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摘要：目的 ： 探索一种经济、方便、长期的保存常用微生物菌种的方法。 方法： 将21种细菌分别用半固体、甘油、脱脂牛奶、微孔珠进行保存及复苏鉴定，比较4种菌种保存方法的保存效果。结果： 通过2年的实验证明用甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法保存时间长，且未发生形态结构、生物学特性的变异。结论： 甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法操作简便易行，长期保存的存活率高，菌种的变异率低，适用于一般微生物学实验室菌种的保存工作。
关键词：半固体；甘油；脱脂牛奶；微孔珠；菌种保存
基金项目：湖南省“十二五”综合改革试点项目，湖南省教育厅教改项目（编号： 2010516）
微生物学实验教学中，典型的菌种是实验教学能否成功开展和达到满意的教学效果的关键因素。菌种因受到外界环境及自身代谢的影响，长期在培养基上移种和传代后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，而成为不典型的菌株甚至死亡[1]。因而菌种保存工作在微生物学实验教学工作中变得尤为重要。我们通过反复实验试图寻求既操作简便又可保持菌种的存活率，降低菌种的变异率，适用于医学微生物学实验室的菌种保存方法。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， 25922）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis， 26104）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus， 27101）、甲型溶血性链球菌（α-hemolytic streptococcus， 32212）、乙型溶血性链球菌（β-hemolytic strepto-coccus， 32210-4a）、肺炎链球菌（S.pneumoniae，31002-16）、脑膜炎奈瑟菌（N. meningitides， 29019）、大肠埃希菌（Escherichia coli， 44101）、肺炎克雷伯菌（K.peumoniae）产气肠杆菌（E. aerogenes， 45103）、变形杆菌（P. mirabilis， 49006）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi， 50402）、甲型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi A， 50001）、乙型副伤寒沙门氏菌（S. paratyphi B，50602）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae 51252-8）、福氏志贺菌（S. flexneri， 51573）、宋内志贺菌（S. sonnei，51334-21）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa， 10102）、蜡样芽胞杆菌（B.cereus， 63301）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis，63501）、白色念珠菌（C. albicans）。以上菌种中，肺炎克雷伯菌、白色念珠菌由湖南医药学院附属一医院分离，甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌购自北京生物制品检定所，其余均购自湖南省疾控中心。
1.1.2培养基
半固体培养基、营养肉汤、血清肉汤、脱脂牛奶培养基、普通营养琼脂、血琼脂培养基、巧克力琼脂、沙氏琼脂，培养基均用常规方法配制、灭菌。
1.1.3微孔珠保存管
甘油（分析纯）分装于玻璃试管中经121.3℃灭菌30min。保存管为购自珠海贝索生物技术有限公司，主要组成是冷冻保存管内有微孔珠（10粒）、培养基（胰蛋白胨、NaCl、甘油）。
1.2方法
1.2.1菌种的纯化
甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌在血琼脂培养基纯化；脑膜炎奈瑟菌在巧克力琼脂上纯化；白色念珠菌在沙氏琼脂纯化；其余菌种在普通营养琼脂上纯化。
1.2.2甘油保存法
纯化后，挑取甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌于血清肉汤培養基中，置普通培养箱37℃培养12～18h；挑取脑膜炎奈瑟菌于血清肉汤培养基中，5%～10%CO2环境37℃培养12～18h；其余菌种分别接种于营养肉汤培养基中，置普通培养箱37℃培养12～18h。将以上培养物与等量的已灭菌的甘油充分混匀后，分装于微量无菌离心管或细胞冻存管中，每个菌种均分装20支，并分成2组。置-20℃保存。
1.2.3脱脂牛奶保存法
将灭菌脱脂牛奶培养基分装于无菌的微量离心管或细胞冻存管中，挑取纯化后的菌种（菌落尽量多）于分装好的牛奶培养基中，每个菌种均分装20支，并分成2组。充分混匀后置-20℃保存。
1.2.4半固体保存法
挑取纯化后甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌接种于血清半固体培养基中，其余菌种分别接种于半固体培养基中，每个菌种均接种20支，并分成2组。置普通培养箱37℃培养12～18h后加一层1cm厚的无菌液体石蜡，置4℃冰箱保存。
1.2.5微孔珠保存法
3.讨论
菌种是微生物实验室中不可缺少实验标本，为了保证实验教学的需要，对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节。真空冷冻干燥保存法是目前菌种保存最有效的方法之一，但是此方法操作过程繁琐，且需要专用的设备（冷冻真空干燥机），成本较高，普通微生物学实验室难以实现。因此，我们需要既有效，又方便、经济适用的菌种保存方法用于微生物学实验教学。我们近2年来用甘油、脱脂牛奶、半固体、微孔珠对21种菌株分别进行保存试验的比较，结果表明，半固体保存法虽然操作简单，菌种复苏方便，但不适用于对营养要求特殊的链球菌和奈瑟氏菌等菌株，且菌种需3～6个月转种一次，菌种在多次传代转种过程中易发生变异。甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法相对来说操作简单、运行成本低廉，20个菌种包括链球菌也能保存至少24个月，且无变异现象产生[4]。而脑炎奈瑟氏菌在以上4中保存方法中存活率的很低，这可能是因为陈旧培养物中细菌自身所产生的有害代谢产物过多，使其在保存过程中容易死亡，因此，在以后的工作中需要继续摸索和寻找脑炎奈瑟氏菌保存的简便和有效的方法。总之，除半固体保存法外，其余三种方法均适用于微生物学教学和科研常用菌种的保存。
参考文献：
[1] 吴茂红，吴时耕. 菌种的保存方法介绍[J]. 江西医学检验，2004，22（6）：545
[2] 王娅，金志雄，裴德翠，等. 几种简易的菌种保存方法[J].青岛医药卫生，2009，41（6）：451-452
[3] 车萍，张颖颖，田洪波. 形态学实验室菌种保存的实验方法改革[J]. 现代医药卫生，2013，29（6）：912
[4] 钟志宏，李启星，唐小异，等. 甘油保存菌种方法的改良[J]. 实用预防医学，2005，12（3）：670-671
关键词：半固体；甘油；脱脂牛奶；微孔珠；菌种保存
基金项目：湖南省“十二五”综合改革试点项目，湖南省教育厅教改项目（编号： 2010516）
微生物学实验教学中，典型的菌种是实验教学能否成功开展和达到满意的教学效果的关键因素。菌种因受到外界环境及自身代谢的影响，长期在培养基上移种和传代后，其形态、菌落、毒力均易发生变异，而成为不典型的菌株甚至死亡[1]。因而菌种保存工作在微生物学实验教学工作中变得尤为重要。我们通过反复实验试图寻求既操作简便又可保持菌种的存活率，降低菌种的变异率，适用于医学微生物学实验室的菌种保存方法。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， 25922）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis， 26104）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus， 27101）、甲型溶血性链球菌（α-hemolytic streptococcus， 32212）、乙型溶血性链球菌（β-hemolytic strepto-coccus， 32210-4a）、肺炎链球菌（S.pneumoniae，31002-16）、脑膜炎奈瑟菌（N. meningitides， 29019）、大肠埃希菌（Escherichia coli， 44101）、肺炎克雷伯菌（K.peumoniae）产气肠杆菌（E. aerogenes， 45103）、变形杆菌（P. mirabilis， 49006）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi， 50402）、甲型副伤寒沙门氏菌（S.paratyphi A， 50001）、乙型副伤寒沙门氏菌（S. paratyphi B，50602）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae 51252-8）、福氏志贺菌（S. flexneri， 51573）、宋内志贺菌（S. sonnei，51334-21）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa， 10102）、蜡样芽胞杆菌（B.cereus， 63301）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis，63501）、白色念珠菌（C. albicans）。以上菌种中，肺炎克雷伯菌、白色念珠菌由湖南医药学院附属一医院分离，甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌购自北京生物制品检定所，其余均购自湖南省疾控中心。
1.1.2培养基
半固体培养基、营养肉汤、血清肉汤、脱脂牛奶培养基、普通营养琼脂、血琼脂培养基、巧克力琼脂、沙氏琼脂，培养基均用常规方法配制、灭菌。
1.1.3微孔珠保存管
甘油（分析纯）分装于玻璃试管中经121.3℃灭菌30min。保存管为购自珠海贝索生物技术有限公司，主要组成是冷冻保存管内有微孔珠（10粒）、培养基（胰蛋白胨、NaCl、甘油）。
1.2方法
1.2.1菌种的纯化
甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌在血琼脂培养基纯化；脑膜炎奈瑟菌在巧克力琼脂上纯化；白色念珠菌在沙氏琼脂纯化；其余菌种在普通营养琼脂上纯化。
1.2.2甘油保存法
纯化后，挑取甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌于血清肉汤培養基中，置普通培养箱37℃培养12～18h；挑取脑膜炎奈瑟菌于血清肉汤培养基中，5%～10%CO2环境37℃培养12～18h；其余菌种分别接种于营养肉汤培养基中，置普通培养箱37℃培养12～18h。将以上培养物与等量的已灭菌的甘油充分混匀后，分装于微量无菌离心管或细胞冻存管中，每个菌种均分装20支，并分成2组。置-20℃保存。
1.2.3脱脂牛奶保存法
将灭菌脱脂牛奶培养基分装于无菌的微量离心管或细胞冻存管中，挑取纯化后的菌种（菌落尽量多）于分装好的牛奶培养基中，每个菌种均分装20支，并分成2组。充分混匀后置-20℃保存。
1.2.4半固体保存法
挑取纯化后甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌接种于血清半固体培养基中，其余菌种分别接种于半固体培养基中，每个菌种均接种20支，并分成2组。置普通培养箱37℃培养12～18h后加一层1cm厚的无菌液体石蜡，置4℃冰箱保存。
1.2.5微孔珠保存法
3.讨论
菌种是微生物实验室中不可缺少实验标本，为了保证实验教学的需要，对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节。真空冷冻干燥保存法是目前菌种保存最有效的方法之一，但是此方法操作过程繁琐，且需要专用的设备（冷冻真空干燥机），成本较高，普通微生物学实验室难以实现。因此，我们需要既有效，又方便、经济适用的菌种保存方法用于微生物学实验教学。我们近2年来用甘油、脱脂牛奶、半固体、微孔珠对21种菌株分别进行保存试验的比较，结果表明，半固体保存法虽然操作简单，菌种复苏方便，但不适用于对营养要求特殊的链球菌和奈瑟氏菌等菌株，且菌种需3～6个月转种一次，菌种在多次传代转种过程中易发生变异。甘油、脱脂牛奶、微孔珠保存法相对来说操作简单、运行成本低廉，20个菌种包括链球菌也能保存至少24个月，且无变异现象产生[4]。而脑炎奈瑟氏菌在以上4中保存方法中存活率的很低，这可能是因为陈旧培养物中细菌自身所产生的有害代谢产物过多，使其在保存过程中容易死亡，因此，在以后的工作中需要继续摸索和寻找脑炎奈瑟氏菌保存的简便和有效的方法。总之，除半固体保存法外，其余三种方法均适用于微生物学教学和科研常用菌种的保存。
参考文献：
[1] 吴茂红，吴时耕. 菌种的保存方法介绍[J]. 江西医学检验，2004，22（6）：545
[2] 王娅，金志雄，裴德翠，等. 几种简易的菌种保存方法[J].青岛医药卫生，2009，41（6）：451-452
[3] 车萍，张颖颖，田洪波. 形态学实验室菌种保存的实验方法改革[J]. 现代医药卫生，2013，29（6）：912
[4] 钟志宏，李启星，唐小异，等. 甘油保存菌种方法的改良[J]. 实用预防医学，2005，12（3）：670-671