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目的
了解问号钩端螺旋体LA_2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)和磷脂酶A2(PLA2)的酶活性。
方法生物信息学软件预测问号钩端螺旋体赖株LA_2144基因跨膜区、信号肽和结构域。构建无信号肽LA_2144基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rLep2144后复性。采用分光光度法检测rLep2144水解PAF-AH底物2-thio PAF的活性及其Km和Kcat值以及水解PLA2底物花生四烯酸硫代卵磷脂的活性。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot法检测问号钩端螺旋体感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)后LA_2144基因转录、蛋白质表达和外分泌情况。
结果LA_2144基因无跨膜区但有信号肽和SGNH水解酶超家族结构域。所构建的无信号肽LA_2144基因原核表达系统能高效表达rLep2144，提纯后的rLep2144在分离胶上为单一蛋白质条带并成功复性。rLep2144有较强PAF-AH活性，其Km和Kcat值分别为688.235 μmol/L和0.976/s，但PLA2活性较弱。问号钩端螺旋体感染HUVEC和EOMA后LA_2144基因mRNA转录和蛋白质表达水平迅速升高(P<0.05)且外分泌。
结论问号钩端螺旋体LA_2144基因产物具有较强PAF-AH活性和一定的PLA2活性，可在钩端螺旋体病出血性病变和炎症反应中发挥作用。