糖解郁方对DD大鼠海马损伤的保护机制。 1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级SD大鼠96只，鼠龄8周，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号43004700004535；饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心。
1.2 药物
左归降糖解郁方由黄芪18 g、贯叶连翘3 g、姜黄9 g、熟地黄15 g、山萸肉12 g、枸杞子12 g、菟丝子9 g、杜仲9 g、丹参12 g、牡丹皮6 g、牛膝9 g组成，湖南中医药大学第一附属医院提供，并制成口服液；盐酸二甲双胍片，湖南湘雅制药有限公司，批号1402115；盐酸氟西汀胶囊，法国Patheon公司提供，批号2087A。
1.3 试剂
抗大鼠NR2A、NR2B免疫荧光抗体，武汉博士德生物工程有限公司，批号131101W、140512；链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司，批号1126C039；谷氨酸ELISA试剂盒，美国R&D公司，批号201407。
1.4 主要仪器
MK3型酶标仪（美国Thermo公司），Olympus荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），DVP-W7显微镜图像处理系统（南京长城信息系统公司），RM223切片机（德国莱卡公司），Open-field敞箱（湖南中医药大学第一附属医院中心实验室）。
2 实验方法
2.1 造模、分组与给药
参照文献[6]，利用高脂乳剂灌胃、尾静脉注射STZ、慢性应激的复合式造模方法建立DD大鼠模型。80只造模大鼠随机分为模型组，阳性药（盐酸二甲双胍0.18 g/kg+盐酸氟西汀1.8 mg/kg）组，左归降糖解郁方高、中、低剂量（32.82、16.41、8.20 g/kg）组（中药高、中、低剂量组）。另取16 只正常SD大鼠作为正常组。各组大鼠造模同时灌胃给药，每日1次，连续28 d，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水。给药体积10 mL/kg。
2.2 观察指标
2.2.1 行为学观察 采用Open-field实验观察大鼠行为学改变。敞箱规格为80 cm×80 cm×40 cm，25个面积相等的方格构成底面，1 min适应期后，记录大鼠3 min内水平运动格数（四爪皆进入记为1次）、垂直竖立次数（两前爪腾空或攀附箱壁记为1次），以总次数为最后评价指标。每次均从同一角落放入大鼠，测评结束后用消毒液擦拭敞箱，晾干待用。
2.2.2 海马组织谷氨酸含量检测 Open-field实验后，每组取8只大鼠断头处死，冰盒中分离海马，称量后加入预冷PBS水溶液制成20%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液[7]。按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠海马组织谷氨酸含量。
2.2.3 海马N-甲基-D-天冬氨酸受体2A和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B蛋白表达检测 每组取8只大鼠麻醉后灌注取全脑，放入4%多聚甲醛液中保存。常规石蜡包埋，切片，脱蜡、水化，加入EDTA抗原修复液（pH 7.4），PBS洗3次×5 min。甩去多余PBS后滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min。甩去多余封闭液后分别滴加兔抗大鼠NR2A、NR2B一抗50 μL， 4 ℃过夜，37 ℃复温45 min，PBS洗3次×5 min。滴加荧光标记的二抗50 μL，避光37 ℃孵育30 min，PBS洗3次×5 min。甩去多余的PBS，抗荧光淬灭封片液封片后用荧光显微镜镜检。显微镜下观察每张玻片海马部位NR2A、NR2B的表达情况，阳性细胞发出绿色荧光。观察3个不同视野，计算阳性细胞数。
3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析、t检验，双侧检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 左归降糖解郁方对模型大鼠自主活动的影响
与正常组比较，模型组大鼠自主活动次数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠自主活动次数明显增加（P<0.01），提示阳性药和中药高剂量能显著改善DD大鼠抑郁行为。结果见表1。
4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠海马谷氨酸含量的影响
与正常组比较，模型组大鼠海马谷氨酸含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠海马谷氨酸含量明显降低（P<0.01）。结果见表2。
4.3 左归降糖解郁方对模型大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体2A和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠NR2A、NR2B阳性细胞数增加，提示NR2A、NR2B亚单位表达水平升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组NR2A、NR2B阳性细胞数减少（P<0.05）。结果见表3、图1、图2。
5 讨论
本课题组前期成功建立了DD动物模型，利用高脂乳剂灌胃、尾静脉注射STZ、慢性应激的复合式造模方法可使成模率>99%，左归降糖解郁方干预后，高血糖、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴紊乱、海马神经元受损情况得到缓解[2-3，6]。临床资料显示，与单纯糖尿病患者相比，DD患者的HPA轴较为亢进[8]。值得关注的是，HPA轴紊乱可致海马损伤，而NR在调节机体情绪和记忆的海马广泛的分布[9]，因而推测NR异常表达可能是影响DD发生与发展的重要因素之一。糖尿病模型动物海马存在NR活化异常：糖尿病大鼠海马NR亚基NR2B蛋白表达异常，与正常组差异明显[10]；另一种2型糖尿病模型大鼠ZDF大鼠则表现为海马CA1区谷氨酸与NR结合异常[11]。因此，笔者认为，海马部位NR表达异常可能在DD发病机制中扮演了重要角色。 谷氨酸在生理条件下参与哺乳动物突触信息的传递和贮存、突触可塑性的形成和维持等，是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质。糖尿病病理条件下，患者脑内谷氨酸含量异常升高[4]，在糖尿病大鼠中也得到一致的结果[12]。海马谷氨酸的异常增多对抑郁症的发生有重要意义：海马是抑郁症发生的靶器官，过量的谷氨酸可引起海马的神经兴奋性毒性，进而造成海马损伤。本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠海马谷氨酸含量明显升高；而与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠海马谷氨酸含量明显降低。
NR是谷氨酸离子型受体，与谷氨酸结合可发挥一系列生理效应。NR2A、NR2B亚单位构成了NR重要的调节亚基[13]。本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠NR2A、NR2B亚单位表达水平升高，提示NR活化，而NR过度激活可引起神经元损伤。研究表明，突触处谷氨酸含量过高，谷氨酸可渗出突触，结合到突触外的NR，而NR2A亚单位在突触处主要表达，NR2B亚单位在突触以外的部位如胞浆、轴突膜和树突膜等处主表达[14-15]。有学者认为，突触以外的NR能激发细胞的毒性作用，神经元对神经毒的易感性与NR2B数目成正相关[16]。给予阳性药和左归降糖解郁方高剂量干预后，NR2A、NR2B亚单位表达水平下降，因此，笔者推测左归降糖解郁方可通过阻断NR过度活化而发挥保护神经元的效应。
左归降糖解郁方是以张仲景的左归饮、左归丸化裁而得。本研究发现，给予DD大鼠左归降糖解郁方干预后，大鼠抑郁行为、海马谷氨酸及NR2A、NR2B表达紊乱情况得到缓解，但其影响NR2A、NR2B的可能机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] Andersen GS， Thybo T， Cederberg H， et al. The DEXLIFE study methods：Identifying novel candidate biomarkers that predict progression to type 2 diabetesin high risk individuals[J]. Diabetes Research and Clinical Practice，2014，106（2）：383-389.
[2] 杨蕙.糖尿病并发抑郁症动物模型的建立及中药保护作用[D].长沙：湖南中医药大学，2013.
[3] Wang YH， Yin LT， Yang H， et al. Hypoglycemic and anti depressant effects of Zuogui Jiangtang Jieyu formulation in a model of unpredictable chronic mild stress in rats with diabetes mellitus[J]. Experimental and Therpeutic Medicine，2014，8（1）：281-285.
[4] Sanjeev Sinha， Meera Ekka， Uma Sharma， et al. Assessment of changes in brain metabolites in Indian patients with type-2 diabetes mellitus using proton magnetic resonance spectroscopy[J]. BMC Res Notes，2014，7（1）：41-47.
[5] Weiland NG， Orchinik M， Tanapat P. Chronic corticosterone treatment induces parallel changes in N-methyl-D-aspartate receptor subunit messenger RNA levels and antagonist binding sites in the hippocampus[J]. Neuroscience，1997，78（3）：653-662.
[6] 王宇红，杨蕙，尹玲桃，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠血糖血脂的影响[J].中草药，2014，45（11）：1602-1606.
[7] 赵晖，王蕾，张秋霞，等.竹节参总皂苷对血管痴呆大鼠递质氨基酸及自由基代谢的影响[J].中国老年学杂志，2010，30（21）：3096-3098.
[8] 王步军，钱永明.ACTH与2型糖尿病合并抑郁症的关系分析[J].医学临床研究，2009，26（8）：1495-1496.
[9] Kaufman AM， Milnerwood AJ， Sepers MD， et al. Opposing roles of synaptic and extrasynaptic NMDA receptor signaling in cocultured striatal and cortical neurons[J]. J Neurosci，2012，32（12）：3992- 4003.
[10] 陈谊，蔡文玮，盛净.糖尿病模型大鼠认知功能障碍及海马N-甲基-D-天冬氨酸受体表达变化[J].实用医学杂志，2010，26（17）：3098-3101.
[11] Trudeau F， Gagnon S， Massicotte G. Hippocampal synaptic plasticity and glutamate receptor regulation：influences of diabetes mellitus[J]. Eur J Pharmacol，2004，490（1/3）：177-186.
[12] 金靓燕.糖尿病大鼠脑组织提取物的1H NMR检测[C]//第14届全国感染药学学术会议论文汇编.上海，2012.
[13] 程少容，刘能保，张敏海，等.慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马NMDA受体亚基NR2A和NR2B表达的影响[J].神经解剖学杂志，2004，20（3）：275-280.
[14] 富文俊，敖海清，孙琪，等.逍遥散对慢性应激损伤大鼠NR受体亚型表达的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：594-598.
[15] 张敏海，程少容，刘能保，等.皮质酮对原代培养海马神经元的毒性作用及NMDA受体亚基表达的改变[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2005， 14（5）：566-571.
[16] 袁维秀，杨红菊，张宏，等.N-甲基-D-天冬氨酸-2B受体功能的研究进展[J].国外医学：药学分册，2004，31（3）：146-149.
（收稿日期：2015-02-11）
（修回日期：2015-02-27；编辑：华强）
关键词：左归降糖解郁方；糖尿病；抑郁症；谷氨酸；N-甲基-D-天冬氨酸受体2A；N-甲基-D-天冬氨酸受体2B；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0070-04
Abstract：Objective To observe the effect of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on the expressions of glutamate， NR2A and NR2B in hippocampus of diabetic rats with depression；To explore the mechanism of protective effect. Methods Diabetes with depression rat models were established and then were randomly divided into the model group， positive medicine group， high-， medium- and low-dose Zuogui Jiangtang Jieyu Formula groups. Normal rats acted as normal group， 16 rats per group. After 28 days of administration， Open-field test was used to detect the behavior of the rats；glutamate content of hippocampus was detected by ELISA；the expressions of NR2A and NR2B in rat hippocampus were detected by immunofluorescence. Results Compared with normal group， automatic activity times of rats in model group decreased significantly （P<0.01）；both glutamate content （P<0.01） and expressions of NR2A， NR2B （P<0.01） increased significantly. Compared with the model group， automatic activity times of rats in positive medicine group and high-dose Zuogui Jiangtang Jieyu Formula group significantly increased （P<0.01）；glutamate content dropped （P<0.01）；expressions of NR2A and NR2B decreased （P<0.05）. Conclusion Zuogui Jiangtang Jieyu Formula can improve depressive behavior of diabetic rats with depression， which may be related to the regulation of glutamate content and expressions of NR2A and NR2B in hippocampus.
Key words：Zuogui Jiangtang Jieyu Formula；diabetes；depression；glutamate；NR2A；NR2B；rats
糖尿病作为全球性的慢性疾病，发病率正迅速上升。预计2035年，糖尿病可影响5.39亿人口[1]。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致一系列慢性并发症，而糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus with depression，DD）已成为严重危害人类健康的又一杀手，正在隐匿地侵蚀着患者的身体状况和生活质量。目前，临床上治疗DD尚无特效药，多采取联合用药模式，但存在一定不良反应。
本课题组前期研究显示，海马是DD的重要靶器官，左归降糖解郁方可改善DD的抑郁行为，并对海马损伤起到保护作用[2-3]。另有文献报道，糖尿病患者海马谷氨酸含量明显升高[4]，谷氨酸堆积并释放到胞外，可使兴奋性氨基酸受体N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA receptor，NR）2A、2B亚基水平及受体通道结合位点数目增加，引起海马的神经兴奋性毒性进而导致抑郁的发生[5]。因此，本实验以谷氨酸和关键蛋白NR2A、NR2B的表达为切入点，探讨左归降糖解郁方对DD大鼠海马损伤的保护机制。 1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级SD大鼠96只，鼠龄8周，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号43004700004535；饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心。
1.2 药物
左归降糖解郁方由黄芪18 g、贯叶连翘3 g、姜黄9 g、熟地黄15 g、山萸肉12 g、枸杞子12 g、菟丝子9 g、杜仲9 g、丹参12 g、牡丹皮6 g、牛膝9 g组成，湖南中医药大学第一附属医院提供，并制成口服液；盐酸二甲双胍片，湖南湘雅制药有限公司，批号1402115；盐酸氟西汀胶囊，法国Patheon公司提供，批号2087A。
1.3 试剂
抗大鼠NR2A、NR2B免疫荧光抗体，武汉博士德生物工程有限公司，批号131101W、140512；链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司，批号1126C039；谷氨酸ELISA试剂盒，美国R&D公司，批号201407。
1.4 主要仪器
MK3型酶标仪（美国Thermo公司），Olympus荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），DVP-W7显微镜图像处理系统（南京长城信息系统公司），RM223切片机（德国莱卡公司），Open-field敞箱（湖南中医药大学第一附属医院中心实验室）。
2 实验方法
2.1 造模、分组与给药
参照文献[6]，利用高脂乳剂灌胃、尾静脉注射STZ、慢性应激的复合式造模方法建立DD大鼠模型。80只造模大鼠随机分为模型组，阳性药（盐酸二甲双胍0.18 g/kg+盐酸氟西汀1.8 mg/kg）组，左归降糖解郁方高、中、低剂量（32.82、16.41、8.20 g/kg）组（中药高、中、低剂量组）。另取16 只正常SD大鼠作为正常组。各组大鼠造模同时灌胃给药，每日1次，连续28 d，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水。给药体积10 mL/kg。
2.2 观察指标
2.2.1 行为学观察 采用Open-field实验观察大鼠行为学改变。敞箱规格为80 cm×80 cm×40 cm，25个面积相等的方格构成底面，1 min适应期后，记录大鼠3 min内水平运动格数（四爪皆进入记为1次）、垂直竖立次数（两前爪腾空或攀附箱壁记为1次），以总次数为最后评价指标。每次均从同一角落放入大鼠，测评结束后用消毒液擦拭敞箱，晾干待用。
2.2.2 海马组织谷氨酸含量检测 Open-field实验后，每组取8只大鼠断头处死，冰盒中分离海马，称量后加入预冷PBS水溶液制成20%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液[7]。按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠海马组织谷氨酸含量。
2.2.3 海马N-甲基-D-天冬氨酸受体2A和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B蛋白表达检测 每组取8只大鼠麻醉后灌注取全脑，放入4%多聚甲醛液中保存。常规石蜡包埋，切片，脱蜡、水化，加入EDTA抗原修复液（pH 7.4），PBS洗3次×5 min。甩去多余PBS后滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min。甩去多余封闭液后分别滴加兔抗大鼠NR2A、NR2B一抗50 μL， 4 ℃过夜，37 ℃复温45 min，PBS洗3次×5 min。滴加荧光标记的二抗50 μL，避光37 ℃孵育30 min，PBS洗3次×5 min。甩去多余的PBS，抗荧光淬灭封片液封片后用荧光显微镜镜检。显微镜下观察每张玻片海马部位NR2A、NR2B的表达情况，阳性细胞发出绿色荧光。观察3个不同视野，计算阳性细胞数。
3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析、t检验，双侧检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 左归降糖解郁方对模型大鼠自主活动的影响
与正常组比较，模型组大鼠自主活动次数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠自主活动次数明显增加（P<0.01），提示阳性药和中药高剂量能显著改善DD大鼠抑郁行为。结果见表1。
4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠海马谷氨酸含量的影响
与正常组比较，模型组大鼠海马谷氨酸含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠海马谷氨酸含量明显降低（P<0.01）。结果见表2。
4.3 左归降糖解郁方对模型大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体2A和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠NR2A、NR2B阳性细胞数增加，提示NR2A、NR2B亚单位表达水平升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组NR2A、NR2B阳性细胞数减少（P<0.05）。结果见表3、图1、图2。
5 讨论
本课题组前期成功建立了DD动物模型，利用高脂乳剂灌胃、尾静脉注射STZ、慢性应激的复合式造模方法可使成模率>99%，左归降糖解郁方干预后，高血糖、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴紊乱、海马神经元受损情况得到缓解[2-3，6]。临床资料显示，与单纯糖尿病患者相比，DD患者的HPA轴较为亢进[8]。值得关注的是，HPA轴紊乱可致海马损伤，而NR在调节机体情绪和记忆的海马广泛的分布[9]，因而推测NR异常表达可能是影响DD发生与发展的重要因素之一。糖尿病模型动物海马存在NR活化异常：糖尿病大鼠海马NR亚基NR2B蛋白表达异常，与正常组差异明显[10]；另一种2型糖尿病模型大鼠ZDF大鼠则表现为海马CA1区谷氨酸与NR结合异常[11]。因此，笔者认为，海马部位NR表达异常可能在DD发病机制中扮演了重要角色。 谷氨酸在生理条件下参与哺乳动物突触信息的传递和贮存、突触可塑性的形成和维持等，是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质。糖尿病病理条件下，患者脑内谷氨酸含量异常升高[4]，在糖尿病大鼠中也得到一致的结果[12]。海马谷氨酸的异常增多对抑郁症的发生有重要意义：海马是抑郁症发生的靶器官，过量的谷氨酸可引起海马的神经兴奋性毒性，进而造成海马损伤。本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠海马谷氨酸含量明显升高；而与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂量组大鼠海马谷氨酸含量明显降低。
NR是谷氨酸离子型受体，与谷氨酸结合可发挥一系列生理效应。NR2A、NR2B亚单位构成了NR重要的调节亚基[13]。本研究发现，与正常组比较，模型组大鼠NR2A、NR2B亚单位表达水平升高，提示NR活化，而NR过度激活可引起神经元损伤。研究表明，突触处谷氨酸含量过高，谷氨酸可渗出突触，结合到突触外的NR，而NR2A亚单位在突触处主要表达，NR2B亚单位在突触以外的部位如胞浆、轴突膜和树突膜等处主表达[14-15]。有学者认为，突触以外的NR能激发细胞的毒性作用，神经元对神经毒的易感性与NR2B数目成正相关[16]。给予阳性药和左归降糖解郁方高剂量干预后，NR2A、NR2B亚单位表达水平下降，因此，笔者推测左归降糖解郁方可通过阻断NR过度活化而发挥保护神经元的效应。
左归降糖解郁方是以张仲景的左归饮、左归丸化裁而得。本研究发现，给予DD大鼠左归降糖解郁方干预后，大鼠抑郁行为、海马谷氨酸及NR2A、NR2B表达紊乱情况得到缓解，但其影响NR2A、NR2B的可能机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1] Andersen GS， Thybo T， Cederberg H， et al. The DEXLIFE study methods：Identifying novel candidate biomarkers that predict progression to type 2 diabetesin high risk individuals[J]. Diabetes Research and Clinical Practice，2014，106（2）：383-389.
[2] 杨蕙.糖尿病并发抑郁症动物模型的建立及中药保护作用[D].长沙：湖南中医药大学，2013.
[3] Wang YH， Yin LT， Yang H， et al. Hypoglycemic and anti depressant effects of Zuogui Jiangtang Jieyu formulation in a model of unpredictable chronic mild stress in rats with diabetes mellitus[J]. Experimental and Therpeutic Medicine，2014，8（1）：281-285.
[4] Sanjeev Sinha， Meera Ekka， Uma Sharma， et al. Assessment of changes in brain metabolites in Indian patients with type-2 diabetes mellitus using proton magnetic resonance spectroscopy[J]. BMC Res Notes，2014，7（1）：41-47.
[5] Weiland NG， Orchinik M， Tanapat P. Chronic corticosterone treatment induces parallel changes in N-methyl-D-aspartate receptor subunit messenger RNA levels and antagonist binding sites in the hippocampus[J]. Neuroscience，1997，78（3）：653-662.
[6] 王宇红，杨蕙，尹玲桃，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠血糖血脂的影响[J].中草药，2014，45（11）：1602-1606.
[7] 赵晖，王蕾，张秋霞，等.竹节参总皂苷对血管痴呆大鼠递质氨基酸及自由基代谢的影响[J].中国老年学杂志，2010，30（21）：3096-3098.
[8] 王步军，钱永明.ACTH与2型糖尿病合并抑郁症的关系分析[J].医学临床研究，2009，26（8）：1495-1496.
[9] Kaufman AM， Milnerwood AJ， Sepers MD， et al. Opposing roles of synaptic and extrasynaptic NMDA receptor signaling in cocultured striatal and cortical neurons[J]. J Neurosci，2012，32（12）：3992- 4003.
[10] 陈谊，蔡文玮，盛净.糖尿病模型大鼠认知功能障碍及海马N-甲基-D-天冬氨酸受体表达变化[J].实用医学杂志，2010，26（17）：3098-3101.
[11] Trudeau F， Gagnon S， Massicotte G. Hippocampal synaptic plasticity and glutamate receptor regulation：influences of diabetes mellitus[J]. Eur J Pharmacol，2004，490（1/3）：177-186.
[12] 金靓燕.糖尿病大鼠脑组织提取物的1H NMR检测[C]//第14届全国感染药学学术会议论文汇编.上海，2012.
[13] 程少容，刘能保，张敏海，等.慢性复合应激对大鼠学习与记忆及海马NMDA受体亚基NR2A和NR2B表达的影响[J].神经解剖学杂志，2004，20（3）：275-280.
[14] 富文俊，敖海清，孙琪，等.逍遥散对慢性应激损伤大鼠NR受体亚型表达的影响[J].中华中医药杂志，2012，27（3）：594-598.
[15] 张敏海，程少容，刘能保，等.皮质酮对原代培养海马神经元的毒性作用及NMDA受体亚基表达的改变[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2005， 14（5）：566-571.
[16] 袁维秀，杨红菊，张宏，等.N-甲基-D-天冬氨酸-2B受体功能的研究进展[J].国外医学：药学分册，2004，31（3）：146-149.
（收稿日期：2015-02-11）
（修回日期：2015-02-27；编辑：华强）