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摘 要：半胱氨酸蛋白酶是人体自身产生的重要酶类物质，它广泛的参与人体新陈代谢和蛋白的水解。但过量产生的半胱氨酸蛋白酶会导致骨质疏松和乳腺癌。腈基类化合物分子是一种新发现的具有抑制半胱氨酸蛋白酶作用的靶向药物分子，高效且低副作用。但是它的抑制机理一直没有得到解决。本文介绍借助量子力学/分子力学（QM/MM）的计算研究，解得了此类化合物对于半胱氨酸蛋白酶的抑制机理，并借助分子学软件设计了一种新型药物分子，有助进一步药物研究。
关键词：半胱氨酸蛋白酶 组织蛋白酶K 量子力学/分子力学（QM/MM）
中图分类号：R969.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）04（b）-0097-04
The Mechanism of Inhibition of Cysteine Protease
ZHAO Yunfei
（School of Life Science， Tsinghua University， Beijing）
Abstract： Cysteine protease is a vital enzyme for human metabolism and involved in a proteolysis reaction in human body. However， over-expressed cysteine proteases can cause serious diseases such as osteoporosis and breast cancer. Nitrile-based inhibitors are newly-discovered substrates as well as drugs which can inhibit cysteine proteases with high efficiency and low side-effects. However， the mechanism of inhibition remains unknown. This paper illustrates a novel computational calculation performed by quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM） to resolve this mechanism. We find a stepwise mechanism whereby the deprotonated anionic sulfur atom from cysteine of the active site of Cathepsin K attacks a nitrile containing substrate to form an intermediate structure， followed by a deprotonation reaction to form a lower energy product state structure， and therefore， this mechanism of inhibition of cysteine protease has been resolved.
Keywords： Cysteine protease Cathepsin K quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM）
1 概况
半胱氨酸酶作为六大酶类之一，广泛存在于各种生物有机体内，如病毒、细菌、原生动物、植物和哺乳动物[1]，主要参与人体新陈代谢和蛋白质的水解。近年来，人类成功的从植物中提取出半胱氨酸酶作为药物治疗肠内蠕虫的感染[2]。它对结籽期内植物的生长和人类骨骼的发育起着至关重要的作用。
半胱氨酸酶的蛋白质水解途径如图1所示。它的催化位点由一个带硫基的半胱氨酸基团和一个组氨酸基团组成[3]。尽管蛋白质的水解过程是不可逆的，但在一些特定的条件下，蛋白质会通过一系列转录后的修饰，使得原先的不可逆变成可逆。
组织蛋白酶是半胱氨酸酶家族中的一类，可细分成组织蛋白酶B、C、F、H、K、L1、O、S、W和Z。组织蛋白酶K将作为半胱氨酸酸酶的代表被本文所研究，因为其主要参与了人体的骨吸收作用[4]并首次发现于兔子的破骨细胞中，且同样大量产生于人体的破骨细胞。过程如图2所示。
组织蛋白酶K的功能在于通过水解人体胶原蛋白和弹性蛋白达到骨质破坏的作用，此功能在人体骨骼生长时起着至关重要的作用。组织蛋白酶K的缺失会导致骨质的脆性增大，病人容易患致密性成骨不全症[5]。相反，过量的产生组织蛋白酶K会侵蚀骨基质蛋白，如骨桥蛋白、骨粘连蛋白、胶原蛋白I和II，导致骨关节炎和骨质疏松[6]。同时，过量的组织蛋白酶K会大大增加得乳腺癌的风险，并因此血液中组织蛋白酶K浓度的检测已作为诊断乳腺癌的重要指标之一，因为破骨细胞对胶原蛋白的破坏有助于癌细胞的增长和扩散[7]且乳腺癌细胞也能够大量产生过量的组织蛋白酶K。
2 理论与模型
以前的化学家利用塑料制的棍子来为自己搭建化学分子式的3D模型。如今我们利用基于经典物理学和量子力学原理的软件来设计最优化的分子结构模型，例如一个化学分子中键与键之间的夹角，以及原子与原子之间的距离，都可以通过计算使得分子的空间结构最优化（分子结构式能量最低）。计算机模型的介入对于我们研究反应速度极快的酶反应过程中的不稳定中间体和过度状态带来巨大的帮助，因为到目前为止，对于酶反应过程中的中间体的分子3D结构，在实验室条件下还无法观测。
分子力学（MM）是基于经典物理学的理论，用于阐述分子结构式的空间结构和分子势能的计算。在MM的计算原理中，因为它忽略了分子系统中电子和原子核之间的相互作用，所以它不能够用于计算化学反应中有键与键的断裂或形成的分子势能。但是它仍然可以精确的计算出大分子量（由上千原子组成）的分子结构式。 量子力学（QM）相对于分子力学而言，它更侧重于计算出电子和原子核之间的相互作用力。量子力学/分子力学（QM/MM）的计算方法则可以精确的计算出酶分子在反应过程中任意阶段的分子势能的变化。因为它将酶分子的势能分开单独计算，活性催化位点（反应过程中包含大量分子键的断裂和形成，原子数量一般在60个左右）利用QM来计算，而其余惰性分子区域（包括包裹在酶分子周围的水分子）则采用MM计算方法。
目前，半胱氨酸抑制剂主要可分为羰基类化合物、腈基类化合物和其它与半胱氨酸酶非共价结合类抑制物。半胱氨酸酶抑制剂的发展史可以被认为是与半胱氨酸酶的不可逆结合到可逆结合。尽管非共价结合抑制物已经被广泛发现，但大多数都属于多肽大分子化合物，由于它们的大分子量和大体积以至于它们的抑制效果非常不好。不可逆结合类抑制物曾在过去一段时间内非常流行，因为此类化合物具有极强的靶向型并被多篇研究报道以及市场化。然而近期我们发现此类药物在长期服用的情况下会导致免疫性和抗原性的并发症。所以，研究人员越来越倾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。
腈基类化合物作为小分子、共价结合类抑制剂具有极为优越的高效、低毒效果受到人们青睐，但其抑制机理从未被揭示。本研究将利用计算机模型计算的方法，证实我们假设的腈基类化合物的抑制机理的可行性（图3所示）。
3 结论
我们通过对腈基类化合物与组织蛋白酶K的结合物系统进行结构优化后，得到的产物结构（QM部分）如图4所示；能量扫描结构图像如图5所示。
通过对图5所得到的结构能量扫描图的分析，其符合生化反应的能量变化规律。且我们通过QM/MM计算方式，系统成功的得到我们想要的最优化的系统反应中间态。充分证明了我们设想的腈基类化合物的抑制机理的可行性（图3）。其中我们设计的新型腈基类抑制底物具有临床研究价值。
4 实验部分
首先，我们使用Gaussian View软件去设计最初的一种腈基类抑制化合物，再通过UB3LYP（6-31G）计算程序对化合物分子结构进行优化，优化前后的分子空间结构如图6所示。我们发现优化后的分子能量（kcal mol-1）比优化前低（ΔE= -1838.6），说明优化后的结构比优化前稳定的多。
其次，我们从PDB文件（1U9V）中删除原先的抑制分子IHE，利用Chimera软件将新设计的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住组织蛋白酶K的催化位点（由CYS 25和HIS 162组成）（图7）。基于QM/MM的理论，利用Multilayer Onion Model计算方法我们将CYS 25中的硫原子设为中心点，与之长度为8 Angstroms的空间内包含的所有原子设定为QM区域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM区域内。其余都设定为MM区域（包含3160个原子）。用程序UB3LYP（6-31G）优化QM区域。用程序UFF优化MM区域。再利用CHARMM软件向最新优化后的PDB文件中加入水分子，将整个体系包含在直径为60 Angstroms的水球内，如图8所示。
最后，我们将加入水分子后的大系统通过之前同样的Multilayer Onion Model计算方法将系统结构优化，得到最终的能量最低的产物状态（C），随后我们依照图3的反应式往回通过扫描式计算的方法得到中间态的产物结构。首先，我们切断带有腈基集团底物上的N-H键，并同时缩小H 3248和与之相邻的组氨酸集团（HIS 162）的N 2361之间的距离，通过输入指令：
3248 2361 S 10 -0.05
表明我们人为通过10个反应步骤（步步使用Multilayer Onion Model计算方法进行系统优化）缩小H 3248和N 2361的距离，每一步的缩小距离是0.05 angstroms。我们得到扫描式计算中能量最高点的系统结构（TSB）和能量最低点的系统结构（B）。所有原子的数值标记都根据原始GJF文件。
我们随之将系统结构B依照图三的反应式继续往回通过同样的扫描计算式方法，首先切断中间底物（腈基化合物）的C-S键，并同时增大S 367与之相邻的半胱氨酸基团（CYS 25）的C 3249之间的距离，通过输入指令：
3249 367 S 10 0.1
表明我们人为通过10个反应步骤（步步使用Multilayer Onion Model计算方法进行系统优化）增加S 367和C 3249的距离，每一步的增加距离是0.1 angstroms。
最终，我们从结合物C逆计算得到产物A、TSA、B、TSB的结构如图9所示。
参考文献
[1] Barrett， A. In Proteinase Inhibitors； Barrett， A.， Salvesen， G.， Eds.； Elsevier： Amsterdam， 1986-3-22.
[2] Sharma， A.； Padwal-Desai， S.； Ninjoor， V. Biochem. Biophys.， Res. Commun. 1989， 159， 464-471.Scottk. Thompson， Stacie M. Halbert， Mary J. Bossard[J].Proc， Natl. Acad， Sci， USA， 1997，94：14249-14254.
[3]Garnero P， Sornary-Rendu E， Chapuy MC， Delmas PD. J. Bone Miner Res. 1996； 11： 337-49.Andrew D. Morley， Peter W. Kenny[J].Bioorg. Med. Chem. Lett.，2009，19：1658-1661.
[4] Le Gall C， Bellahcene A， Bonnelve E， Cancer Res[J].2007，67（20）： 9894-902.
[5] Jiaqiang Cai，Craig Jamieson， Jennifer Moir，et al.Cathepsin K inhibitors，2000-2004，Expert. Opin.Ther[J].2005，15（1）：33-48.
[6] Eva Altmann.2-Cyano-pyrimidines：A New Chemotype for Inhibitors of the Cysteine Protease Cathepsin K[J].Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（4）：591-594.
[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.
关键词：半胱氨酸蛋白酶 组织蛋白酶K 量子力学/分子力学（QM/MM）
中图分类号：R969.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）04（b）-0097-04
The Mechanism of Inhibition of Cysteine Protease
ZHAO Yunfei
（School of Life Science， Tsinghua University， Beijing）
Abstract： Cysteine protease is a vital enzyme for human metabolism and involved in a proteolysis reaction in human body. However， over-expressed cysteine proteases can cause serious diseases such as osteoporosis and breast cancer. Nitrile-based inhibitors are newly-discovered substrates as well as drugs which can inhibit cysteine proteases with high efficiency and low side-effects. However， the mechanism of inhibition remains unknown. This paper illustrates a novel computational calculation performed by quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM） to resolve this mechanism. We find a stepwise mechanism whereby the deprotonated anionic sulfur atom from cysteine of the active site of Cathepsin K attacks a nitrile containing substrate to form an intermediate structure， followed by a deprotonation reaction to form a lower energy product state structure， and therefore， this mechanism of inhibition of cysteine protease has been resolved.
Keywords： Cysteine protease Cathepsin K quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM）
1 概况
半胱氨酸酶作为六大酶类之一，广泛存在于各种生物有机体内，如病毒、细菌、原生动物、植物和哺乳动物[1]，主要参与人体新陈代谢和蛋白质的水解。近年来，人类成功的从植物中提取出半胱氨酸酶作为药物治疗肠内蠕虫的感染[2]。它对结籽期内植物的生长和人类骨骼的发育起着至关重要的作用。
半胱氨酸酶的蛋白质水解途径如图1所示。它的催化位点由一个带硫基的半胱氨酸基团和一个组氨酸基团组成[3]。尽管蛋白质的水解过程是不可逆的，但在一些特定的条件下，蛋白质会通过一系列转录后的修饰，使得原先的不可逆变成可逆。
组织蛋白酶是半胱氨酸酶家族中的一类，可细分成组织蛋白酶B、C、F、H、K、L1、O、S、W和Z。组织蛋白酶K将作为半胱氨酸酸酶的代表被本文所研究，因为其主要参与了人体的骨吸收作用[4]并首次发现于兔子的破骨细胞中，且同样大量产生于人体的破骨细胞。过程如图2所示。
组织蛋白酶K的功能在于通过水解人体胶原蛋白和弹性蛋白达到骨质破坏的作用，此功能在人体骨骼生长时起着至关重要的作用。组织蛋白酶K的缺失会导致骨质的脆性增大，病人容易患致密性成骨不全症[5]。相反，过量的产生组织蛋白酶K会侵蚀骨基质蛋白，如骨桥蛋白、骨粘连蛋白、胶原蛋白I和II，导致骨关节炎和骨质疏松[6]。同时，过量的组织蛋白酶K会大大增加得乳腺癌的风险，并因此血液中组织蛋白酶K浓度的检测已作为诊断乳腺癌的重要指标之一，因为破骨细胞对胶原蛋白的破坏有助于癌细胞的增长和扩散[7]且乳腺癌细胞也能够大量产生过量的组织蛋白酶K。
2 理论与模型
以前的化学家利用塑料制的棍子来为自己搭建化学分子式的3D模型。如今我们利用基于经典物理学和量子力学原理的软件来设计最优化的分子结构模型，例如一个化学分子中键与键之间的夹角，以及原子与原子之间的距离，都可以通过计算使得分子的空间结构最优化（分子结构式能量最低）。计算机模型的介入对于我们研究反应速度极快的酶反应过程中的不稳定中间体和过度状态带来巨大的帮助，因为到目前为止，对于酶反应过程中的中间体的分子3D结构，在实验室条件下还无法观测。
分子力学（MM）是基于经典物理学的理论，用于阐述分子结构式的空间结构和分子势能的计算。在MM的计算原理中，因为它忽略了分子系统中电子和原子核之间的相互作用，所以它不能够用于计算化学反应中有键与键的断裂或形成的分子势能。但是它仍然可以精确的计算出大分子量（由上千原子组成）的分子结构式。 量子力学（QM）相对于分子力学而言，它更侧重于计算出电子和原子核之间的相互作用力。量子力学/分子力学（QM/MM）的计算方法则可以精确的计算出酶分子在反应过程中任意阶段的分子势能的变化。因为它将酶分子的势能分开单独计算，活性催化位点（反应过程中包含大量分子键的断裂和形成，原子数量一般在60个左右）利用QM来计算，而其余惰性分子区域（包括包裹在酶分子周围的水分子）则采用MM计算方法。
目前，半胱氨酸抑制剂主要可分为羰基类化合物、腈基类化合物和其它与半胱氨酸酶非共价结合类抑制物。半胱氨酸酶抑制剂的发展史可以被认为是与半胱氨酸酶的不可逆结合到可逆结合。尽管非共价结合抑制物已经被广泛发现，但大多数都属于多肽大分子化合物，由于它们的大分子量和大体积以至于它们的抑制效果非常不好。不可逆结合类抑制物曾在过去一段时间内非常流行，因为此类化合物具有极强的靶向型并被多篇研究报道以及市场化。然而近期我们发现此类药物在长期服用的情况下会导致免疫性和抗原性的并发症。所以，研究人员越来越倾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。
腈基类化合物作为小分子、共价结合类抑制剂具有极为优越的高效、低毒效果受到人们青睐，但其抑制机理从未被揭示。本研究将利用计算机模型计算的方法，证实我们假设的腈基类化合物的抑制机理的可行性（图3所示）。
3 结论
我们通过对腈基类化合物与组织蛋白酶K的结合物系统进行结构优化后，得到的产物结构（QM部分）如图4所示；能量扫描结构图像如图5所示。
通过对图5所得到的结构能量扫描图的分析，其符合生化反应的能量变化规律。且我们通过QM/MM计算方式，系统成功的得到我们想要的最优化的系统反应中间态。充分证明了我们设想的腈基类化合物的抑制机理的可行性（图3）。其中我们设计的新型腈基类抑制底物具有临床研究价值。
4 实验部分
首先，我们使用Gaussian View软件去设计最初的一种腈基类抑制化合物，再通过UB3LYP（6-31G）计算程序对化合物分子结构进行优化，优化前后的分子空间结构如图6所示。我们发现优化后的分子能量（kcal mol-1）比优化前低（ΔE= -1838.6），说明优化后的结构比优化前稳定的多。
其次，我们从PDB文件（1U9V）中删除原先的抑制分子IHE，利用Chimera软件将新设计的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住组织蛋白酶K的催化位点（由CYS 25和HIS 162组成）（图7）。基于QM/MM的理论，利用Multilayer Onion Model计算方法我们将CYS 25中的硫原子设为中心点，与之长度为8 Angstroms的空间内包含的所有原子设定为QM区域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM区域内。其余都设定为MM区域（包含3160个原子）。用程序UB3LYP（6-31G）优化QM区域。用程序UFF优化MM区域。再利用CHARMM软件向最新优化后的PDB文件中加入水分子，将整个体系包含在直径为60 Angstroms的水球内，如图8所示。
最后，我们将加入水分子后的大系统通过之前同样的Multilayer Onion Model计算方法将系统结构优化，得到最终的能量最低的产物状态（C），随后我们依照图3的反应式往回通过扫描式计算的方法得到中间态的产物结构。首先，我们切断带有腈基集团底物上的N-H键，并同时缩小H 3248和与之相邻的组氨酸集团（HIS 162）的N 2361之间的距离，通过输入指令：
3248 2361 S 10 -0.05
表明我们人为通过10个反应步骤（步步使用Multilayer Onion Model计算方法进行系统优化）缩小H 3248和N 2361的距离，每一步的缩小距离是0.05 angstroms。我们得到扫描式计算中能量最高点的系统结构（TSB）和能量最低点的系统结构（B）。所有原子的数值标记都根据原始GJF文件。
我们随之将系统结构B依照图三的反应式继续往回通过同样的扫描计算式方法，首先切断中间底物（腈基化合物）的C-S键，并同时增大S 367与之相邻的半胱氨酸基团（CYS 25）的C 3249之间的距离，通过输入指令：
3249 367 S 10 0.1
表明我们人为通过10个反应步骤（步步使用Multilayer Onion Model计算方法进行系统优化）增加S 367和C 3249的距离，每一步的增加距离是0.1 angstroms。
最终，我们从结合物C逆计算得到产物A、TSA、B、TSB的结构如图9所示。
参考文献
[1] Barrett， A. In Proteinase Inhibitors； Barrett， A.， Salvesen， G.， Eds.； Elsevier： Amsterdam， 1986-3-22.
[2] Sharma， A.； Padwal-Desai， S.； Ninjoor， V. Biochem. Biophys.， Res. Commun. 1989， 159， 464-471.Scottk. Thompson， Stacie M. Halbert， Mary J. Bossard[J].Proc， Natl. Acad， Sci， USA， 1997，94：14249-14254.
[3]Garnero P， Sornary-Rendu E， Chapuy MC， Delmas PD. J. Bone Miner Res. 1996； 11： 337-49.Andrew D. Morley， Peter W. Kenny[J].Bioorg. Med. Chem. Lett.，2009，19：1658-1661.
[4] Le Gall C， Bellahcene A， Bonnelve E， Cancer Res[J].2007，67（20）： 9894-902.
[5] Jiaqiang Cai，Craig Jamieson， Jennifer Moir，et al.Cathepsin K inhibitors，2000-2004，Expert. Opin.Ther[J].2005，15（1）：33-48.
[6] Eva Altmann.2-Cyano-pyrimidines：A New Chemotype for Inhibitors of the Cysteine Protease Cathepsin K[J].Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（4）：591-594.
[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.