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摘要：目的 考察仙鹤草不同提取部位的抗炎作用。方法 采用醋酸扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀法、磷酸组胺致毛细血管通透性增加实验，探讨仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位、仙鹤草乙酸乙酯提取部位的抗炎作用。结果 与模型组比较，仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位能减少醋酸所致小鼠扭体次数（P<0.05、P<0.05）、能抑制二甲苯致小鼠耳肿胀（P<0.05、P<0.05），能够降低磷酸组胺致小鼠毛细血管通透性增加（P<0.05、P<0.05）。结论 仙鹤草具有明显的抗急性炎症的作用，其活性主要集中于正丁醇提取部位。
关键词：仙鹤草;有效提取部位;抗炎
中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）01-0064-03
【Abstract】Objective： To study the anti-inflammatory effect of different extracted parts of Agrimonia. Methods： The experiments of acetic acid writhing method， xylene-induced ear swelling in mice， and histamine phosphate-induced increase in capillary permeability were used to explore the anti-inflammatory effects of the different parts of Agrimonia for the extraction of alcohol， n-butanol and the ethyl acetate. Results： Compared with the model group， the parts of alcohol and n-butanol could reduce the number of writhing in mice caused by acetic acid （P<0.05， P<0.05）， and could suppress xylene-induced ear swelling in mice （P<0.05， P<0.05）， and reduce the increase of capillary permeability in mice induced by histamine phosphate （P<0.05， P<0.05）. Conclusion： Agrimonia has obvious anti-inflammatory effect and its activity is mainly concentrated in the part of n-butanol extraction.
【Key words】Agrimony， effective extraction part， anti-inflammatory
仙鹤草又名脱力草、龙牙草，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒、补虚功效，临床上常用于咯血、吐血等各种出血症[1]。研究表明仙鹤草醇提取物具有一定的镇痛抗炎作用[2]，但其主要活性部位尚不清楚，为探讨其主要活性部位，本研究对仙鹤草采用极性分离法得到的仙鹤草醇提取物、正丁醇提取物及乙酸乙酯提取物，采用醋酸致小鼠扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀法及磷酸组胺致毛细血管通透性增加实验，对仙鹤草不同提取部位进行抗炎作用的研究，现将研究结果报道如下。
1 材料
1.1 实验动物 SPF级，昆明种小鼠雌雄各半，18-22 g，许可证号：SCXF（辽）2015-0001。
1.2 药物及试剂 布洛芬片，云南植物药业有限公司（批号：20161002）;磷酸组胺，上海生工生物工程股份有限公司（批号：B326BA1896）;氢化可的松，上海麦克林生化科技有限公司（批号：C10113013）;伊文思兰，sigma（批号：MKCB2532V）。
1.3 实验仪器 旋转蒸发仪，型号：RE—501，山东博科科学仪器有限公司。
2 实验方法
2.1 仙鹤草不同提取物的制备 取仙鹤草1000 g，采用70%乙醇回流提取3次，每次提取时间分别为3 h、2 h、1h共计5h，合并三次滤液，使用旋转蒸发仪回收乙醇、真空干燥得乙醇提取部位100.10 g;取部分仙鹤草醇提取部位用超纯水均匀分散，以等体积乙酸乙酯连续萃取6次，合并上层滤液，回收下层溶液浓缩干燥得乙酸乙酯提取部位25.15 g;上层滤液用等体积正丁醇萃取6次，浓缩干燥得正丁醇提取部位24.85 g。
2.2 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 选择健康昆明种小鼠（18-22 g）100只，随机分为5组，每组20只，分别为模型组（超纯水）、阳性药组（布洛芬，104 mg/Kg）、仙鹤草组（仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位，40 g生药/kg），每组雌雄各半，给药1h后腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 mL/只，观察小鼠扭体反应，并记录小鼠记录小鼠15 min内出现的扭体次数，计算小鼠疼痛的抑制率，疼痛抑制率=（模型组扭体次数-给药组扭体次数）/模型组扭体次数×100%[3]。
2.3 仙鹤草不同提取物的抗炎作用
2.3.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 给药方法、分组及剂量同“2.2项”，阳性组给予氢化可的松（20 mg/Kg），各组给药后1h，分别精密吸取二甲苯10 uL均匀涂布于各组小鼠右耳上、下两面，左耳不涂作自身对照。于涂耳30 min后处死小鼠，沿小鼠耳廓基线剪下两耳，采用6 mm直径打孔器于左右耳对称部位打下耳片，用精密电子天平称取耳质量，计算耳肿胀度和耳肿胀抑制率。小鼠耳肿胀度=（右耳質量-左耳质量）/左耳质量×100%]。小鼠耳肿胀抑制率（%）=（模型组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/模型组耳肿胀度×100%[4]。 2.3.2 对磷组胺致小鼠毛细血管通透性升高的影响 给药方法、分组及剂量同“2.3.1项”，小鼠于实验前1天背部用8%硫化钠脱毛（3 cm×3 cm），次日再给药1h后在小鼠背部脱毛处中间位置皮内注射0.1%（现用现配）磷酸组胺0.06 mL/只，随后立即尾静脉注射0.5%（5 mL/kg）伊文思兰，注射伊文思兰15 min后颈椎脱臼处死小鼠，取下小鼠蓝染部位皮肤打四个孔（9 mm/孔），剪碎后浸泡于1 mL丙酮-生理盐水（7：3）溶液中，48 h后离心（3000 r/min，10min），取上清液，于波长620 nm处测定吸光度值[5-6]。
2.4 统计学处理 各给药组与模型组比较，统计数据用均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 与模型组比较，布洛芬对照组、仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位能够减少小鼠扭体次数，差异有统计学意义（P<0.001、P<0.05、P<0.05），仙鹤草乙酸乙酯提取部位能够减少小鼠扭体次数，但无统计学意义（P>0.05），结果如表1。
3.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀影响 与模型组比较，氢化可的松对照组、仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位均能抑制小鼠耳肿胀度，差异有统计学意义（P<0.001、P<0.05、P<0.05），仙鹤草乙酸酯提取部位能够抑制小鼠耳肿胀度，但差异无统计学意义，结果如表2。
3.3 对磷酸组胺致小鼠毛细血管通透性升高的影响 与模型组比较，氢化可的松对照组、仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位、仙鹤草乙酸乙酯提取部位均能降低小鼠毛细血管通透性，差异有统计学意义（P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.05），结果如表3。
4 讨论
炎症是具有血管系统的活体组织对致炎因子所发生的防御反应[7]。根据炎症发生的快慢和持续时间可分为以毛细血管通透性升高为特征的急性炎症阶段，以白细胞浸润和巨噬细胞的吞噬为特征的亚急性阶段，及以组织变性和纤维化为特征的慢性炎症阶段[8-10]。目前，临床使用抗炎药有非甾体类、甾体类抗炎药。非甾体类药物长时间服用易引起胃肠道、肝、肾损伤甚至消化道出血等不良反应。甾体类抗炎药以激素為主，长期使用易引发医源性身上皮质功能亢进、加重感染及胃溃疡，甚至引发无菌性骨坏死等不良反应[11-12]。因此，寻找新型抗炎药物具有重要的现实意义。能引起炎症反应的致炎因子种类较多，包括物理性因子、化学性因子和生物性因子等，醋酸作为一种化学性致炎因子，在注射小鼠腹腔内会引起小鼠产生持久、深部的疼痛，小鼠会出现扭体现象，主要用于外周镇痛药的筛选[13-14];组胺主要存在于皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞中，当组织受到损伤及在炎症反应急性期，组胺与血管内皮细胞受体结合后，致使内皮细胞迅速收缩，内皮细胞之间的连接缝隙变大，血管通透性升高[15];二甲苯是可以使炎症介质溶解释放，使毛细血管通透性升高，炎性细胞浸润，造成耳部急性渗出性炎症水肿[16]。因此，本研究对仙鹤草采用极性分离方法得到仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位，采用醋酸扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀法，磷酸组胺致小鼠毛细血管通透性增加实验，在等生粉剂量下进行仙鹤草抗炎活性筛选。研究结果显示，仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位能减少小鼠扭体次数、抑制小鼠耳廓肿胀度，能降低小鼠毛细血管通透性增加，提示仙鹤草醇提取物、正丁醇提物可以通过抗急性炎症达到镇痛的作用，其活性成分主要集中在仙鹤草正丁醇提取物，但对其作用机制及主要抗炎活性成分有待于下一步深入研究。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典·2015版一部[S].北京：中国医药科技出社，2015：102-103.
[2]龚纯贵，张庆国，王希营，等.仙鹤草提取物镇痛抗炎实验的实验研究[J].药学实践杂志，2006，24（6）：339-356.
[3]黄艳，武旭，陈明生，等.粗齿冷水花乙酸乙酯部位的抗炎镇痛作用研究[J].中医药导报，2017，23（22）：29-32.
[4]陈博欣，汤雪纯，刘燕玲，等.六经辨证法浅谈半夏厚朴汤抗炎镇痛作用[J/OL].中医临床研究：1-2[2019-06-09].httP：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.5895.R.20190506.1706.004.html.
[5]史宁，郭宏举，王欢，等.金丝桃苷对急性炎症疼痛模型小鼠的抗炎镇痛作用研究[J].药物评价研究，2016，39（5）：771-774.
[6]段小花，杨莲，李钦，等.皮内与皮下注射磷酸组胺对皮肤毛细血管通透性实验结果的影响[J].云南中医学院学报，2008，31（4）：35-37.
[7]Ma Y，Luo Y，Song L，et al.[Pharmaceutical screening of the effective fraction from Smilax for treatment of chronic Pelvic inflammatory disease][J].Journal of Southern Medical University，2013，33（1）：145-149.
[8]胡超群，王湘妍，段梦迪，等.抗感败毒口服液解热镇痛抗炎试验[J].中国兽医杂志，2017（1）：108-110.
[9]Rocha F，Dias J，Geurden I，et al.Dietary glucose stimulus at larval stage modifies the carbohydrate metabolic Pathway in gilthead seabream（SParus aurata）juveniles：An in vivo aPProach using（14）C-starch[J].ComParative Biochemistry & Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology，2016，201：189-199.
[10]付雯雯，江一川，张虹，等.乌头注射液对不同阶段炎症动物模型的抗炎作用[J].吉林大学学报（医学版），2015，41（3）：568-572.
[11]朱依谆，殷明.药理学[M].北京：人民卫生出版社，2016.
[12]冯建峰，赵青山.非甾体类抗炎药相关性消化性溃疡出血的临床分析[J].实用医学杂志，2018，34（9）：118-120.
[13]张彩平，申慧珍.非甾体类抗炎药的不良反应表现及预防措施的探讨[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（95）：32-33+43.
[14]高华.药理学实验方法[M].北京：中国医药科技出版社，2012.
[15]许莉莉，杨向东，葛均波.组胺与固有免疫调控及其在心血管疾病中的作用[J].中国动脉硬化杂志，2017，25（1）：83-89.
[16]李义奎，王钦茂.中药药理实验方法学[J].上海：科学技术出版社，2006：302-307.
（收稿日期：2019-09-29）
关键词：仙鹤草;有效提取部位;抗炎
中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）01-0064-03
【Abstract】Objective： To study the anti-inflammatory effect of different extracted parts of Agrimonia. Methods： The experiments of acetic acid writhing method， xylene-induced ear swelling in mice， and histamine phosphate-induced increase in capillary permeability were used to explore the anti-inflammatory effects of the different parts of Agrimonia for the extraction of alcohol， n-butanol and the ethyl acetate. Results： Compared with the model group， the parts of alcohol and n-butanol could reduce the number of writhing in mice caused by acetic acid （P<0.05， P<0.05）， and could suppress xylene-induced ear swelling in mice （P<0.05， P<0.05）， and reduce the increase of capillary permeability in mice induced by histamine phosphate （P<0.05， P<0.05）. Conclusion： Agrimonia has obvious anti-inflammatory effect and its activity is mainly concentrated in the part of n-butanol extraction.
【Key words】Agrimony， effective extraction part， anti-inflammatory
仙鹤草又名脱力草、龙牙草，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒、补虚功效，临床上常用于咯血、吐血等各种出血症[1]。研究表明仙鹤草醇提取物具有一定的镇痛抗炎作用[2]，但其主要活性部位尚不清楚，为探讨其主要活性部位，本研究对仙鹤草采用极性分离法得到的仙鹤草醇提取物、正丁醇提取物及乙酸乙酯提取物，采用醋酸致小鼠扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀法及磷酸组胺致毛细血管通透性增加实验，对仙鹤草不同提取部位进行抗炎作用的研究，现将研究结果报道如下。
1 材料
1.1 实验动物 SPF级，昆明种小鼠雌雄各半，18-22 g，许可证号：SCXF（辽）2015-0001。
1.2 药物及试剂 布洛芬片，云南植物药业有限公司（批号：20161002）;磷酸组胺，上海生工生物工程股份有限公司（批号：B326BA1896）;氢化可的松，上海麦克林生化科技有限公司（批号：C10113013）;伊文思兰，sigma（批号：MKCB2532V）。
1.3 实验仪器 旋转蒸发仪，型号：RE—501，山东博科科学仪器有限公司。
2 实验方法
2.1 仙鹤草不同提取物的制备 取仙鹤草1000 g，采用70%乙醇回流提取3次，每次提取时间分别为3 h、2 h、1h共计5h，合并三次滤液，使用旋转蒸发仪回收乙醇、真空干燥得乙醇提取部位100.10 g;取部分仙鹤草醇提取部位用超纯水均匀分散，以等体积乙酸乙酯连续萃取6次，合并上层滤液，回收下层溶液浓缩干燥得乙酸乙酯提取部位25.15 g;上层滤液用等体积正丁醇萃取6次，浓缩干燥得正丁醇提取部位24.85 g。
2.2 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 选择健康昆明种小鼠（18-22 g）100只，随机分为5组，每组20只，分别为模型组（超纯水）、阳性药组（布洛芬，104 mg/Kg）、仙鹤草组（仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位，40 g生药/kg），每组雌雄各半，给药1h后腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 mL/只，观察小鼠扭体反应，并记录小鼠记录小鼠15 min内出现的扭体次数，计算小鼠疼痛的抑制率，疼痛抑制率=（模型组扭体次数-给药组扭体次数）/模型组扭体次数×100%[3]。
2.3 仙鹤草不同提取物的抗炎作用
2.3.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 给药方法、分组及剂量同“2.2项”，阳性组给予氢化可的松（20 mg/Kg），各组给药后1h，分别精密吸取二甲苯10 uL均匀涂布于各组小鼠右耳上、下两面，左耳不涂作自身对照。于涂耳30 min后处死小鼠，沿小鼠耳廓基线剪下两耳，采用6 mm直径打孔器于左右耳对称部位打下耳片，用精密电子天平称取耳质量，计算耳肿胀度和耳肿胀抑制率。小鼠耳肿胀度=（右耳質量-左耳质量）/左耳质量×100%]。小鼠耳肿胀抑制率（%）=（模型组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/模型组耳肿胀度×100%[4]。 2.3.2 对磷组胺致小鼠毛细血管通透性升高的影响 给药方法、分组及剂量同“2.3.1项”，小鼠于实验前1天背部用8%硫化钠脱毛（3 cm×3 cm），次日再给药1h后在小鼠背部脱毛处中间位置皮内注射0.1%（现用现配）磷酸组胺0.06 mL/只，随后立即尾静脉注射0.5%（5 mL/kg）伊文思兰，注射伊文思兰15 min后颈椎脱臼处死小鼠，取下小鼠蓝染部位皮肤打四个孔（9 mm/孔），剪碎后浸泡于1 mL丙酮-生理盐水（7：3）溶液中，48 h后离心（3000 r/min，10min），取上清液，于波长620 nm处测定吸光度值[5-6]。
2.4 统计学处理 各给药组与模型组比较，统计数据用均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 对醋酸致小鼠扭体反应的影响 与模型组比较，布洛芬对照组、仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位能够减少小鼠扭体次数，差异有统计学意义（P<0.001、P<0.05、P<0.05），仙鹤草乙酸乙酯提取部位能够减少小鼠扭体次数，但无统计学意义（P>0.05），结果如表1。
3.2 对二甲苯致小鼠耳肿胀影响 与模型组比较，氢化可的松对照组、仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位均能抑制小鼠耳肿胀度，差异有统计学意义（P<0.001、P<0.05、P<0.05），仙鹤草乙酸酯提取部位能够抑制小鼠耳肿胀度，但差异无统计学意义，结果如表2。
3.3 对磷酸组胺致小鼠毛细血管通透性升高的影响 与模型组比较，氢化可的松对照组、仙鹤草醇提取部位、仙鹤草正丁醇提取部位、仙鹤草乙酸乙酯提取部位均能降低小鼠毛细血管通透性，差异有统计学意义（P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.05），结果如表3。
4 讨论
炎症是具有血管系统的活体组织对致炎因子所发生的防御反应[7]。根据炎症发生的快慢和持续时间可分为以毛细血管通透性升高为特征的急性炎症阶段，以白细胞浸润和巨噬细胞的吞噬为特征的亚急性阶段，及以组织变性和纤维化为特征的慢性炎症阶段[8-10]。目前，临床使用抗炎药有非甾体类、甾体类抗炎药。非甾体类药物长时间服用易引起胃肠道、肝、肾损伤甚至消化道出血等不良反应。甾体类抗炎药以激素為主，长期使用易引发医源性身上皮质功能亢进、加重感染及胃溃疡，甚至引发无菌性骨坏死等不良反应[11-12]。因此，寻找新型抗炎药物具有重要的现实意义。能引起炎症反应的致炎因子种类较多，包括物理性因子、化学性因子和生物性因子等，醋酸作为一种化学性致炎因子，在注射小鼠腹腔内会引起小鼠产生持久、深部的疼痛，小鼠会出现扭体现象，主要用于外周镇痛药的筛选[13-14];组胺主要存在于皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞中，当组织受到损伤及在炎症反应急性期，组胺与血管内皮细胞受体结合后，致使内皮细胞迅速收缩，内皮细胞之间的连接缝隙变大，血管通透性升高[15];二甲苯是可以使炎症介质溶解释放，使毛细血管通透性升高，炎性细胞浸润，造成耳部急性渗出性炎症水肿[16]。因此，本研究对仙鹤草采用极性分离方法得到仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位、乙酸乙酯提取部位，采用醋酸扭体法、二甲苯致小鼠耳肿胀法，磷酸组胺致小鼠毛细血管通透性增加实验，在等生粉剂量下进行仙鹤草抗炎活性筛选。研究结果显示，仙鹤草醇提取部位、正丁醇提取部位能减少小鼠扭体次数、抑制小鼠耳廓肿胀度，能降低小鼠毛细血管通透性增加，提示仙鹤草醇提取物、正丁醇提物可以通过抗急性炎症达到镇痛的作用，其活性成分主要集中在仙鹤草正丁醇提取物，但对其作用机制及主要抗炎活性成分有待于下一步深入研究。
参考文献：
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[4]陈博欣，汤雪纯，刘燕玲，等.六经辨证法浅谈半夏厚朴汤抗炎镇痛作用[J/OL].中医临床研究：1-2[2019-06-09].httP：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.5895.R.20190506.1706.004.html.
[5]史宁，郭宏举，王欢，等.金丝桃苷对急性炎症疼痛模型小鼠的抗炎镇痛作用研究[J].药物评价研究，2016，39（5）：771-774.
[6]段小花，杨莲，李钦，等.皮内与皮下注射磷酸组胺对皮肤毛细血管通透性实验结果的影响[J].云南中医学院学报，2008，31（4）：35-37.
[7]Ma Y，Luo Y，Song L，et al.[Pharmaceutical screening of the effective fraction from Smilax for treatment of chronic Pelvic inflammatory disease][J].Journal of Southern Medical University，2013，33（1）：145-149.
[8]胡超群，王湘妍，段梦迪，等.抗感败毒口服液解热镇痛抗炎试验[J].中国兽医杂志，2017（1）：108-110.
[9]Rocha F，Dias J，Geurden I，et al.Dietary glucose stimulus at larval stage modifies the carbohydrate metabolic Pathway in gilthead seabream（SParus aurata）juveniles：An in vivo aPProach using（14）C-starch[J].ComParative Biochemistry & Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology，2016，201：189-199.
[10]付雯雯，江一川，张虹，等.乌头注射液对不同阶段炎症动物模型的抗炎作用[J].吉林大学学报（医学版），2015，41（3）：568-572.
[11]朱依谆，殷明.药理学[M].北京：人民卫生出版社，2016.
[12]冯建峰，赵青山.非甾体类抗炎药相关性消化性溃疡出血的临床分析[J].实用医学杂志，2018，34（9）：118-120.
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[14]高华.药理学实验方法[M].北京：中国医药科技出版社，2012.
[15]许莉莉，杨向东，葛均波.组胺与固有免疫调控及其在心血管疾病中的作用[J].中国动脉硬化杂志，2017，25（1）：83-89.
[16]李义奎，王钦茂.中药药理实验方法学[J].上海：科学技术出版社，2006：302-307.
（收稿日期：2019-09-29）