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摘 要：高质量蛋白质结晶的获得，在蛋白质结构分析中尤为重要。文章介绍了蛋白质结晶过程中各种理化因素如蛋白质浓度、温度、PH值等对结晶质量的不同影响，并且对现今蛋白质结晶的新兴技术进行了讨论研究。
关键词：蛋白质结晶；影响因素；结晶技术
一、 前言
现今对蛋白质三维结构测定的主要手段有X射线晶体衍射技术（XRD）、核磁共振技术（NMR）和低温冷冻电镜技术（Cryo-EM）。[1]其中，X射线晶体衍射技术是获得蛋白质三维结构最普遍，最可靠的手段。而获得适合X射线晶体衍射的蛋白质晶体则是这一技术的基本要求和重要步骤。
二、蛋白质结晶化原理
蛋白质结晶化即是蛋白质在溶液中的相变过程，分为两个主要步骤：一是蛋白质晶核的形成；二是蛋白质晶核的生长。晶核的形成是结晶化的基础和核心，一般情况下，在蛋白质过饱和溶液中，大量的过饱和蛋白质容易形成稳定的非晶态沉淀或微晶，并在过饱和度的推动下使蛋白质分子有序排列，形成晶核。晶核形成后，溶液中蛋白质分子减少、饱和度下降从而处于亚稳态，溶液中的蛋白质分子有序的沿着晶核继续排列生长，当晶体长大到一定程度后，析出溶液，最终停止生长，结晶过程结束。
三、蛋白质结晶化影响因素
3.1 温度的影响
温度对蛋白质结晶的影响体现在蛋白质溶液的热历史效应和蛋白质结晶的过程影响两个方面。蛋白质溶液的热历史效应是指在保存蛋白质溶液时的保存温度。实验证明[2]蛋白质的热历史效应会影响蛋白质的结晶数目和结晶尺寸。对蛋白质溶液进行热处理可以减小晶体数量同时增加晶体尺寸。温度对蛋白质结晶过程的影响在于不同的蛋白质所需要的结晶温度不同，一般来说，大部分结晶在4～22℃下进行。
3.2 PH值的影响
PH值对蛋白质的影响体现在改变其带电性质和溶解度方面。研究表明，当PH值接近蛋白质等电点时，蛋白质所带电荷接近为0，蛋白质溶解度最低。一般来说，PH值接近蛋白质的等电点，有利于蛋白质晶体的析出。[3]当溶液PH值靠近最佳PH值时，则会形成单一晶型的高质量蛋白质晶体。
3.3 过饱和度的影响
蛋白质晶核形成的主要推动力为过饱和蛋白质溶液的过饱和度。由于由高过饱和度驱动蛋白质结晶会发生结晶缺陷和杂质引入，所以应先引入低过饱和度以延迟诱导，然后慢慢增加过饱和度最后达到临界过饱和度。大量实验表明[4]，最佳溶液的过饱和度为略微高于蛋白质溶液亚稳态区的上界，此时，在形成晶核后由于蛋白质浓度降低而直接进入亚稳态。
3.4 强迫流动环境的影响
低流速的强迫流动环境可以补充晶体周围的蛋白质空缺，使晶体界面处晶体的生长速度和蛋白质浓度达到动态平衡。实验表明，[5]低流速的强迫流动环境可以形成大而好的蛋白质晶体，而高流速的强迫流动环境则会对晶体造成缺陷，因此具有一个最佳流速，可以加快结晶形成又不会破坏晶体结构。
四、蛋白质结晶相关技术
4.1 常规结晶技术
常规的蛋白质结晶方法有：批量结晶法、蒸汽扩散法、液—液扩散法和透析结晶法四种。[6]
4.1.1 批量结晶法
现在最普遍的批量结晶法为微池法，通过计算机调控的微分布器，来精确调控微池法中液滴的组分和沉淀剂的加入量，从而使蛋白质逐渐达到低过饱和，形成结晶。
4.1.2 蒸汽扩散法
蒸汽扩散法是指将某种蛋白质结晶所需盐溶液与略低于该溶液浓度的蛋白质溶液同时放在密闭的体系内，使其蒸发扩散，最终达到平衡，最终形成结晶。
4.1.3 液—液扩散法
该法指将蛋白质溶液和沉淀剂溶液分别放于毛细管两端，使其自由扩散达到平衡，晶体将在最佳浓度梯度出生长。
4.1.4 透析结晶法
透析结晶法是将蛋白质溶液放入透析袋中，袋外为高浓度盐溶液，通过透析调节蛋白质溶液浓度，最终达到低过饱和度，形成晶体。
4.2 膜结晶技术
膜结晶技术是将膜蒸馏技术和结晶技术相耦合而产生的一种新型结晶分离技术。其原理为通过膜蒸馏技术蒸馏出溶液中的溶剂，浓缩溶质使其达到过饱和，从而形成晶核最终使溶质结晶出来。与常规结晶技术相比，膜结晶技术的优点在于结晶速度快，诱导时间短，起始浓度低，过程可操控等。[7]因此作为一种新型的结晶技术，膜结晶技术以其独特的优势迅速发展，在蛋白质等生物大分子的结晶领域有着广阔的发展前景。国内外众多实验室均通过该技术获得了质量更高的理想晶型。
4.3 微流控芯片技术
随着近年来微流体的迅速发展，微流控技术应用与蛋白质结晶条件的高通量筛选取得了显著的成果。常规的蛋白质结晶技术不可能针对所有的结晶条件都进行尝试，而且耗费大量时间、人力。而基于微流控芯片技术的高通量蛋白质结晶，则可以同时进行成百上千个蛋白质结晶实验，大大提高了结晶条件筛选效率，对加速蛋白质工程的研究进展有着重要意义。同时，微流体系统在微观尺度下具有一些宏观状态所不具备的性质，对蛋白质结晶十分有利。目前的蛋白质微流控结晶技术有如下几种[8]：微流控自由界面扩散结晶技术、微流控油下结晶技术、微流控蒸发扩散结晶技术、微流控透析结晶技术。
五、结束语
蛋白质结晶的过程十分复杂，受到多种因素的影响，通过对各种影响因素的研究，人为的调整控制蛋白质结晶过程中的条件达到最佳，对于获得高质量的蛋白质结晶有着重要的意义。近年来对于蛋白质结晶的研究不断深入，各种新型结晶技术不断出现，解决了以往的技术难题，其中膜结晶和微流控高通量结晶技术的出现更是极大地促进了蛋白质工程的快速发展。
参考文献
[1] 王宏飞， 赵岩， 刘娇， 等. 蛋白质结晶化原理及技术方法研究进展[J]. 山西大学学报： 自然科学版， 2013， 36（004）： 591-598.
[2] 解思晓， 鹿芹芹， 吴子庆， 等. 温度影响蛋白质结晶的研究现状[J]. 生物技术通讯， 2012， 23（3）： 461-464.
[3] 冯炜玮， 陈志伟. 蛋白质结晶及其影响因素研究进展[J]. 安徽农业科学， 2010 （18）： 9412-9414.
[4] 陶凤云， 张新妙， 马润宇. 蛋白质结晶过程中的影响因素[J]. 化学工业与工程， 2006， 23（3）： 260-264.
[5] 鹿芹芹， 尹大川， 刘永明， 等. 提高蛋白质晶体质量的研究进展[J]. 材料导报， 2010， 1： 025.
[6] 姬燕培， 崔虹. 蛋白质结晶研究进展[J]. 河北化工， 2012， 35（9）： 25-27.
[7] 张新妙， 马润宇. 用膜结晶技术制备蛋白质晶体的研究[J]. 第二届全国膜分离技术在食品工业中应用研讨会论文集， 2006.
关键词：蛋白质结晶；影响因素；结晶技术
一、 前言
现今对蛋白质三维结构测定的主要手段有X射线晶体衍射技术（XRD）、核磁共振技术（NMR）和低温冷冻电镜技术（Cryo-EM）。[1]其中，X射线晶体衍射技术是获得蛋白质三维结构最普遍，最可靠的手段。而获得适合X射线晶体衍射的蛋白质晶体则是这一技术的基本要求和重要步骤。
二、蛋白质结晶化原理
蛋白质结晶化即是蛋白质在溶液中的相变过程，分为两个主要步骤：一是蛋白质晶核的形成；二是蛋白质晶核的生长。晶核的形成是结晶化的基础和核心，一般情况下，在蛋白质过饱和溶液中，大量的过饱和蛋白质容易形成稳定的非晶态沉淀或微晶，并在过饱和度的推动下使蛋白质分子有序排列，形成晶核。晶核形成后，溶液中蛋白质分子减少、饱和度下降从而处于亚稳态，溶液中的蛋白质分子有序的沿着晶核继续排列生长，当晶体长大到一定程度后，析出溶液，最终停止生长，结晶过程结束。
三、蛋白质结晶化影响因素
3.1 温度的影响
温度对蛋白质结晶的影响体现在蛋白质溶液的热历史效应和蛋白质结晶的过程影响两个方面。蛋白质溶液的热历史效应是指在保存蛋白质溶液时的保存温度。实验证明[2]蛋白质的热历史效应会影响蛋白质的结晶数目和结晶尺寸。对蛋白质溶液进行热处理可以减小晶体数量同时增加晶体尺寸。温度对蛋白质结晶过程的影响在于不同的蛋白质所需要的结晶温度不同，一般来说，大部分结晶在4～22℃下进行。
3.2 PH值的影响
PH值对蛋白质的影响体现在改变其带电性质和溶解度方面。研究表明，当PH值接近蛋白质等电点时，蛋白质所带电荷接近为0，蛋白质溶解度最低。一般来说，PH值接近蛋白质的等电点，有利于蛋白质晶体的析出。[3]当溶液PH值靠近最佳PH值时，则会形成单一晶型的高质量蛋白质晶体。
3.3 过饱和度的影响
蛋白质晶核形成的主要推动力为过饱和蛋白质溶液的过饱和度。由于由高过饱和度驱动蛋白质结晶会发生结晶缺陷和杂质引入，所以应先引入低过饱和度以延迟诱导，然后慢慢增加过饱和度最后达到临界过饱和度。大量实验表明[4]，最佳溶液的过饱和度为略微高于蛋白质溶液亚稳态区的上界，此时，在形成晶核后由于蛋白质浓度降低而直接进入亚稳态。
3.4 强迫流动环境的影响
低流速的强迫流动环境可以补充晶体周围的蛋白质空缺，使晶体界面处晶体的生长速度和蛋白质浓度达到动态平衡。实验表明，[5]低流速的强迫流动环境可以形成大而好的蛋白质晶体，而高流速的强迫流动环境则会对晶体造成缺陷，因此具有一个最佳流速，可以加快结晶形成又不会破坏晶体结构。
四、蛋白质结晶相关技术
4.1 常规结晶技术
常规的蛋白质结晶方法有：批量结晶法、蒸汽扩散法、液—液扩散法和透析结晶法四种。[6]
4.1.1 批量结晶法
现在最普遍的批量结晶法为微池法，通过计算机调控的微分布器，来精确调控微池法中液滴的组分和沉淀剂的加入量，从而使蛋白质逐渐达到低过饱和，形成结晶。
4.1.2 蒸汽扩散法
蒸汽扩散法是指将某种蛋白质结晶所需盐溶液与略低于该溶液浓度的蛋白质溶液同时放在密闭的体系内，使其蒸发扩散，最终达到平衡，最终形成结晶。
4.1.3 液—液扩散法
该法指将蛋白质溶液和沉淀剂溶液分别放于毛细管两端，使其自由扩散达到平衡，晶体将在最佳浓度梯度出生长。
4.1.4 透析结晶法
透析结晶法是将蛋白质溶液放入透析袋中，袋外为高浓度盐溶液，通过透析调节蛋白质溶液浓度，最终达到低过饱和度，形成晶体。
4.2 膜结晶技术
膜结晶技术是将膜蒸馏技术和结晶技术相耦合而产生的一种新型结晶分离技术。其原理为通过膜蒸馏技术蒸馏出溶液中的溶剂，浓缩溶质使其达到过饱和，从而形成晶核最终使溶质结晶出来。与常规结晶技术相比，膜结晶技术的优点在于结晶速度快，诱导时间短，起始浓度低，过程可操控等。[7]因此作为一种新型的结晶技术，膜结晶技术以其独特的优势迅速发展，在蛋白质等生物大分子的结晶领域有着广阔的发展前景。国内外众多实验室均通过该技术获得了质量更高的理想晶型。
4.3 微流控芯片技术
随着近年来微流体的迅速发展，微流控技术应用与蛋白质结晶条件的高通量筛选取得了显著的成果。常规的蛋白质结晶技术不可能针对所有的结晶条件都进行尝试，而且耗费大量时间、人力。而基于微流控芯片技术的高通量蛋白质结晶，则可以同时进行成百上千个蛋白质结晶实验，大大提高了结晶条件筛选效率，对加速蛋白质工程的研究进展有着重要意义。同时，微流体系统在微观尺度下具有一些宏观状态所不具备的性质，对蛋白质结晶十分有利。目前的蛋白质微流控结晶技术有如下几种[8]：微流控自由界面扩散结晶技术、微流控油下结晶技术、微流控蒸发扩散结晶技术、微流控透析结晶技术。
五、结束语
蛋白质结晶的过程十分复杂，受到多种因素的影响，通过对各种影响因素的研究，人为的调整控制蛋白质结晶过程中的条件达到最佳，对于获得高质量的蛋白质结晶有着重要的意义。近年来对于蛋白质结晶的研究不断深入，各种新型结晶技术不断出现，解决了以往的技术难题，其中膜结晶和微流控高通量结晶技术的出现更是极大地促进了蛋白质工程的快速发展。
参考文献
[1] 王宏飞， 赵岩， 刘娇， 等. 蛋白质结晶化原理及技术方法研究进展[J]. 山西大学学报： 自然科学版， 2013， 36（004）： 591-598.
[2] 解思晓， 鹿芹芹， 吴子庆， 等. 温度影响蛋白质结晶的研究现状[J]. 生物技术通讯， 2012， 23（3）： 461-464.
[3] 冯炜玮， 陈志伟. 蛋白质结晶及其影响因素研究进展[J]. 安徽农业科学， 2010 （18）： 9412-9414.
[4] 陶凤云， 张新妙， 马润宇. 蛋白质结晶过程中的影响因素[J]. 化学工业与工程， 2006， 23（3）： 260-264.
[5] 鹿芹芹， 尹大川， 刘永明， 等. 提高蛋白质晶体质量的研究进展[J]. 材料导报， 2010， 1： 025.
[6] 姬燕培， 崔虹. 蛋白质结晶研究进展[J]. 河北化工， 2012， 35（9）： 25-27.
[7] 张新妙， 马润宇. 用膜结晶技术制备蛋白质晶体的研究[J]. 第二届全国膜分离技术在食品工业中应用研讨会论文集， 2006.