【摘 要】
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目的研究细胞自噬在PM2.5暴露致鼻黏膜上皮细胞炎性反应中的作用及其作用机制。方法将鼻黏膜上皮细胞暴露于不同浓度PM2.5，蛋白印记法检测不同浓度PM2.5和不同暴露时间下鼻黏膜上皮细胞微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein-1 light chain-3Ⅱ，LC3Ⅱ）及Beclin-1蛋白的表达。透射电镜下观察PM2.5暴露后鼻黏膜上皮细胞自噬体形成
【机 构】
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复旦大学附属华东医院耳鼻咽喉科，上海 200040,复旦大学附属华东医院耳鼻咽喉科，上海 200040,复旦大学附属华东医院耳鼻咽喉科，上海 200040,复旦大学环境科学与工程系，上海 200433
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目的研究细胞自噬在PM2.5暴露致鼻黏膜上皮细胞炎性反应中的作用及其作用机制。
方法将鼻黏膜上皮细胞暴露于不同浓度PM2.5，蛋白印记法检测不同浓度PM2.5和不同暴露时间下鼻黏膜上皮细胞微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（microtubule-associated protein-1 light chain-3Ⅱ，LC3Ⅱ）及Beclin-1蛋白的表达。透射电镜下观察PM2.5暴露后鼻黏膜上皮细胞自噬体形成情况；采用腺病毒mRFP-GFP-LC3转染鼻黏膜上皮细胞，激光共聚焦显微镜下观察PM2.5暴露后鼻黏膜上皮细胞自噬流变化情况。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）观察PM2.5对鼻黏膜上皮细胞炎性因子白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）表达的影响。利用自噬相关基因5（autophagy-related 5，Atg5）-siRNA及Beclin-1-siRNA特异性下调自噬水平，观察阻断细胞自噬是否可缓解PM2.5引发的鼻黏膜上皮细胞炎性反应。采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。
结果PM2.5暴露可引起鼻黏膜上皮细胞LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白表达明显升高，随着PM2.5暴露浓度升高，LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白表达量逐渐升高，呈明显的剂量依赖效应[浓度为0、15、30、60、120 μg/ml的PM2.5暴露组的LC3Ⅱ表达量分别为0.021±0.001（
±s，下同）、0.037±0.002、0.058±0.005、0.075±0.006和0.085±0.004，F=126.8，P<0.05；Beclin-1表达量分别为0.002±0.000、0.003±0.000、0.005±0.000、0.007±0.001和0.008±0.001，F=137.3，P<0.05]。随着PM2.5暴露时间延长，LC3Ⅱ及Beclin-1蛋白表达量也逐渐升高，呈明显的时间依赖效应(干预时间为0、3、6、12、24 h的PM2.5暴露组的LC3Ⅱ表达量分别为0.160±0.007、0.222±0.003、0.251±0.015、0.483±0.029和0.585±0.035，F=215.3，P<0.05；Beclin-1表达量分别为0.059±0.002、0.080±0.002、0.087±0.002、0.183±0.007和0.228±0.005，F=137.3，P<0.05)。PM2.5暴露24 h后鼻黏膜上皮细胞内可见大量特征性自噬体结构，对照组未见明显自噬体形成。将mRFP-GFP-LC3质粒转入细胞后，共聚焦显微镜下可观察到PM2.5暴露组细胞内多个明亮的黄色及红色荧光斑点，分别代表自噬体及自噬溶酶体，提示PM2.5引起了鼻黏膜上皮细胞发生自噬，自噬流顺畅。同时，PM2.5暴露组的鼻黏膜上皮细胞IL-6及TNF-α炎性因子表达上调，采用Atg5-siRNA和Beclin-1-siRNA下调细胞自噬水平可显著缓解IL-6及TNF-α炎性因子的表达。
结论细胞自噬在PM2.5暴露致鼻黏膜上皮细胞炎性反应中发挥重要作用，可诱发鼻黏膜上皮细胞IL-6及TNF-α炎性因子释放，促进鼻黏膜上皮细胞炎性反应。
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