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[摘 要]为建立适用于冬虫夏草蛋白质组学研究的双向电泳体系（2-DE），从IPG胶条pH范围、上样量、聚焦时间三个条件进行优化，实验发现，酚抽法提取冬虫夏草总蛋白质；7cm胶条pH3-10NL，上样量为450μg，等电聚焦条件为22000vh，可以获得蛋白质点较多、背景清晰、分辨率高的双向电泳图谱，为进一步深入开展冬虫夏草蛋白质组学的研究奠定了基础。对虫体和子座分别制图，发现同一冬虫夏草的虫体和子座图谱存在着不少差异，其具体联系需进一步验证。
[关键词]冬虫夏草；双向电泳；蛋白质
中图分类号：TS261.11；TQ937 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）43-0289-01
本研究目的在于探索一种高质量的冬虫夏草蛋白质提取方法及双向电泳技术体系，提高冬虫夏草蛋白质双向电泳图谱的分辨率，为进一步深入开展冬虫夏草蛋白质学的研究奠定基础。冬虫夏草分为虫和草，即虫体和子座两部分，虫体是蝙蝠蛾幼虫受感染死亡后的僵虫尸体，子座是大型真菌，虫体与子座内部的成分组成应该有很大区别，这是以往研究者忽略的地方，本研究试从冬虫夏草蛋白质进行验证。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
冬虫夏草样品均从深圳市场上大药房或冬虫夏草专营店购买所得。
1.1.2 主要仪器
PROTEAN i12 IEF等电聚焦系统、GS800校正型光密度扫描分析系统、165-8001小型垂直电泳仪。
1.2 基因验证
DNA提取采用CTAB法[1]提取，实时荧光PCR特异性检测引物和探针[2]为：
csf：5-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3，
csr：5-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3，
cs-probe：5' Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra 3'。
PCR扩增条件为95℃15s后，接下来95℃5s、65℃退火34s、共40个循环。
1.3 蛋白质提取
将冬虫夏草样品的虫体和草体分离，分别提取。
1.4 纯化及浓缩
1.5 蛋白含量的测定
蛋白浓度依据BCA蛋白定量试剂盒测定。
1.6 双向电泳实验
等电聚焦采用的是7cm胶条，程序为20℃下，最大电流为50mA，1h快速升压100V除盐，1h快速升压300V除盐，2步除盐，1h线性升压1000V，2h线性升压4000V，2h快速升压4000V，0.5h线性升压5000V，2h快速升压5000V，完成等电聚焦。最后为10h的快速500V保持。每个样品进行3个平行实验。
2 结果与分析
2.1 虫草样品的基因分析
实时荧光PCR结果：阳性模板和所购买样品的Ct值均在20左右，证明了所购虫草均是正宗冬虫夏草。
2.2 不同pH范围IPG胶条选择
相同上样量pH3-10、pH3-10NL、pH4-7胶条分别跑胶，发现pH3-10图蛋白点部分区域过于密集分布，部分区域零分布；pH3-10NL图蛋白点均匀分布在整个凝胶中，背景清晰，便于分辨，无太多的空白区域；pH4-7图pH7以上蛋白点没有得到分离，pH4端还有区域空白，pH3-10NL图是冬虫夏草双向电泳的胶条合适pH范围。
2.3 不同上样量选择
上样量分别为250μg、450μg、550μg，对比发现上样量450μg为冬虫夏草的最适上样量。
2.4 不同等电聚焦条件选择
分别选取聚焦22000vh、24000vh、26000vh进行比较，对比结果，24000vh、26000vh都有不同程度的聚焦过度，22000vh图背景干净，蛋白点清晰可辨，聚焦时间为22000vh为冬虫夏草的合适等电聚焦时间。
3 讨论与结论
3.1 样品制备
样品的制备是双向电泳的基础，是2-DE图谱分析的前提，不同的样品制备方法得到的蛋白点也不相同，分析结果也会有所不同。本人试验发现，TCA/丙酮法得到的冬虫夏草蛋白质很难重新溶解，需要通过振荡和长时间的温育增加蛋白的溶解能力，而双向电泳的基本条件之一就是保持蛋白的溶解性。酚抽法中用乙酸铵/甲醇进行沉淀，蛋白溶解性好。加上丙酮，2-D clean up kit纯化，能获得杂质少，蛋白点多的双相图谱。
3.2 等电聚焦条件的优化
冬虫夏草是“一个统一微生态系统”[1]，其僵虫体和子座内部成分在冬虫夏草的成熟过程中存在巨大的、非同步的动态变化。多次试验发现，采集时的成熟程度、存储环境、置放时间不同，造成了不同批次、不同产地、不同时期的冬虫夏草2-DE图谱的多样性，也造成了没有一个固定双向条件同时适合所有冬虫夏草的结果。本实验在胶条pH范围选择、上样量、等电聚焦时间上三个方面进行优化得出，适合冬虫夏草蛋白质双向电泳的条件是（7cm） pH3-10NL IPG胶条，上样量为450μg，聚焦条件为22000vh。
3.3 虫和子座图谱分析和讨论
子座是虫体寄生、腐生的结果[2]，这个过程一直都很神秘，其分界点也无法界定。国内虫体和子座的分别研究的情况几乎没有。本人尝试对虫体与子座进行简单的蛋白质双向图谱的对比，见图1。
对比同一冬虫夏草的虫体和子座图，子座蛋白点数量明显要多，这可能是因为子座内蛋白质更容易被提取，虫体内可溶性蛋白质比较少。虫体与子座内的蛋白质动态变化仍待进一步研究，可能为冬虫夏草这一统一微生态系统的研究寻找新的突破口。
综上所述，酚抽法提取冬虫夏草蛋白质，乙酸铵/甲醇沉淀和2-D clean up kit纯化，7cm IPG胶条pH3-10NL，上样量450μg，聚焦条件为22000vh能够获得稳定、清晰的高质量冬虫夏草双向图谱，为进一步结合质谱分析冬虫夏草蛋白质组奠定了基础。
参考文献
[1]朱佳石，吴建勇.天然冬虫夏草多菌共存生物体分子异质性的检验与讨論[J].中国细胞生物学学报，2015，2：284～298.
[2]梁宗琦，韩燕峰，梁建东，等.冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis研究中几个值得关注的问题[J].微生物学通报，2010， 11： 1692-1697.
[关键词]冬虫夏草；双向电泳；蛋白质
中图分类号：TS261.11；TQ937 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2018）43-0289-01
本研究目的在于探索一种高质量的冬虫夏草蛋白质提取方法及双向电泳技术体系，提高冬虫夏草蛋白质双向电泳图谱的分辨率，为进一步深入开展冬虫夏草蛋白质学的研究奠定基础。冬虫夏草分为虫和草，即虫体和子座两部分，虫体是蝙蝠蛾幼虫受感染死亡后的僵虫尸体，子座是大型真菌，虫体与子座内部的成分组成应该有很大区别，这是以往研究者忽略的地方，本研究试从冬虫夏草蛋白质进行验证。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
冬虫夏草样品均从深圳市场上大药房或冬虫夏草专营店购买所得。
1.1.2 主要仪器
PROTEAN i12 IEF等电聚焦系统、GS800校正型光密度扫描分析系统、165-8001小型垂直电泳仪。
1.2 基因验证
DNA提取采用CTAB法[1]提取，实时荧光PCR特异性检测引物和探针[2]为：
csf：5-CAAGGTCTCCGTTGGTGA-3，
csr：5-AACTGCTGTGGTGTTCGC-3，
cs-probe：5' Fam-CGGAGGGATCATTATCGAGTYACCACT-Tamra 3'。
PCR扩增条件为95℃15s后，接下来95℃5s、65℃退火34s、共40个循环。
1.3 蛋白质提取
将冬虫夏草样品的虫体和草体分离，分别提取。
1.4 纯化及浓缩
1.5 蛋白含量的测定
蛋白浓度依据BCA蛋白定量试剂盒测定。
1.6 双向电泳实验
等电聚焦采用的是7cm胶条，程序为20℃下，最大电流为50mA，1h快速升压100V除盐，1h快速升压300V除盐，2步除盐，1h线性升压1000V，2h线性升压4000V，2h快速升压4000V，0.5h线性升压5000V，2h快速升压5000V，完成等电聚焦。最后为10h的快速500V保持。每个样品进行3个平行实验。
2 结果与分析
2.1 虫草样品的基因分析
实时荧光PCR结果：阳性模板和所购买样品的Ct值均在20左右，证明了所购虫草均是正宗冬虫夏草。
2.2 不同pH范围IPG胶条选择
相同上样量pH3-10、pH3-10NL、pH4-7胶条分别跑胶，发现pH3-10图蛋白点部分区域过于密集分布，部分区域零分布；pH3-10NL图蛋白点均匀分布在整个凝胶中，背景清晰，便于分辨，无太多的空白区域；pH4-7图pH7以上蛋白点没有得到分离，pH4端还有区域空白，pH3-10NL图是冬虫夏草双向电泳的胶条合适pH范围。
2.3 不同上样量选择
上样量分别为250μg、450μg、550μg，对比发现上样量450μg为冬虫夏草的最适上样量。
2.4 不同等电聚焦条件选择
分别选取聚焦22000vh、24000vh、26000vh进行比较，对比结果，24000vh、26000vh都有不同程度的聚焦过度，22000vh图背景干净，蛋白点清晰可辨，聚焦时间为22000vh为冬虫夏草的合适等电聚焦时间。
3 讨论与结论
3.1 样品制备
样品的制备是双向电泳的基础，是2-DE图谱分析的前提，不同的样品制备方法得到的蛋白点也不相同，分析结果也会有所不同。本人试验发现，TCA/丙酮法得到的冬虫夏草蛋白质很难重新溶解，需要通过振荡和长时间的温育增加蛋白的溶解能力，而双向电泳的基本条件之一就是保持蛋白的溶解性。酚抽法中用乙酸铵/甲醇进行沉淀，蛋白溶解性好。加上丙酮，2-D clean up kit纯化，能获得杂质少，蛋白点多的双相图谱。
3.2 等电聚焦条件的优化
冬虫夏草是“一个统一微生态系统”[1]，其僵虫体和子座内部成分在冬虫夏草的成熟过程中存在巨大的、非同步的动态变化。多次试验发现，采集时的成熟程度、存储环境、置放时间不同，造成了不同批次、不同产地、不同时期的冬虫夏草2-DE图谱的多样性，也造成了没有一个固定双向条件同时适合所有冬虫夏草的结果。本实验在胶条pH范围选择、上样量、等电聚焦时间上三个方面进行优化得出，适合冬虫夏草蛋白质双向电泳的条件是（7cm） pH3-10NL IPG胶条，上样量为450μg，聚焦条件为22000vh。
3.3 虫和子座图谱分析和讨论
子座是虫体寄生、腐生的结果[2]，这个过程一直都很神秘，其分界点也无法界定。国内虫体和子座的分别研究的情况几乎没有。本人尝试对虫体与子座进行简单的蛋白质双向图谱的对比，见图1。
对比同一冬虫夏草的虫体和子座图，子座蛋白点数量明显要多，这可能是因为子座内蛋白质更容易被提取，虫体内可溶性蛋白质比较少。虫体与子座内的蛋白质动态变化仍待进一步研究，可能为冬虫夏草这一统一微生态系统的研究寻找新的突破口。
综上所述，酚抽法提取冬虫夏草蛋白质，乙酸铵/甲醇沉淀和2-D clean up kit纯化，7cm IPG胶条pH3-10NL，上样量450μg，聚焦条件为22000vh能够获得稳定、清晰的高质量冬虫夏草双向图谱，为进一步结合质谱分析冬虫夏草蛋白质组奠定了基础。
参考文献
[1]朱佳石，吴建勇.天然冬虫夏草多菌共存生物体分子异质性的检验与讨論[J].中国细胞生物学学报，2015，2：284～298.
[2]梁宗琦，韩燕峰，梁建东，等.冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis研究中几个值得关注的问题[J].微生物学通报，2010， 11： 1692-1697.