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［摘 要］ 目的 研究海人藻酸致痫大鼠心肌细胞ERK表达情况。方法 采用立体定位仪下杏仁核内注射海人藻酸方法制备癫痫动物模型，在大 鼠癫痫发作后不同时程，快速制备心脏组织标本，进行免疫组化及染色，用Image_Pro Plus 图像分析软件，计算大鼠心肌细胞ERK表达灰度值的均数和标准差，观察不同时程心肌细胞E RK表达情况。结果 致癫痫组大鼠心肌细胞ERK表达于癫痫发作后1/2小时 开始增加，灰度值为4735.86±172.43，2小时心肌组织ERK的表达达到高峰，灰度值为127 64.71±178.45，与对照组相比P值均＜0.05，随后逐渐下降；至癫痫发作6小时，心 肌组织ERK表达基本消失，灰度值为2389.78±185.64，与对照组相比P＞0.05。结论 ERK在癫痫所引起的脑心综合征中有表达。
［关键词］ 癫痫；心肌细胞；细胞外信号调节激酶
中图分类号：R54
文献标识码： A
文章编号：1009_816X(2008)01_0015_03
引起脑心综合征的原因很多，颞叶癫痫是最常见之一，但国内关于颅内疾患所致的脑心综合 征的报导，少有由癫痫引起脑心综合征 的临床报道。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)作为胞内信号转导系统，在海人藻酸(KA)致痫模型 中以及在心血管系统中均有重 要意义，然而MAPK在癫痫引发脑心综合征中是如何发挥作用，尚无公认的定论。有研究报道 ，在KA侧脑室内注射致痫模型中，痫性发作1/2h后ERK(细胞外信号调节激酶)、JNK、p38均 升高，ERK持续升高约3h，而JNK和p38在2h后即恢复正常［1］，本文对ERK在癫痫所 引起的脑心综合征中的表达进行探讨。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂：动物大脑立体定位仪（BUNKYO_KV113TOKYO）_日本；LMS_2B型二道 生理记录仪_成都。MAPK1/2（抗体）及KA购自美国sigma公司。
1.2 动物分组：实验动物选用健康雄性Wistar大鼠42只，体重约250克，均购自吉林大学 新民校区实验动物部，其中正常对照组大鼠7只，致痫组大鼠35只，按海人藻酸致痫后癫 痫发作即刻、1/2小时、2小时、4小时及6小时分为5组，每组各7只。
1.3 模型建立：将KA溶解在PBS中性缓冲液中，配制成浓度为1毫克/ 毫升的液体。用10%水合氯醛0.33ml/kg体重腹腔麻醉大鼠。将大鼠两外耳道固定于立体定 位仪上，并将水平线调零。取头颅正中菱形切口，暴 露颅骨及前囟、后囟，将立体定位仪正中线调零。右侧杏仁核基底外侧核的坐标位置为前囟 后2.5mm，旁开5.0mm，颅骨表面下8.0mm。用小牙钻钻透顶骨至硬脑膜处，一部分动物在 KA注射前，预先在左侧海马CA3区包埋双极电极。按照上述右侧杏仁核坐标，注入海仁藻酸1 ul，空白组为生理盐水1ul，注药后留针约5min左右，缓慢退出。然后，缝合切口，将大鼠 放在敞口有机玻璃罩中，按Racine分级法，将大鼠行为分为以下5级：0级_正常行为状态；I 级：湿狗样颤动，面部痉挛抽动，包括眨眼、动须、节律性咀嚼等；Ⅱ级：I级加节律性点 头；Ⅲ级：Ⅱ级加前肢痉挛；Ⅳ级：站立并伴双侧前肢痉挛；Ⅴ级：持续站立、倾倒、失平 衡、四肢抽动。达到以下两个条件为模型成功。①按Racine标准分级，大鼠致痫后出现Ⅲ级 以上发作；②鼠海马深部电极脑电图出现正常波上棘波和尖波放电。
1.4 免疫组化及染色：分别于大鼠癫痫发作后即刻、1/2h、2h、4h及6h后，以10%水合氯 醛麻醉大鼠，快速取心脏标本，置于10%中性缓冲福尔马林固定液中1.5小时后，弃去固定 液，准备酒精脱水、石蜡包埋及免疫组化及染色。切片经HE染色后拍照，在显微 镜下放大20倍后再拍照，每张切片选取10个视野，选定其中某一细胞作为标准，用Image_ Pro Plus图象分析软件测定心肌组织ERK表达的灰度值。
1.5 统计学处理：所有实验数据用x－±s表示。统计学分析，各组间比较采 用方差分析，成组数据的比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 海人藻酸致痫大鼠的海马深部电极脑电改变
正常大鼠脑电波形，频率以5～10赫兹为主，波幅小于700Mv，见图1。KA注射后各组大鼠脑 电 波均出现多种形式的癫痫性放电。典型波形有单棘波、多相棘波、双相棘波、棘慢波、尖波 发作性节律波、发作后抑制等，见图2。
2.2 致癫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表达的病理学改变，见图3～7。
2.3 致痫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表达的灰度值测定：见表1。
3 讨论
心脏和中枢神经系统相互关联，正常情况下脑通过自主神经系统调节心脏活动而维持一种稳 态，当神经系统发生病变时会打破这种稳态。
MAPK是一个重要的细胞内信号传导酶家族。其成员ERK与细胞生长、增殖、分化及凋亡， 甚至保护作用有关。心肌细胞凋亡是心肌细胞的一种程序性细胞死亡，它在心脏的正常发育过程中及心力衰 竭、原发性高血压、心律失常等许多心血管疾病的病理生理中起着重要作用［2］。E RK分子所涉及的通路可能通过影响苔藓纤维重组、突触重塑等机制参与癫痫的发病，与心肌 细胞的肥厚和凋亡等病理过程也密切相关。已有研究显 示，MEK_ERK通路可能对细胞凋亡的过程起到保护作用。PKC作为细胞信号传导系统中一个重 要成分，广泛存在于心肌细胞胞浆中，依赖Ca2+激活，参与细胞信息的传递、细胞的 增殖、突触的可塑性和基因的表达［3］。另有研究发现，Raf_1_ERK级联反应的上游 调控机制因细胞类型和刺激物的不同而有高度差异性，AngⅡ具有使心肌细胞凋亡的作用， 且AngⅡ激活心肌细胞ERK通过PKC,而不依赖Ras［4］。本实验通过杏仁核内注射KA致痫后的不同时程癫痫大鼠心肌细胞的病理学改变及 ERK蛋白表达的变化情况进行研究，结果显示正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，致密，结 构清晰，细胞核呈卵圆形，心肌纤维染色呈淡蓝色，无ERK蛋白表达。KA致痫后1/2小 时，心肌细胞ERK的磷酸化水平开始增高，于癫痫发作2小时后达高峰，与手术对照组相比， 具有显著性差异(P＜0.05)。之后逐渐下降，至6小时左右ERK表达基本消失。分析上述 结果的主要原因可能在于：癫痫等神经系统疾病急性发作时，可使机体处于应激状态，促发 肾素_血管紧张素醛固酮系统，使循环与局部组织的AngⅡ增高。AngⅡ与细胞膜上的AT1受体 结合，产生二酰基甘油和三磷酸肌醇(IP3)，IP3与内质网上IP3受体结合，使内质网释放钙 增加，二酰基甘油激活蛋白激酶C，引起细胞内Na＋-H＋交换，促进细胞内外Ca2＋ -Na＋交换，进入细胞内的Ca2＋增多，使细胞内钙超载［5］，进而激活P KC信号传导途径。癫痫发作2小时ERK表达达高峰，在此时间段An gⅡ可引起心肌细胞ERK激活发挥短暂的抗凋亡作用，随后逐渐降低，约6小时后，心肌细胞E RK表达基本正常，抗凋亡作用基本消失，继发引起其它致心肌细胞凋亡因素的作用增强，最 终引起心肌细胞凋亡。但离体实验证明血管紧张素引起调亡的机制为激活P38激酶与P53蛋白 从而引起Bcl_2Bax蛋白比值降低，启动caspase_3，引起钙依赖的DnaseⅠ启动而导致凋亡［6］。总之，ERK在癫痫所引起脑心综合征中有表达，起到短暂的抗凋亡作用，随着时 间的推移，AngⅡ最终引起ERK表达减弱，致使其它促凋亡因素的作用增强而引起心肌细胞凋 亡，这又与以往AngⅡ具有使心肌细胞凋亡的作用等研究结论相一致。
参考文献
［1］刘智良，徐如祥，姚志彬，等.红藻氨酸致痫后大鼠海马ERK、P38MAPK和JNK 的活性变化［J］.中华神经医学杂志，2006，5(2)：137-144.
［2］李天富,吕传真,夏作理,等.杏仁核注射红藻氨酸诱导的边缘叶发作癫痫大鼠海马Ba d去磷酸化和Bcl_2表达上调［Ｊ］.生理学报,2004,57(3):310-318.
［3］Chien KR, Grace AA, Hunter JJ. Molecular biology of cardiac hypertrophy and
heart failure. In: Chien KR, ed.Molecular Basis of Cardiovascular Disease［M］.
Philadelphia, Pa: WB Saunders Co, 1998:211-250.
［4］House B, Sopart A, Isenberg G. Cyclical mechanical stretch_induced apoptosi s in myocytes from young rats but necrosis in myocytes from old rats［J］. Am J
Phyaiol Hcart Cire Physiol, 2003,285:H1521-H1527.
［5］Wang XF, Gao GD, Yang YB, et al. Identification of up-regulated genes induc ed by angiotensin Ⅱ in cardiac fibroblasts［J］. Acta Physiol Sin (生理学报), 2 005,57(5):643-647.
［6］齐丽，张钧华，李大元，等. 血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞调亡［J］. 北京大学 学报(医学版)，2002，34(2)：184-186.
［关键词］ 癫痫；心肌细胞；细胞外信号调节激酶
中图分类号：R54
文献标识码： A
文章编号：1009_816X(2008)01_0015_03
引起脑心综合征的原因很多，颞叶癫痫是最常见之一，但国内关于颅内疾患所致的脑心综合 征的报导，少有由癫痫引起脑心综合征 的临床报道。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)作为胞内信号转导系统，在海人藻酸(KA)致痫模型 中以及在心血管系统中均有重 要意义，然而MAPK在癫痫引发脑心综合征中是如何发挥作用，尚无公认的定论。有研究报道 ，在KA侧脑室内注射致痫模型中，痫性发作1/2h后ERK(细胞外信号调节激酶)、JNK、p38均 升高，ERK持续升高约3h，而JNK和p38在2h后即恢复正常［1］，本文对ERK在癫痫所 引起的脑心综合征中的表达进行探讨。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂：动物大脑立体定位仪（BUNKYO_KV113TOKYO）_日本；LMS_2B型二道 生理记录仪_成都。MAPK1/2（抗体）及KA购自美国sigma公司。
1.2 动物分组：实验动物选用健康雄性Wistar大鼠42只，体重约250克，均购自吉林大学 新民校区实验动物部，其中正常对照组大鼠7只，致痫组大鼠35只，按海人藻酸致痫后癫 痫发作即刻、1/2小时、2小时、4小时及6小时分为5组，每组各7只。
1.3 模型建立：将KA溶解在PBS中性缓冲液中，配制成浓度为1毫克/ 毫升的液体。用10%水合氯醛0.33ml/kg体重腹腔麻醉大鼠。将大鼠两外耳道固定于立体定 位仪上，并将水平线调零。取头颅正中菱形切口，暴 露颅骨及前囟、后囟，将立体定位仪正中线调零。右侧杏仁核基底外侧核的坐标位置为前囟 后2.5mm，旁开5.0mm，颅骨表面下8.0mm。用小牙钻钻透顶骨至硬脑膜处，一部分动物在 KA注射前，预先在左侧海马CA3区包埋双极电极。按照上述右侧杏仁核坐标，注入海仁藻酸1 ul，空白组为生理盐水1ul，注药后留针约5min左右，缓慢退出。然后，缝合切口，将大鼠 放在敞口有机玻璃罩中，按Racine分级法，将大鼠行为分为以下5级：0级_正常行为状态；I 级：湿狗样颤动，面部痉挛抽动，包括眨眼、动须、节律性咀嚼等；Ⅱ级：I级加节律性点 头；Ⅲ级：Ⅱ级加前肢痉挛；Ⅳ级：站立并伴双侧前肢痉挛；Ⅴ级：持续站立、倾倒、失平 衡、四肢抽动。达到以下两个条件为模型成功。①按Racine标准分级，大鼠致痫后出现Ⅲ级 以上发作；②鼠海马深部电极脑电图出现正常波上棘波和尖波放电。
1.4 免疫组化及染色：分别于大鼠癫痫发作后即刻、1/2h、2h、4h及6h后，以10%水合氯 醛麻醉大鼠，快速取心脏标本，置于10%中性缓冲福尔马林固定液中1.5小时后，弃去固定 液，准备酒精脱水、石蜡包埋及免疫组化及染色。切片经HE染色后拍照，在显微 镜下放大20倍后再拍照，每张切片选取10个视野，选定其中某一细胞作为标准，用Image_ Pro Plus图象分析软件测定心肌组织ERK表达的灰度值。
1.5 统计学处理：所有实验数据用x－±s表示。统计学分析，各组间比较采 用方差分析，成组数据的比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 海人藻酸致痫大鼠的海马深部电极脑电改变
正常大鼠脑电波形，频率以5～10赫兹为主，波幅小于700Mv，见图1。KA注射后各组大鼠脑 电 波均出现多种形式的癫痫性放电。典型波形有单棘波、多相棘波、双相棘波、棘慢波、尖波 发作性节律波、发作后抑制等，见图2。
2.2 致癫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表达的病理学改变，见图3～7。
2.3 致痫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表达的灰度值测定：见表1。
3 讨论
心脏和中枢神经系统相互关联，正常情况下脑通过自主神经系统调节心脏活动而维持一种稳 态，当神经系统发生病变时会打破这种稳态。
MAPK是一个重要的细胞内信号传导酶家族。其成员ERK与细胞生长、增殖、分化及凋亡， 甚至保护作用有关。心肌细胞凋亡是心肌细胞的一种程序性细胞死亡，它在心脏的正常发育过程中及心力衰 竭、原发性高血压、心律失常等许多心血管疾病的病理生理中起着重要作用［2］。E RK分子所涉及的通路可能通过影响苔藓纤维重组、突触重塑等机制参与癫痫的发病，与心肌 细胞的肥厚和凋亡等病理过程也密切相关。已有研究显 示，MEK_ERK通路可能对细胞凋亡的过程起到保护作用。PKC作为细胞信号传导系统中一个重 要成分，广泛存在于心肌细胞胞浆中，依赖Ca2+激活，参与细胞信息的传递、细胞的 增殖、突触的可塑性和基因的表达［3］。另有研究发现，Raf_1_ERK级联反应的上游 调控机制因细胞类型和刺激物的不同而有高度差异性，AngⅡ具有使心肌细胞凋亡的作用， 且AngⅡ激活心肌细胞ERK通过PKC,而不依赖Ras［4］。本实验通过杏仁核内注射KA致痫后的不同时程癫痫大鼠心肌细胞的病理学改变及 ERK蛋白表达的变化情况进行研究，结果显示正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，致密，结 构清晰，细胞核呈卵圆形，心肌纤维染色呈淡蓝色，无ERK蛋白表达。KA致痫后1/2小 时，心肌细胞ERK的磷酸化水平开始增高，于癫痫发作2小时后达高峰，与手术对照组相比， 具有显著性差异(P＜0.05)。之后逐渐下降，至6小时左右ERK表达基本消失。分析上述 结果的主要原因可能在于：癫痫等神经系统疾病急性发作时，可使机体处于应激状态，促发 肾素_血管紧张素醛固酮系统，使循环与局部组织的AngⅡ增高。AngⅡ与细胞膜上的AT1受体 结合，产生二酰基甘油和三磷酸肌醇(IP3)，IP3与内质网上IP3受体结合，使内质网释放钙 增加，二酰基甘油激活蛋白激酶C，引起细胞内Na＋-H＋交换，促进细胞内外Ca2＋ -Na＋交换，进入细胞内的Ca2＋增多，使细胞内钙超载［5］，进而激活P KC信号传导途径。癫痫发作2小时ERK表达达高峰，在此时间段An gⅡ可引起心肌细胞ERK激活发挥短暂的抗凋亡作用，随后逐渐降低，约6小时后，心肌细胞E RK表达基本正常，抗凋亡作用基本消失，继发引起其它致心肌细胞凋亡因素的作用增强，最 终引起心肌细胞凋亡。但离体实验证明血管紧张素引起调亡的机制为激活P38激酶与P53蛋白 从而引起Bcl_2Bax蛋白比值降低，启动caspase_3，引起钙依赖的DnaseⅠ启动而导致凋亡［6］。总之，ERK在癫痫所引起脑心综合征中有表达，起到短暂的抗凋亡作用，随着时 间的推移，AngⅡ最终引起ERK表达减弱，致使其它促凋亡因素的作用增强而引起心肌细胞凋 亡，这又与以往AngⅡ具有使心肌细胞凋亡的作用等研究结论相一致。
参考文献
［1］刘智良，徐如祥，姚志彬，等.红藻氨酸致痫后大鼠海马ERK、P38MAPK和JNK 的活性变化［J］.中华神经医学杂志，2006，5(2)：137-144.
［2］李天富,吕传真,夏作理,等.杏仁核注射红藻氨酸诱导的边缘叶发作癫痫大鼠海马Ba d去磷酸化和Bcl_2表达上调［Ｊ］.生理学报,2004,57(3):310-318.
［3］Chien KR, Grace AA, Hunter JJ. Molecular biology of cardiac hypertrophy and
heart failure. In: Chien KR, ed.Molecular Basis of Cardiovascular Disease［M］.
Philadelphia, Pa: WB Saunders Co, 1998:211-250.
［4］House B, Sopart A, Isenberg G. Cyclical mechanical stretch_induced apoptosi s in myocytes from young rats but necrosis in myocytes from old rats［J］. Am J
Phyaiol Hcart Cire Physiol, 2003,285:H1521-H1527.
［5］Wang XF, Gao GD, Yang YB, et al. Identification of up-regulated genes induc ed by angiotensin Ⅱ in cardiac fibroblasts［J］. Acta Physiol Sin (生理学报), 2 005,57(5):643-647.
［6］齐丽，张钧华，李大元，等. 血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞调亡［J］. 北京大学 学报(医学版)，2002，34(2)：184-186.