【摘 要】
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建立一种利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(No30300421,30672077)~~
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建立一种利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的MIF-GFP融合表达载体pEGFP-MIF.分别将3个靶向MIF的siRNA表达质粒与pEGFP-MIF共转化HEK293细胞,在荧光显微镜下观察HEK293细胞中GFP的表达,并用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.同时,将MIFsiRNA表达质粒分别与MIF表达载体共转化HEK293细胞,用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.定量PCR结果显示,GFP表达低的细胞中,MIF mRNA的表达也明显降低;利用pEGFP-MIF和MIF表达载体筛选到的有效MIFsiRNA的结果一致.因此,建立了目的基因与GFP融合表达,以GFP作为报告分子来筛选抑制目的基因表达siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.
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