【摘 要】
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目的 构建鸟分枝杆菌PPE25-MAV蛋白的重组质粒并诱导表达和纯化,观察其对Ana-1系巨噬细胞凋亡的影响.方法 在GenBank中查找到鸟分枝杆菌编码PPE25-MAV蛋白的MAV-2928基因序列
【机 构】
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大理大学基础医学院微生物与免疫学教研室,云南大理671000
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目的 构建鸟分枝杆菌PPE25-MAV蛋白的重组质粒并诱导表达和纯化,观察其对Ana-1系巨噬细胞凋亡的影响.方法 在GenBank中查找到鸟分枝杆菌编码PPE25-MAV蛋白的MAV-2928基因序列,合成全基因并构建质粒.将质粒亚克隆至表达载体pET-32a(+)上,构建重组表达质粒pET-32a-ppe25,转入感受态细胞BL21(DE3)后,通过1PTG诱导表达融合蛋白PPE25-MAV.用Ni Resin FF纯化蛋白,并作用于巨噬系Ana-1细胞,流式细胞术(FCM)检测巨噬细胞凋亡率并且分析其变化.结果 鸟分枝杆菌PPE25-MAV蛋白表达载体构建成功,转化至BL21(DE3)后经IPTG诱导表达约59 ku的蛋白,与预期大小相符;Western blot检测该蛋白能被His抗体识别.用纯化的PPE25-MAV蛋白作用小鼠巨噬系Ana-1细胞,与空白对照组相比,作用2h后细胞的早期凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05),细胞的晚期凋亡率和总凋亡率在0.5 μg/ml与1 μg/ml时均低于空白组(P＜0.05),2 μg/ml与5 μg/ml的凋亡率与对照组比较差异无统计学意义;作用10h细胞的早期凋亡率仅在5 μg/ml时升高(P＜0.05),0.5、1和2μg/m1剂量组差异无统计学意义(P＞0.05),细胞晚期凋亡率和总凋亡率在2 μg/ml和5 μg/ml时显著降低(P＜0.05),0.5 μg/ml和1 μg/ml组凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒诱导表达的PPE25-MAV蛋白存在于上清和包涵体中,但主要以包涵体形式表达.纯化的PPE25-MAV蛋白对巨噬细胞凋亡有抑制作用,且主要作用于巨噬细胞的晚期凋亡阶段.
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