【摘 要】
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位于酶分子活性位点(又称活性中心)附近的环结构对酶促反应特性具有重要影响.本实验室先前在宇佐美曲霉Aspergillus usamii中发现了一种新的5家族β-甘露聚糖酶Au Man5A.通过
【机 构】
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江南大学食品学院,江南大学生物工程学院,江南大学无锡医学院,
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位于酶分子活性位点(又称活性中心)附近的环结构对酶促反应特性具有重要影响.本实验室先前在宇佐美曲霉Aspergillus usamii中发现了一种新的5家族β-甘露聚糖酶Au Man5A.通过同源建模、分子对接及多序列比对,发现位于Au Man5A底物结合凹槽侧壁的一段环结构可能对酶的功能有影响.为证明该假说,本研究采用Au Man5A为母本,利用PCR技术将其底物结合槽内的7肽环结构316KSPDGGN322替换成与两种木霉属β-甘露聚糖酶对应的8肽片段AQSNSDPY,构建了杂合酶基因Auman5ALoop,并在毕赤酵母GS115中进行表达,经纯化获得了杂合β-甘露聚糖酶Au Man5ALoop.酶学特性分析结果显示,与原酶Au Man5A比较,Au Man5ALoop的最适反应p H由3.5~4.0扩宽至3.5~5.5;最适反应温度由65℃提高至70℃;以角豆胶为底物,测得Au Man5ALoop的比活性由351.2 U/mg提高至2 089.2 U/mg.利用双倒数作图法测得动力学常数揭示,Au Man5ALoop的Km值较Au Man5A降低了36%,而kcat值是Au Man5A的6.8倍;同时,Au Man5ALoop的催化效率(kcat/Km)提高了10.7倍.我们的结果说明,通过替换Au Man5A底物结合槽内环结构,可明显改进其酶学特性.我们的结果还提示,活性位点附近的环结构对β-甘露聚糖酶的酶学特性具有重要影响.
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