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摘 要 为了提高种子质量和充分利用辣椒种质资源，应用SSR分子标记对热辣2号杂交种纯度进行鉴定并对部分辣椒优良自交系进行遗传多样性分析。以热辣2号母本材料CAYB02和父本材料CAYB01为模板筛选85对辣椒SSR引物，其中12对引物在亲本间能扩增出明显的多态性，多态性比率为14.12%，多态性标记分别位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12号染色体，利用3对位于不同染色体上的SSR标记对热辣2号黄灯笼椒杂交种的纯度进行鉴定，热辣2号种子纯度为98.79%，标记鉴定结果与田间鉴定结果一致。研究结果表明，利用SSR标记鉴定辣椒杂交种纯度是切实可行的。利用12对多态性明显、稳定可靠的SSR引物对部分辣椒自交系进行遗传多样性分析，共扩增出60条条带，多态性位点比率为100%，平均每对引物检测出5个等位基因。30份辣椒自交系间遗传相似系数变幅为0.33～1.00，平均为0.65，表明供试材料间具有丰富的遗传多样性。聚类分析结果表明，在遗传相似系数为0.47时，可以将中国辣椒和一年生辣椒区分开来。在遗传相似系数为0.85时，30份辣椒优良自交系分为11个类群，辣椒种质遗传关系与地理来源和农艺性状具有一定的相关性。
关键词 热辣2号；SSR；杂交种；纯度鉴定；遗传多样性；聚类分析
中图分类号 S641.3 文献标识码 A
种子是重要的农业生产资料，开展杂交种纯度检测对保证种子质量、提高生产效益与杂种优势的有效利用具有重要意义[1]。作物杂交种纯度检验的常用方法主要包括田间种植鉴定和同工酶电泳鉴定等[2]。田间种植鉴定主要基于成株期植株及果实的形态特征，需要耗费大量的土地资源和劳动力，试验周期较长，并且易受环境条件的影响[3-4]。对于遗传基础比较狭窄的作物，真正的杂交种和假杂交种形态差异不一定总是很明显，鉴定结果的准确性会受到影响。同工酶电泳鉴定具有组织器官特异性，受植株发育阶段的影响，多态性水平较低[5-6]。传统的鉴定方法难以满足作物品种纯度鉴定在精确度方面的要求。急需开发一种简单、快速、准确的杂交种纯度检测方法。分子标记技术可以弥补杂交种纯度传统鉴定中的许多缺陷，为作物杂交种纯度鉴定提供一种准确、快速和简便的方法。Ballester等[7]和李成伟等[8]利用RAPD分子标记技术鉴定辣椒杂交种纯度，结果证明RAPD技术可用于辣椒杂交种纯度的快速鉴定。王得元等[9]和李智军等[10]利用RAPD分子标记技术分别检测‘粤椒1号’和黄皮尖椒‘秀黄F1’种子纯度，鉴定结果与田间检测结果完全一致。
种质资源是栽培品种改良、新品种选育的基础。辣椒作为一种世界性蔬菜作物具有丰富的遗传和表型多样性，遗传多样性分析是种质资源评价和利用的主要内容之一。加强辣椒遗传多样性研究，筛选优异种质资源，对改良辣椒品种、提高辣椒产量和品质具有重要意义。陈学军等[11]利用RAPD、ISSR标记及表型数据对13份辣椒材料进行遗传多样性分析，结果表明基于RAPD、ISSR的聚类结果与基于表型数据的聚类结果之间存在极显著正相关，能够将一年生辣椒与其它栽培种区分开来。李晴等[12]利用RAPD标记分析了37份辣椒种质遗传多样性，将37份辣椒种质分为5个类群。
尽管RAPD标记操作简单，检测快速，不需要提前知道基因组序列信息，但RAPD标记多为显性标记，检测结果重复性和稳定性较差，易受各种因素影响，ISSR分子标记大部分为显性标记，利用RAPD和ISSR标记进行种子纯度鉴定和遗传多样性分析具有一定的局限性。SSR，即简单序列重复，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列。SSR标记在真核生物基因组中具有数量丰富、分布均匀、共显性遗传、等位性变异丰富、操作简单、不受环境因素影响、稳定性和重复性好等优点，是进行作物遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、杂交种纯度鉴定、基因定位及标记辅助育种的理想标记类型[13]，已在多种农作物杂交种纯度鉴定中得到应用[14-15]。但在辣椒杂交种纯度鉴定及遗传多样性分析方面鲜有报道。本研究拟利用SSR标记技术对热辣2号黄灯笼椒杂交种进行纯度鉴定并对海南地区30份辣椒优良自交系进行遗传多样性分析，以期为辣椒良种的及时销售与种质资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
辣椒杂交种一代热辣2号酱用型黄灯笼辣椒，母本材料CAYB02和父本材料CAYB01由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。热辣2号酱用型黄灯笼辣椒是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所经多年研究选育出的杂种一代酱用型黄灯笼椒。播种至开花约需80 d，至大量收获约需142 d，生长势强，始收时株高55～60 cm，最高株高130 cm，最大开展度90 cm，分枝能力极强，叶浅绿色至绿色，每节花数为3～10朵，未成熟果深绿色，老熟果中黄色至深黄色，果长5.5 cm左右，果宽3.5 cm左右，单果重14.5 g左右，最大单果重可达22 g，每果位座果1～3个，个别果位可座果4～6个，一般单株座果130个左右，每公顷产量45 000 kg左右，最高可达75 000 kg。
供试辣椒优良自交系共30份，均是经过多次杂交、回交和自交选育出的自交系，抗逆性及部分农艺性状表现优良，并且适应海南地区的气候条件。其中中国辣椒22份，一年生辣椒8份。在22份中国辣椒种质中，7份来自中国，6份来自英国，7份来自法国，1份来自美国，1份来自巴西。在8份一年生辣椒种质中，7份来自中国，1份来自美国。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 将供试的辣椒材料播种于营养钵中，按照常规栽培措施进行管理，待植株生长至4～5片真叶时取材提取叶片基因组DNA，提取方法采用Liu等[16]的CTAB法提取。
1.2.2 多态性标记分析 选取来源地和农艺性状差异显著的中国辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因组DNA为模板，利用已开发的辣椒SSR引物（http：//solgenomics.net/search/markers）进行扩增，筛选多态性的SSR标记。 PCR反应体系为10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），45 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，
0.2 mmol/L dNTPs，55 ng引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，60～80 ng模板DNA。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50～60 ℃（根据具体引物的退火温度而定）退火35 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸8 min。PCR产物保存于4 ℃。5 μL扩增产物与2 μL上样缓冲液混合经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺 ∶ 甲叉双丙烯酰胺=39 ∶ 1）电泳，银染显色进行带型统计。
1.2.3 热辣2号种子纯度鉴定 以热辣2号黄灯笼椒单株DNA为模板，利用在亲本材料间表现为共显性的SSR标记进行扩增，根据特异谱带的有无检测杂交种的纯度。将取材后的辣椒幼苗按照顺序移栽到土质肥沃的地块，采用常规措施进行管理，在热辣2号黄灯笼椒成株期依据品种特征特性逐株进行鉴定，将标记鉴定结果与田间鉴定结果进行比较分析。
1.3 数据统计与分析
将电泳图谱上清晰条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”，构建[1， 0]二元数列矩阵，利用NTsys_2.10e软件Qualitative data相似性分析模块计算供试材料间的遗传相似系数，采用SAHN聚类分析模块中的UPGMA法进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 热辣2号亲本间多态性标记筛选
以热辣2号母本材料CAYB02和父本材料CAYB01为模板筛选85对辣椒SSR引物，其中12对引物在亲本间能扩增出明显的多态性，多态性比率为14.12%，多态性标记分别位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12号染色体，多态性片段大小100～300 bp。
2.2 热辣2号杂交种纯度鉴定
利用多态性的共显性标记SSR7、SSR58和SSR64对165株热辣2号黄灯笼椒进行纯度鉴定，从SSR标记扩增结果看出，163个热辣2号单株既具有母本特异谱带也具有父本特异谱带，属于真实的杂交种，5号和24号单株缺少父本特异带，与母本扩增带型一致，说明5号和24号单株为母本自交株，3对标记的鉴定结果完全一致（图1），热辣2号杂交种的纯度为98.79%。成株期田间调查结果发现，5号和24号植株与母本性状一样，果皮颜色为浅绿色，其余植株均具有热辣2号黄灯笼椒典型特征，果皮颜色为深绿色。田间形态学鉴定结果与SSR标记检测结果完全一致，试验结果说明SSR技术可用于酱用型辣椒热辣2号的种子纯度快速检测。
2.3 遗传相似性分析
以中国辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因组DNA为模板筛选85对辣椒SSR引物，其中22对引物在三份材料间存在多态性，多态性比率为25.88%。选取12对扩增条带清晰，稳定性和重复性较好的SSR标记，分别位于1、2、3、5、7、9、11、12号染色体上，对30份辣椒优良自交系进行多样性分析。12对SSR标记在辣椒优良自交系中共扩增出60条条带，多态性比率为100%，多态性片段大小为100～360 bp（表3和图2）。统计PCR扩增条带，按照条带的有无分别记为1和0，构建数据矩阵，利用NTsys_2.10e软件计算遗传相似系数，在供试的30份材料中，不同辣椒种质间遗传相似性系数变幅为0.33～1.00，平均为0.65，表明这些自交系间遗传差异较大。其中一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8间，中国辣椒CA05和CA16间，中国辣椒CA15和CA09间相似性系数最大，为1.00，表明这些材料间亲缘关系较近。中国辣椒CA12与一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8间相似性系数最小，为0.33，表明中国辣椒CA12与一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8亲缘关系较远。
2.4 聚类分析
基于辣椒种质间相似系数矩阵，利用NTsys_2.10e软件进行聚类分析，在遗传相似系数为0.47处可以将中国辣椒种质资源与一年生辣椒种质资源区分开。在遗传相似系数为0.85处，30份辣椒优良自交系资源被分为11个类群，第1类群包括11份中国辣椒种质，分别为来自中国海南2份，来自法国7份，来自巴西1份，来自中国云南1份。第2类群包括5份来自英国的中国辣椒种质。第3类群包括1份来自英国的中国辣椒种质。第4类群包括1份来自美国的中国辣椒种质。第5、6、7、8类群分别包含1份来自中国的中国辣椒种质。第9类群包括5份来自中国的一年生辣椒种质，其中CA202、CAF9、CAF1和CAM8属于一年生辣椒中的灯笼椒，CA267属于一年生辣椒中的短锥椒。第10类群包括2份来自中国的一年生辣椒种质CA211和CA92，属于一年生辣椒中的长角椒。第11类群包括1份来自美国的一年生辣椒种质CA269，属于一年生辣椒中的樱桃椒。同一来源地的材料和农艺性状相似的材料具有聚集在一起的趋势，如来自中国海南的CAYB01和CA07，来自法国的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，来自英国的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生灯笼椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生长角椒CA211和CA92。第3、4、5、6、7、8和11类群分别由1份种质材料组成，表明这7份种质与其余种质亲缘关系较远（图3）。本研究室选取亲缘关系较远的中国辣椒自交系配制了杂交组合，其中CAYB02×CAYB01、CA12×CA11、CAYB02×CA11、CA12×CA18的辣度分别为172 000、214 000、217 000和332 000 SHU，产量和综合抗病能力均优于本地对照品种。
3 讨论与结论 辣椒在制种过程中大部分都是通过人工去雄完成的，所以影响辣椒杂交种子纯度的主要问题就是母本去雄不彻底形成的自交种。此外，制种过程中的串粉及收获后的机械混杂也是导致杂株产生的原因。分子标记技术因其准确、快速、稳定、不受环境因素影响、无器官、组织及发育特异性等特点，已逐步成为作物杂交种纯度检测的主要工具[17]，近年来，RFLP、AFLP、RAPD和ISSR标记被广泛用于作物品种指纹图谱构建、种子纯度鉴定和种质资源鉴定[18-20]。但RFLP标记价格昂贵、操作流程比较复杂并且带有放射性；AFLP标记对DNA的质量要求很高，不适于进行大批量杂交种纯度鉴定；RAPD和ISSR标记多为显性标记，不能将杂合体和纯合体有效区分。SSR标记数量丰富，在植物基因组上均衡分布[21-22]，共显性遗传，稳定性和重复性较好，目前是进行作物杂交种纯度鉴定最理想的标记类型，被广泛用于作物种子纯度鉴定[23-25]。但在辣椒杂交种纯度鉴定方面鲜有报道。本研究利用SSR标记检测热辣2号黄灯笼椒杂交种纯度，分子标记鉴定结果与田间鉴定结果完全一致，热辣2号杂交种纯度为98.79%，热辣2号黄灯笼椒杂交种中仅混杂了母本自交种，可能是由于去雄不彻底导致的母本自交种。该研究结果表明利用SSR分子标记技术检测热辣2号杂交种纯度是切实可行的。
Nandakumar等[26]和Yashitola等[17]研究提出单对多态性的SSR标记可以充分地对杂交种纯度进行鉴定。然而，在品种选育过程中因亲本自交代数不够，存在亲本本身遗传背景未完全纯合的现象，某些位点还处于杂合状态，因此利用这些标记位点进行纯度检测的结果准确性较差。Sundaram等[27]利用多对SSR标记基于多重PCR技术对水稻杂交种进行纯度检测，进一步证明了多对标记检测相对于单对标记检测在准确性方面的优势。基于这一观点，为确保鉴定结果的准确性和可靠性，本研究选取3对位于辣椒不同染色体上的共显性SSR标记检测热辣2号黄灯笼椒杂交种纯度，3对标记的检测结果完全一致，并且分子标记检测结果与田间形态鉴定结果达到了完全一致，这也进一步表明热辣2号黄灯笼椒亲本材料纯合度较高。
作物种质资源是实现各个育种途径的原始材料，育种效果在很大程度上决定于原始材料的选择。对种质资源遗传多样性进行研究有助于了解不同种质的遗传背景及品种间的亲缘关系，可以有效地进行亲本选配，从而更加合理地进行试验设计[28]。本研究利用位于辣椒不同染色体上SSR标记对30份辣椒优良自交系进行遗传多样性分析，遗传相似性分析结果表明供试辣椒种质间具有丰富的遗传多样性。聚类分析结果表明，SSR标记可以把不同栽培种的辣椒材料区分开来，相同来源地的材料和农艺性状相似的材料具有聚集在一起的趋势，如来自中国海南的CAYB01和CA07，来自法国的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，来自英国的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生灯笼椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生长角椒CA211和CA92。CASM4、CA44、CA01和CA38虽都为来自中国的中国辣椒种质，但却单独聚为一类，这可能是由于种质资源的遗传改良导致了遗传背景的差异。第3、4、5、6、7、8和11类群分别由1份种质材料组成，表明这7份种质与其余种质亲缘关系较远。实践中为了更好地利用杂种优势，可以选取亲缘关系较远的种质配制杂交组合。本研究室已经根据中国辣椒自交系的亲缘关系配制了杂交组合，其辣椒素的含量均显著优于对照品种。
参考文献
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关键词 热辣2号；SSR；杂交种；纯度鉴定；遗传多样性；聚类分析
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种质资源是栽培品种改良、新品种选育的基础。辣椒作为一种世界性蔬菜作物具有丰富的遗传和表型多样性，遗传多样性分析是种质资源评价和利用的主要内容之一。加强辣椒遗传多样性研究，筛选优异种质资源，对改良辣椒品种、提高辣椒产量和品质具有重要意义。陈学军等[11]利用RAPD、ISSR标记及表型数据对13份辣椒材料进行遗传多样性分析，结果表明基于RAPD、ISSR的聚类结果与基于表型数据的聚类结果之间存在极显著正相关，能够将一年生辣椒与其它栽培种区分开来。李晴等[12]利用RAPD标记分析了37份辣椒种质遗传多样性，将37份辣椒种质分为5个类群。
尽管RAPD标记操作简单，检测快速，不需要提前知道基因组序列信息，但RAPD标记多为显性标记，检测结果重复性和稳定性较差，易受各种因素影响，ISSR分子标记大部分为显性标记，利用RAPD和ISSR标记进行种子纯度鉴定和遗传多样性分析具有一定的局限性。SSR，即简单序列重复，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列。SSR标记在真核生物基因组中具有数量丰富、分布均匀、共显性遗传、等位性变异丰富、操作简单、不受环境因素影响、稳定性和重复性好等优点，是进行作物遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、杂交种纯度鉴定、基因定位及标记辅助育种的理想标记类型[13]，已在多种农作物杂交种纯度鉴定中得到应用[14-15]。但在辣椒杂交种纯度鉴定及遗传多样性分析方面鲜有报道。本研究拟利用SSR标记技术对热辣2号黄灯笼椒杂交种进行纯度鉴定并对海南地区30份辣椒优良自交系进行遗传多样性分析，以期为辣椒良种的及时销售与种质资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
辣椒杂交种一代热辣2号酱用型黄灯笼辣椒，母本材料CAYB02和父本材料CAYB01由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。热辣2号酱用型黄灯笼辣椒是中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所经多年研究选育出的杂种一代酱用型黄灯笼椒。播种至开花约需80 d，至大量收获约需142 d，生长势强，始收时株高55～60 cm，最高株高130 cm，最大开展度90 cm，分枝能力极强，叶浅绿色至绿色，每节花数为3～10朵，未成熟果深绿色，老熟果中黄色至深黄色，果长5.5 cm左右，果宽3.5 cm左右，单果重14.5 g左右，最大单果重可达22 g，每果位座果1～3个，个别果位可座果4～6个，一般单株座果130个左右，每公顷产量45 000 kg左右，最高可达75 000 kg。
供试辣椒优良自交系共30份，均是经过多次杂交、回交和自交选育出的自交系，抗逆性及部分农艺性状表现优良，并且适应海南地区的气候条件。其中中国辣椒22份，一年生辣椒8份。在22份中国辣椒种质中，7份来自中国，6份来自英国，7份来自法国，1份来自美国，1份来自巴西。在8份一年生辣椒种质中，7份来自中国，1份来自美国。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 将供试的辣椒材料播种于营养钵中，按照常规栽培措施进行管理，待植株生长至4～5片真叶时取材提取叶片基因组DNA，提取方法采用Liu等[16]的CTAB法提取。
1.2.2 多态性标记分析 选取来源地和农艺性状差异显著的中国辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因组DNA为模板，利用已开发的辣椒SSR引物（http：//solgenomics.net/search/markers）进行扩增，筛选多态性的SSR标记。 PCR反应体系为10 μL，其中包括10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），45 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，
0.2 mmol/L dNTPs，55 ng引物，0.5 U Taq DNA聚合酶，60～80 ng模板DNA。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50～60 ℃（根据具体引物的退火温度而定）退火35 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸8 min。PCR产物保存于4 ℃。5 μL扩增产物与2 μL上样缓冲液混合经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺 ∶ 甲叉双丙烯酰胺=39 ∶ 1）电泳，银染显色进行带型统计。
1.2.3 热辣2号种子纯度鉴定 以热辣2号黄灯笼椒单株DNA为模板，利用在亲本材料间表现为共显性的SSR标记进行扩增，根据特异谱带的有无检测杂交种的纯度。将取材后的辣椒幼苗按照顺序移栽到土质肥沃的地块，采用常规措施进行管理，在热辣2号黄灯笼椒成株期依据品种特征特性逐株进行鉴定，将标记鉴定结果与田间鉴定结果进行比较分析。
1.3 数据统计与分析
将电泳图谱上清晰条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”，构建[1， 0]二元数列矩阵，利用NTsys_2.10e软件Qualitative data相似性分析模块计算供试材料间的遗传相似系数，采用SAHN聚类分析模块中的UPGMA法进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 热辣2号亲本间多态性标记筛选
以热辣2号母本材料CAYB02和父本材料CAYB01为模板筛选85对辣椒SSR引物，其中12对引物在亲本间能扩增出明显的多态性，多态性比率为14.12%，多态性标记分别位于辣椒1、3、4、6、7、9、11、12号染色体，多态性片段大小100～300 bp。
2.2 热辣2号杂交种纯度鉴定
利用多态性的共显性标记SSR7、SSR58和SSR64对165株热辣2号黄灯笼椒进行纯度鉴定，从SSR标记扩增结果看出，163个热辣2号单株既具有母本特异谱带也具有父本特异谱带，属于真实的杂交种，5号和24号单株缺少父本特异带，与母本扩增带型一致，说明5号和24号单株为母本自交株，3对标记的鉴定结果完全一致（图1），热辣2号杂交种的纯度为98.79%。成株期田间调查结果发现，5号和24号植株与母本性状一样，果皮颜色为浅绿色，其余植株均具有热辣2号黄灯笼椒典型特征，果皮颜色为深绿色。田间形态学鉴定结果与SSR标记检测结果完全一致，试验结果说明SSR技术可用于酱用型辣椒热辣2号的种子纯度快速检测。
2.3 遗传相似性分析
以中国辣椒材料CAYB01、CAYB02和一年生辣椒CA269的基因组DNA为模板筛选85对辣椒SSR引物，其中22对引物在三份材料间存在多态性，多态性比率为25.88%。选取12对扩增条带清晰，稳定性和重复性较好的SSR标记，分别位于1、2、3、5、7、9、11、12号染色体上，对30份辣椒优良自交系进行多样性分析。12对SSR标记在辣椒优良自交系中共扩增出60条条带，多态性比率为100%，多态性片段大小为100～360 bp（表3和图2）。统计PCR扩增条带，按照条带的有无分别记为1和0，构建数据矩阵，利用NTsys_2.10e软件计算遗传相似系数，在供试的30份材料中，不同辣椒种质间遗传相似性系数变幅为0.33～1.00，平均为0.65，表明这些自交系间遗传差异较大。其中一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8间，中国辣椒CA05和CA16间，中国辣椒CA15和CA09间相似性系数最大，为1.00，表明这些材料间亲缘关系较近。中国辣椒CA12与一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8间相似性系数最小，为0.33，表明中国辣椒CA12与一年生辣椒CA202、CAF9、CAF1、CAM8亲缘关系较远。
2.4 聚类分析
基于辣椒种质间相似系数矩阵，利用NTsys_2.10e软件进行聚类分析，在遗传相似系数为0.47处可以将中国辣椒种质资源与一年生辣椒种质资源区分开。在遗传相似系数为0.85处，30份辣椒优良自交系资源被分为11个类群，第1类群包括11份中国辣椒种质，分别为来自中国海南2份，来自法国7份，来自巴西1份，来自中国云南1份。第2类群包括5份来自英国的中国辣椒种质。第3类群包括1份来自英国的中国辣椒种质。第4类群包括1份来自美国的中国辣椒种质。第5、6、7、8类群分别包含1份来自中国的中国辣椒种质。第9类群包括5份来自中国的一年生辣椒种质，其中CA202、CAF9、CAF1和CAM8属于一年生辣椒中的灯笼椒，CA267属于一年生辣椒中的短锥椒。第10类群包括2份来自中国的一年生辣椒种质CA211和CA92，属于一年生辣椒中的长角椒。第11类群包括1份来自美国的一年生辣椒种质CA269，属于一年生辣椒中的樱桃椒。同一来源地的材料和农艺性状相似的材料具有聚集在一起的趋势，如来自中国海南的CAYB01和CA07，来自法国的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，来自英国的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生灯笼椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生长角椒CA211和CA92。第3、4、5、6、7、8和11类群分别由1份种质材料组成，表明这7份种质与其余种质亲缘关系较远（图3）。本研究室选取亲缘关系较远的中国辣椒自交系配制了杂交组合，其中CAYB02×CAYB01、CA12×CA11、CAYB02×CA11、CA12×CA18的辣度分别为172 000、214 000、217 000和332 000 SHU，产量和综合抗病能力均优于本地对照品种。
3 讨论与结论 辣椒在制种过程中大部分都是通过人工去雄完成的，所以影响辣椒杂交种子纯度的主要问题就是母本去雄不彻底形成的自交种。此外，制种过程中的串粉及收获后的机械混杂也是导致杂株产生的原因。分子标记技术因其准确、快速、稳定、不受环境因素影响、无器官、组织及发育特异性等特点，已逐步成为作物杂交种纯度检测的主要工具[17]，近年来，RFLP、AFLP、RAPD和ISSR标记被广泛用于作物品种指纹图谱构建、种子纯度鉴定和种质资源鉴定[18-20]。但RFLP标记价格昂贵、操作流程比较复杂并且带有放射性；AFLP标记对DNA的质量要求很高，不适于进行大批量杂交种纯度鉴定；RAPD和ISSR标记多为显性标记，不能将杂合体和纯合体有效区分。SSR标记数量丰富，在植物基因组上均衡分布[21-22]，共显性遗传，稳定性和重复性较好，目前是进行作物杂交种纯度鉴定最理想的标记类型，被广泛用于作物种子纯度鉴定[23-25]。但在辣椒杂交种纯度鉴定方面鲜有报道。本研究利用SSR标记检测热辣2号黄灯笼椒杂交种纯度，分子标记鉴定结果与田间鉴定结果完全一致，热辣2号杂交种纯度为98.79%，热辣2号黄灯笼椒杂交种中仅混杂了母本自交种，可能是由于去雄不彻底导致的母本自交种。该研究结果表明利用SSR分子标记技术检测热辣2号杂交种纯度是切实可行的。
Nandakumar等[26]和Yashitola等[17]研究提出单对多态性的SSR标记可以充分地对杂交种纯度进行鉴定。然而，在品种选育过程中因亲本自交代数不够，存在亲本本身遗传背景未完全纯合的现象，某些位点还处于杂合状态，因此利用这些标记位点进行纯度检测的结果准确性较差。Sundaram等[27]利用多对SSR标记基于多重PCR技术对水稻杂交种进行纯度检测，进一步证明了多对标记检测相对于单对标记检测在准确性方面的优势。基于这一观点，为确保鉴定结果的准确性和可靠性，本研究选取3对位于辣椒不同染色体上的共显性SSR标记检测热辣2号黄灯笼椒杂交种纯度，3对标记的检测结果完全一致，并且分子标记检测结果与田间形态鉴定结果达到了完全一致，这也进一步表明热辣2号黄灯笼椒亲本材料纯合度较高。
作物种质资源是实现各个育种途径的原始材料，育种效果在很大程度上决定于原始材料的选择。对种质资源遗传多样性进行研究有助于了解不同种质的遗传背景及品种间的亲缘关系，可以有效地进行亲本选配，从而更加合理地进行试验设计[28]。本研究利用位于辣椒不同染色体上SSR标记对30份辣椒优良自交系进行遗传多样性分析，遗传相似性分析结果表明供试辣椒种质间具有丰富的遗传多样性。聚类分析结果表明，SSR标记可以把不同栽培种的辣椒材料区分开来，相同来源地的材料和农艺性状相似的材料具有聚集在一起的趋势，如来自中国海南的CAYB01和CA07，来自法国的CA05和CA16，CA04和CA17，CA15和CA09，来自英国的CAYB02、CA60、CA57、CA78和CA49，一年生灯笼椒CA202、CAF9、CAF1和CAM8，一年生长角椒CA211和CA92。CASM4、CA44、CA01和CA38虽都为来自中国的中国辣椒种质，但却单独聚为一类，这可能是由于种质资源的遗传改良导致了遗传背景的差异。第3、4、5、6、7、8和11类群分别由1份种质材料组成，表明这7份种质与其余种质亲缘关系较远。实践中为了更好地利用杂种优势，可以选取亲缘关系较远的种质配制杂交组合。本研究室已经根据中国辣椒自交系的亲缘关系配制了杂交组合，其辣椒素的含量均显著优于对照品种。
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