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摘要 主要综述了近年来玉米单倍体加倍方法的最新研究进展。自然加倍法和以秋水仙素及除草剂为加倍剂的化学加倍法是人们研究较多的加倍方法。
关键词 玉米单倍体；加倍方法；秋水仙素；除草剂
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08542-02
Abstract The recent progress of doubling methods in maize haploid are reviewed. The main methods which included natural doubling and the chemical methods used colchicine， as well as other herbicides are more researched.
Key words Maize haploid； Doubling method； Colchicine； Herbicides
目前，利用孤雌生殖诱导系诱导是获得玉米单倍体的重要方法，国内已有多家育种单位开始应用该技术。采用单倍体育种技术选育自交系可使材料的纯化从常规育种的5～7年缩短到1～2年，大大提高了育种效率。国外许多公司已实现单倍体育种的规模化应用，但在国内单倍体育种还处于初步阶段，尤其是诱导获得的单倍体种子存在加倍率低等问题，限制了国内玉米单倍体育种的规模化开展。为了寻找单倍体高加倍率、操作方便、成本低的加倍方法，许多科研人员进行了深入的研究。目前研究较多的加倍方法主要有自然加倍法和和以秋水仙素及除草剂为加倍剂的化学加倍法。为便于这些方法更好地应用于玉米单倍体加倍，笔者对近年来有关玉米单倍体加倍的方法进行了综述，以期为玉米单倍体育种工作者提供参考。
1 自然加倍法
关于单倍体的雌雄育性的自然恢复，刘志增等通过研究发现，平均有93.2%的单倍体雌穗是自然可育的， 雄穗的自然育性较低，散粉株率为5%～40%不等[1]，但由于单倍体存在雌雄严重失调，还有一定的空秆存在，导致单倍体的自然加倍结实率只有10%左右。不同的生态环境和基础材料，单倍体自然加倍结实率的差异较大。气候凉爽、昼夜温差大的环境有利于单倍体植株的自然加倍；逆境生态条件（极端高温、干旱、低温寡照、瘠薄等）不利于单倍体的自然加倍[1]，因此自然加倍除了与材料特性有关之外，还与单倍体的种植季节、种植地点等生态环境有很大关系。
1.1 种植季节
关于单倍体自然加倍的最佳种植季节，研究结论不太一致，多数研究认为在北方春播和三亚冬播有利于单倍体自然加倍。如段民孝等研究发现，在北京地区播种的19个材料的单倍体结实率春播时期明显高于夏播时期，16个材料的显花药率表现为春播时期高于夏播时期，春播和夏播玉米单倍体平均显花药率分别为26.9%和19.7%，平均结实株率分别为3.5%和2.1%，认为春播时期更有利于玉米单倍体的自然加倍[2]。刘志增等研究北京春播、北京晚春播、北京夏播、三亚播种对玉米单倍体加倍效果，结果表明，海南和北京夏播种植玉米单倍体的加倍率较差，并推论单倍体雄穗育性的自然恢复与生长前期环境温度（或昼夜温差）的变化具有负（或正）相关的趋势[1]。许洛等分别在石家庄春播、石家庄夏播和三亚冬播3 种生态环境条件下开展了玉米单倍体自然加倍效果的研究，认为不同基因型材料间、不同环境条件下，玉米单倍体自然加倍效果差异明显，其中三亚冬播效果最好，石家庄春播次之，石家庄夏播不适合单倍体自然加倍[3]。刘德友等通过在山东胶东半岛的试验认为夏播有利于单倍体自然散粉及自交结实。他们发现，夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交结实率为6.23%～9.39%，单倍体自交结实率夏播比春播高2.37%[4]。芦连勇等通过在河南安阳进行的试验也认为夏播更有利于玉米单倍体的自然加倍。研究发现，不同材料来源的玉米单倍体夏播和春播的显花散粉率平均分别为34.24%、29.37%，夏播比春播高4.87个百分点； 自交结实率夏播明显高于春播[5]。不过，笔者通过在河南新乡进行的单倍体自然加倍试验，发现春播比夏播有利于单倍体的自然加倍。春播单倍体生长前期温度低，温差较大，应该更有利于单倍体的自然加倍。
1.2 种植地点
在不同的种植地点，春播和夏播对单倍体的加倍影响不尽相同，这就表明不同地点种植玉米单倍体自然加倍的影响存在明显差异。如段民孝等认为，相比北京春季播种，甘肃春季播种和海南冬季播种比其他地点种植更有利于玉米单倍体自然加倍[6]。蔡泉等认为，相同来源的单倍体在海南、黑龙江省的自然加倍率差异显著，不同来源的玉米单倍体在海南的自然加倍率均高于黑龙江省[7]。
2 化学加倍方法
2.1 秋水仙素加倍法
秋水仙素是一种应用最广泛的化学加倍试剂， 原理是通过阻止细胞有丝分裂中期纺锤丝微管的收缩而使复制了的染色体不能移向细胞的两极而实现染色体的加倍。它对植物的刺激作用只发生在细胞分裂时期，因此通常用来处理的为萌动或刚发芽的种子、正在膨大的芽及根尖或幼苗、嫩枝的生长点。秋水仙素的适宜浓度和处理时间的长短随着所处理的器官和处理时的温度有很大关系[8]。
选用秋水仙素处理单倍体方法有浸根法、浸芽法和注射法等，不同方法采用的药剂浓度不同。采用浸芽法处理，操作方法简单易行，而且具有较高的加倍效率。而当用秋水仙素处理玉米芽时，通常采用的浓度为0.05%～0.06%。如岳尧海等认为，秋水仙素浓度、浸芽温度和浸芽时间对玉米单倍体加倍有明显的影响，且差异达极显著水平；用0.05%秋水仙素和5%二甲基甲砜混合药剂在15 ℃下浸泡9 h，单倍体的加倍效果最好，加倍率可达38.1%[9]。蔡泉等用浸芽法处理单倍体，发现浓度在0.06%时平均存活率达到了71.7%，平均加倍率为21.9%[10]。段民孝等使用0.06%秋水仙素溶液分别浸泡幼芽上部和幼芽全部，发现浸泡幼芽上部处理能够明显减轻药害，缩短缓苗时间，提高单倍体植株的加倍效果，成活率、授粉率和结实株率均是浸泡幼芽全部处理的1.5 倍左右，而且浸泡幼芽上部处理的授粉率和结实率分别是对照的2.0和4.0倍以上[11]。 注射法则一般选择在6叶期注射浓度0.5%的秋水仙素加倍效果最好。如魏俊杰等在单倍体玉米6叶期， 分别用浓度为0.1%、0.5%、1.0%秋水仙素+2.0%二甲基亚砜（DMSO）混合液2.0 μl注射处理单倍体幼苗茎尖生长点，认为在6 叶期用注射处理法对玉米单倍体的加倍非常有效，受药害株数较少，受药害株率低，且0.5%秋水仙素浓度处理效果最好[12]。岳尧海等用高诱1号诱导的单倍体植株为材料，在5～6叶期用两种浓度的秋水仙素配以二甲基亚砜（DMSO）注射处理茎尖生长点，不同基因型材料间有显著差异，且浓度0.5%秋水仙素的处理效果最好[13]。
2.2 除草剂加倍法
由于秋水仙素毒性很大，处理单倍体的浓度和时间掌握不当，易导致单倍体成活率低。近几年来，人们逐渐转向利用除草剂进行单倍体加倍的研究，以便可以用除草剂取代秋水仙素用于玉米单倍体加倍。如惠国强等以先玉335、中农大4号和8607×8609共3个基因型诱导的单倍体子粒为材料，比较了甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵3种除草剂加倍玉米单倍体的效率。通过滴心法处理单倍体植株3叶期和5叶期幼苗，发现20～160 pmol/L的3种除草剂对玉米单倍体加倍均有效果，加倍率在3.42%～26.32%；甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵的加倍率分别为4.29%～26.32%、3.85%～20.81%和3.42%～17.61%，其中80 pmol/L甲基胺草磷的加倍效果最佳[14]。张良君等以高诱l号诱导的不同基因型玉米单倍体为材料，在3～5叶期用不同浓度的甲基胺草磷溶液进行滴心处理，研究甲基胺草磷加倍单倍体的效果，结果表明，100 μmol/L甲基胺草磷溶液处理的单倍体加倍效率最高[15]。慈佳宾等用氟乐灵、拿草特两种抗微管除草剂和秋水仙素在不同处理部位、不同处理时间和浓度条件下对玉米单倍体进行单倍体加倍效率研究，结果表明，3 种药剂用浸种法处理玉米单倍体的加倍率以氟乐灵在浓度80 μmol/L处理20 h 最高（35.7%），用浸芽法处理的加倍率以拿草特在浓度60 μmol/L 处理24 h 最高（24.8%），用浸根法处理的加倍率以氟乐灵在浓度40 μmol/L处理15 h最高（16.8%）[16]。王贺等以Mo17×PHB1M诱导的单倍体子粒为试验材料，利用戊炔草胺、甲基胺草磷和秋水仙素为加倍药剂，浸芽处理单倍体种子，结果表明，3种药剂对玉米单倍体加倍均有效果，其中，8 mg/L戊炔草胺、21 mg/L甲基胺草磷、0.7 mg/L秋水仙素浸芽8 h的玉米单倍体加倍率均为各组最高，并认为戊炔草胺和甲基胺草磷可以替代秋水仙素加倍玉米单倍体[17]。
3 小结
单倍体加倍是玉米单倍体育种的制约因素。自然加倍法加倍无毒、无害、无污染、操作简单，缺点是加倍率较低，一般加倍率高的材料可达10%左右。基于科研人员关于种植季节和种植地点对单倍体加倍的影响研究，笔者认为单倍体自然加倍可以选择甘肃春播、海南冬播或者北方地区春播等进行。对于有些自然条件下不容易加倍或者加倍率极低的单倍体材料，可以选择化学加倍方法进行加倍。 利用除草剂等化学加倍方法进行单倍体加倍加倍率最高可达35.7%。除草剂相对于秋水仙素而言，毒性较低，对材料的毒害较小，因此，甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵等除草剂应该是玉米单倍体加倍较理想的选择。选用化学方法加倍，浸芽法操作方便，更利于玉米单倍体加倍的规模化。
参考文献
[1] 刘志增，宋同明.玉米单倍体雌雄育性的自然恢复以及染色体的化学加倍[J].作物学报，2000，26（6）：947-952.
[2] 段民孝，赵久然，刘新香，等.春夏不同播期对玉米单倍体自然加倍率的影响[J].玉米科学，2011，19（5）：39-42.
[3] 许洛，王绍新，冯健英，等.不同生态环境的玉米单倍体自然加倍效果研究[J].河北农业科学，2013，17（3）：63-65.
[4] 刘德友，赵延明.不同基因型不同播期玉米单倍体自然加倍效果的研究[J].中国农学通报，2010，26（19）：37-39.
[5] 芦连勇，王海莉，董文恒，等.玉米单倍体在春夏不同播期条件下的自然加倍效果研究[J].安徽农业科学，2012，40（18）： 9613-9614，9625.
[6] 段民孝， 赵久然， 刘新香，等.不同种植地点对玉米单倍体自然加倍率的影响[J].作物杂志，2012（2）：68-70.
[7] 蔡泉，曹靖生，史桂荣，等.玉米单倍体在黑龙江与海南自然加倍效果的对比研究[J].玉米科学，2012，20（5）：7-9.
[8] 陈绍江，黎亮，李浩川.玉米单倍体育种技术[M].北京：中国农大出版社， 2009：52-53.
[9] 岳尧海，张志军，路明，等.东北生态区玉米单倍体浸芽加倍效果的初探[J]. 作物杂志，2012（5）：114-117.
[10] 蔡泉，张建国，赵伟， 等.Stock6杂交诱导的玉米单倍体加倍效果研究[J].黑龙江农业科学，2011（11）：1-4 .
[11] 段民孝，刘新香，赵久然，等.秋水仙素浸芽法处理玉米单倍体的加倍效果研究[J].种子，2013（2）：19-23.
[12] 魏俊杰，张晓丽，陈梅香，等.六叶期秋水仙素注射处理玉米单倍体的加倍效果研究[J]. 玉米科学，2007， 15（4）： 49-51.
[13] 岳尧海，王敏，张志军，等.玉米单倍体加倍效果的研究[J].吉林农业科学，2011，36（5）：9-12.
[14] 惠国强，严建兵，杜何为，等.不同除草剂加倍玉米单倍体的效率[J].作物学报， 2012，38（3）：416-422.
[15] 张良君，赵延明，张海艳，等.甲基胺草磷加倍玉米单倍体效果的初步研究[J]. 山东农业科学，2013，45（10）：29-31.
[16] 慈佳宾，李继竹，刘振库，等.抗微管除草剂对玉米单倍体加倍效果研究[J].玉米科学，2012，20（5）：10-14.
[17] 王贺，李继竹，张继伟，等.秋水仙素和除草剂浸芽加倍玉米单倍体效率的研究[J].吉林农业大学学报，2013， 35（4）：384-388.
关键词 玉米单倍体；加倍方法；秋水仙素；除草剂
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08542-02
Abstract The recent progress of doubling methods in maize haploid are reviewed. The main methods which included natural doubling and the chemical methods used colchicine， as well as other herbicides are more researched.
Key words Maize haploid； Doubling method； Colchicine； Herbicides
目前，利用孤雌生殖诱导系诱导是获得玉米单倍体的重要方法，国内已有多家育种单位开始应用该技术。采用单倍体育种技术选育自交系可使材料的纯化从常规育种的5～7年缩短到1～2年，大大提高了育种效率。国外许多公司已实现单倍体育种的规模化应用，但在国内单倍体育种还处于初步阶段，尤其是诱导获得的单倍体种子存在加倍率低等问题，限制了国内玉米单倍体育种的规模化开展。为了寻找单倍体高加倍率、操作方便、成本低的加倍方法，许多科研人员进行了深入的研究。目前研究较多的加倍方法主要有自然加倍法和和以秋水仙素及除草剂为加倍剂的化学加倍法。为便于这些方法更好地应用于玉米单倍体加倍，笔者对近年来有关玉米单倍体加倍的方法进行了综述，以期为玉米单倍体育种工作者提供参考。
1 自然加倍法
关于单倍体的雌雄育性的自然恢复，刘志增等通过研究发现，平均有93.2%的单倍体雌穗是自然可育的， 雄穗的自然育性较低，散粉株率为5%～40%不等[1]，但由于单倍体存在雌雄严重失调，还有一定的空秆存在，导致单倍体的自然加倍结实率只有10%左右。不同的生态环境和基础材料，单倍体自然加倍结实率的差异较大。气候凉爽、昼夜温差大的环境有利于单倍体植株的自然加倍；逆境生态条件（极端高温、干旱、低温寡照、瘠薄等）不利于单倍体的自然加倍[1]，因此自然加倍除了与材料特性有关之外，还与单倍体的种植季节、种植地点等生态环境有很大关系。
1.1 种植季节
关于单倍体自然加倍的最佳种植季节，研究结论不太一致，多数研究认为在北方春播和三亚冬播有利于单倍体自然加倍。如段民孝等研究发现，在北京地区播种的19个材料的单倍体结实率春播时期明显高于夏播时期，16个材料的显花药率表现为春播时期高于夏播时期，春播和夏播玉米单倍体平均显花药率分别为26.9%和19.7%，平均结实株率分别为3.5%和2.1%，认为春播时期更有利于玉米单倍体的自然加倍[2]。刘志增等研究北京春播、北京晚春播、北京夏播、三亚播种对玉米单倍体加倍效果，结果表明，海南和北京夏播种植玉米单倍体的加倍率较差，并推论单倍体雄穗育性的自然恢复与生长前期环境温度（或昼夜温差）的变化具有负（或正）相关的趋势[1]。许洛等分别在石家庄春播、石家庄夏播和三亚冬播3 种生态环境条件下开展了玉米单倍体自然加倍效果的研究，认为不同基因型材料间、不同环境条件下，玉米单倍体自然加倍效果差异明显，其中三亚冬播效果最好，石家庄春播次之，石家庄夏播不适合单倍体自然加倍[3]。刘德友等通过在山东胶东半岛的试验认为夏播有利于单倍体自然散粉及自交结实。他们发现，夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交结实率为6.23%～9.39%，单倍体自交结实率夏播比春播高2.37%[4]。芦连勇等通过在河南安阳进行的试验也认为夏播更有利于玉米单倍体的自然加倍。研究发现，不同材料来源的玉米单倍体夏播和春播的显花散粉率平均分别为34.24%、29.37%，夏播比春播高4.87个百分点； 自交结实率夏播明显高于春播[5]。不过，笔者通过在河南新乡进行的单倍体自然加倍试验，发现春播比夏播有利于单倍体的自然加倍。春播单倍体生长前期温度低，温差较大，应该更有利于单倍体的自然加倍。
1.2 种植地点
在不同的种植地点，春播和夏播对单倍体的加倍影响不尽相同，这就表明不同地点种植玉米单倍体自然加倍的影响存在明显差异。如段民孝等认为，相比北京春季播种，甘肃春季播种和海南冬季播种比其他地点种植更有利于玉米单倍体自然加倍[6]。蔡泉等认为，相同来源的单倍体在海南、黑龙江省的自然加倍率差异显著，不同来源的玉米单倍体在海南的自然加倍率均高于黑龙江省[7]。
2 化学加倍方法
2.1 秋水仙素加倍法
秋水仙素是一种应用最广泛的化学加倍试剂， 原理是通过阻止细胞有丝分裂中期纺锤丝微管的收缩而使复制了的染色体不能移向细胞的两极而实现染色体的加倍。它对植物的刺激作用只发生在细胞分裂时期，因此通常用来处理的为萌动或刚发芽的种子、正在膨大的芽及根尖或幼苗、嫩枝的生长点。秋水仙素的适宜浓度和处理时间的长短随着所处理的器官和处理时的温度有很大关系[8]。
选用秋水仙素处理单倍体方法有浸根法、浸芽法和注射法等，不同方法采用的药剂浓度不同。采用浸芽法处理，操作方法简单易行，而且具有较高的加倍效率。而当用秋水仙素处理玉米芽时，通常采用的浓度为0.05%～0.06%。如岳尧海等认为，秋水仙素浓度、浸芽温度和浸芽时间对玉米单倍体加倍有明显的影响，且差异达极显著水平；用0.05%秋水仙素和5%二甲基甲砜混合药剂在15 ℃下浸泡9 h，单倍体的加倍效果最好，加倍率可达38.1%[9]。蔡泉等用浸芽法处理单倍体，发现浓度在0.06%时平均存活率达到了71.7%，平均加倍率为21.9%[10]。段民孝等使用0.06%秋水仙素溶液分别浸泡幼芽上部和幼芽全部，发现浸泡幼芽上部处理能够明显减轻药害，缩短缓苗时间，提高单倍体植株的加倍效果，成活率、授粉率和结实株率均是浸泡幼芽全部处理的1.5 倍左右，而且浸泡幼芽上部处理的授粉率和结实率分别是对照的2.0和4.0倍以上[11]。 注射法则一般选择在6叶期注射浓度0.5%的秋水仙素加倍效果最好。如魏俊杰等在单倍体玉米6叶期， 分别用浓度为0.1%、0.5%、1.0%秋水仙素+2.0%二甲基亚砜（DMSO）混合液2.0 μl注射处理单倍体幼苗茎尖生长点，认为在6 叶期用注射处理法对玉米单倍体的加倍非常有效，受药害株数较少，受药害株率低，且0.5%秋水仙素浓度处理效果最好[12]。岳尧海等用高诱1号诱导的单倍体植株为材料，在5～6叶期用两种浓度的秋水仙素配以二甲基亚砜（DMSO）注射处理茎尖生长点，不同基因型材料间有显著差异，且浓度0.5%秋水仙素的处理效果最好[13]。
2.2 除草剂加倍法
由于秋水仙素毒性很大，处理单倍体的浓度和时间掌握不当，易导致单倍体成活率低。近几年来，人们逐渐转向利用除草剂进行单倍体加倍的研究，以便可以用除草剂取代秋水仙素用于玉米单倍体加倍。如惠国强等以先玉335、中农大4号和8607×8609共3个基因型诱导的单倍体子粒为材料，比较了甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵3种除草剂加倍玉米单倍体的效率。通过滴心法处理单倍体植株3叶期和5叶期幼苗，发现20～160 pmol/L的3种除草剂对玉米单倍体加倍均有效果，加倍率在3.42%～26.32%；甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵的加倍率分别为4.29%～26.32%、3.85%～20.81%和3.42%～17.61%，其中80 pmol/L甲基胺草磷的加倍效果最佳[14]。张良君等以高诱l号诱导的不同基因型玉米单倍体为材料，在3～5叶期用不同浓度的甲基胺草磷溶液进行滴心处理，研究甲基胺草磷加倍单倍体的效果，结果表明，100 μmol/L甲基胺草磷溶液处理的单倍体加倍效率最高[15]。慈佳宾等用氟乐灵、拿草特两种抗微管除草剂和秋水仙素在不同处理部位、不同处理时间和浓度条件下对玉米单倍体进行单倍体加倍效率研究，结果表明，3 种药剂用浸种法处理玉米单倍体的加倍率以氟乐灵在浓度80 μmol/L处理20 h 最高（35.7%），用浸芽法处理的加倍率以拿草特在浓度60 μmol/L 处理24 h 最高（24.8%），用浸根法处理的加倍率以氟乐灵在浓度40 μmol/L处理15 h最高（16.8%）[16]。王贺等以Mo17×PHB1M诱导的单倍体子粒为试验材料，利用戊炔草胺、甲基胺草磷和秋水仙素为加倍药剂，浸芽处理单倍体种子，结果表明，3种药剂对玉米单倍体加倍均有效果，其中，8 mg/L戊炔草胺、21 mg/L甲基胺草磷、0.7 mg/L秋水仙素浸芽8 h的玉米单倍体加倍率均为各组最高，并认为戊炔草胺和甲基胺草磷可以替代秋水仙素加倍玉米单倍体[17]。
3 小结
单倍体加倍是玉米单倍体育种的制约因素。自然加倍法加倍无毒、无害、无污染、操作简单，缺点是加倍率较低，一般加倍率高的材料可达10%左右。基于科研人员关于种植季节和种植地点对单倍体加倍的影响研究，笔者认为单倍体自然加倍可以选择甘肃春播、海南冬播或者北方地区春播等进行。对于有些自然条件下不容易加倍或者加倍率极低的单倍体材料，可以选择化学加倍方法进行加倍。 利用除草剂等化学加倍方法进行单倍体加倍加倍率最高可达35.7%。除草剂相对于秋水仙素而言，毒性较低，对材料的毒害较小，因此，甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵等除草剂应该是玉米单倍体加倍较理想的选择。选用化学方法加倍，浸芽法操作方便，更利于玉米单倍体加倍的规模化。
参考文献
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