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【摘要】目的：为了了解紫外线照射对对体外培养人正常黑素细胞雌激素受体的影响。方法：采用MTT法测定UVR照射后黑素细胞增殖情况，Nakajima M方法测定酪氨酸酶活性，PSA免疫组织化学方法和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞雌激素受体基因mRNA表达。结果：UVA照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,高剂量时无明显变化，酪氨酸酶活性在低照射剂量时升高,高剂量时随着剂量加大而逐渐下降；UVB照射后黑素细胞数量在低照射剂量时升高,在照射剂量到达某个临界点后随着照射剂量的增加而迅速降低，酪氨酸酶活性在低剂量时增加,在高剂量照射时继续保持高度活性,不随照射剂量增加而变化；UVA和URB照射后黑素细胞ER免疫组化均可产生棕黄色颗粒，主要定位于细胞核; 雌激素受体基因mRNA表达也明显高于对照组。结论：不同剂量和不同类型的紫外线照射对体外培养人正常黑素细胞雌激素受体表达均可产生正性作用。
【关键词】雌激素受体；紫外线；黑素细胞
【中图分类号】R329【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0001-02
雌激素对皮肤不同类型细胞，如表皮角质形成细胞，真皮成纤维细胞以及黑色素细胞都有显著效应,也关系到毛囊，皮脂腺，顶泌汗腺等附属器官的调节功能;同时对皮肤老化，色素形成，毛发生长，皮脂分泌乃至皮肤肿瘤均有显著作用。研究证实 ：雌激素对皮肤细胞的调节功能是通过两种不相同的特殊第二信号传导通路完成的，而这两种不同通路的激活主要依赖于雌激素对其细胞内受体（ERαand ERβ）和其胞膜受体发挥作用。
紫外线（UV）对于人类黑素细胞及黑素合成有着复杂的影响。在影响黑素细胞和黑素生成（包括色素沉着）的因素中，中波紫外线（UVB）、长波紫外线（UVA）以及角质形成细胞三者最关键。UVB影响力相对较大，它在刺激黑素细胞增生及诱导凋亡方面都有强烈的影响，也可促进黑素生成及导致延迟性色沉 （DT）。
为了研究体外培养人黑素细胞对于紫外线照射后黑素细胞雌激素受体的作用影响，我们采用体外培养人类黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB照射，参考Nakajima M多巴比色方法测定酪氨酸酶活性，采用PSA免疫组织化学方法和半定量RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞ER的表达情况，具体内容如下：
1 材料和方法
1.1 主要试剂及材料：试剂：黑色素细胞培养液（美国Cascade公司）；噻唑蓝（MTT，Sigma公司）。TAB250和 PV-9000通用型两步法检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。
雌激素受体基因引物由上海生物工程技术公司合成。C-myc 基因扩增片段192 bp，上游引物为5’-CCCTG-GCAAAAGGTCAGAGTC-3’，下游引物为 5-TCGGTT-GTrGCTGATCTGTC-3’；雌激素受体基因扩增片段 181bp，上游引物为5-GTGTACCTGGACAGCAGCAA-3，下游引物5’TCGGAGACACGC或GAGT-3’。
光源 紫外线治疗仪（上海Sigma公司）。
1.2 正常人黑素细胞的培养及传代［1］:取3-20岁正常人包皮环切标本，生理盐水反复多次冲洗，去除皮下组织，切成3mm×5mm的小条，DispaseⅡ酶4℃消化15hr后，仔细分离表皮和真皮，取表皮剪碎，0.25%胰酶37℃消化20min，终止消化后吹打成单细胞悬液，筛网过滤后离心，以5×106/ml接种于含黑色素细胞培养液的培养瓶中。置入CO2孵箱中37℃培养，24小时后首次换液以去除未贴壁细胞，然后按情况进行换液。原代接近融合时，胰酶消化传代，实验选用2-4代细胞。
1.3 黑色素细胞鉴定［2,3］:收集第二代细胞进行多巴染色鉴定。
1.4 酪氨酸酶活性测定［4］:A将第三代成熟黑素细胞计数、接种于35mm培养皿置于37℃孵箱，待细胞生长至80%融合时，弃上清培养液，每个培养皿中加入PBS lml，分别予以限定剂量的UVB和UvA照射（限定剂量根据MTT法测得的对于黑素细胞增殖影响最大的UV剂量而定），照射后迅速弃去PBS，每个培养皿加入含有添加物的M一254完全培养基3ml，置于37℃5%CO2孵箱中孵育48小时。胰蛋白酶消化并分别收集细胞到15ml离心管中，以胎牛血清中和后，离心并弃去上清液，加入0.1%Trixton-100200ul，用力振荡15min，加入l% L-DOPA，以之定容至lml。将以上溶液充分混匀，加入至96孔板中，每孔100ul，置于37℃5%CO2孵箱孵育30分钟，在室温下于490nm酶标仪上比色，记录OD值进行统计学分析。
1.5 雌激素受体表达试验（PSA免疫组织化学方法）［5］：按上述步骤进行黑素细胞爬片，生长至80%融合时，弃上清培养液，每个培养皿中加入PBS lml，分别予以限定剂量的UVB和UVA照射,后标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋,4um厚连续切片。免疫组化试剂ER由上海长岛生物技术公司提供，染色方法采用S—P法。染色程度判断：阳性细胞数<5%为（-），5%～25%为（+）,26%～50%为（++），>50%为（+++）。
统计分析:全部ER染色结果,用SPSS统计软件包进行统计分析。
1.6 UVR照射后雌激素受体基因mRNA表达检测：半定量 RT—PCR法［6］:按上述步骤进行黑素细胞培养，后分别予以限定剂量的UVB和UVA照射（限定剂量根据MTT法测得的对黑素细胞增殖影响最大的UV剂量而定），后胰酶消化细胞，用Trizol裂解细胞，提取总RNA，逆转录试剂盒将mRNA逆转录为c D NA。半定量RT—PCR法检测雌激素受体基因的mRNA表达，结果以与看家基因GAPDH的灰度比值表示。统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件行t检验及确切概率计算法检验。
2 结果
2.1 形态学结果：体外培养的正常人黑素细胞为树突状细胞,有较多树突,胞体内可见黑素颗粒,细胞增殖良好,连接成网，约7～10 d 传一代 （图1，2）
图1 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
图2 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
2.2 黑素细胞鉴定：Dopa染色可见细胞浆内阳性着色（黑色或灰色）（图3）。
2.3 MTT法測定不同剂量UVB 照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数1×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.3 MTT法测定不同剂量UVA照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数0.75×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.4 多巴比色法测定不同剂量UVA照射后酪氨酸酶的变化（细胞计数1.68×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
多巴比色法测定不同剂量UVB照射后酪氨酸酶的变化（细胞计数1.68×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.5 PSA免疫组织化学方法检测：免疫组化结果示:ER阳性表达主要在黑素细胞的核内,呈棕黄色。
2.6 雌激素受体基因mRNA的表达：照射组的雌激素受体基因mRNA的表达也明显高于对照组（0.58±0.021vs 0.19±0.034,p0.001）。
3 讨论
黑素细胞决定人类肤色及光线性色素沉着的产生。 雌激素受体 （ER）是一核转录因子，有ERa和ERB两亚型。体外培养人正常黑素细胞也表现了一种17β-雌二醇生物学效应，如含有雌二醇的人黑素细胞培养，培养第二天黑素细胞变形且树突增多，说明外源性雌激素在结构或功能上与内源性雌激素很相似，可模拟或干扰内源性雌激素功能，与人体各脏器雌激素受体结合后发挥作用［7］。雌激素与雌激素受体结合才发挥作用。研究表明，影响黑素细胞和黑素生成（包括色素沉着）的因素中，中波紫外线（UVB）、长波紫外线（UVA）以及角质形成细胞三者是最关键的。其中，UVB的影响力相对较大，它在刺激黑素细胞增生及诱导其凋亡方面都有显著影响，可促进黑素生成及能够导致延迟性色沉。
图4 PSA免疫组织化学染色阳性，胞核呈棕黄色（×200）
为了研究体外培养人黑素细胞对紫外线照射后黑素细胞雌激素受体的作用影响，进一步研究中国人黑素细胞对紫外线照射反应，我们采用体外培养人类黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB的照射，然后分别采用MTT法测定照射前后的细胞数量变化;多巴比色法测定酪氨酸酶活性的变化; PSA免疫组织化学方法和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞ER的表达。结果发现:UVA照射后，黑素细胞数量在低照射剂量时升高，高剂量时无明显变化;酪氨酸酶活性在低剂量时升高，高剂量时随着剂量加大而逐渐下降。UVB照射后，黑素细胞数量在低照射剂量时升高，在照射剂量到达某个临界点后随着照射剂量的增加而迅速降低;酪氨酸酶活性在低剂量时增加，在高剂量照射时继续保持高度活性，不随照射剂量增加而变化。以上结果与目前相关研究报道数据基本一致。另外，UVA和UVB照射后黑素细胞ER免疫组化结果表明均可产生棕黄色颗粒，主要定位于细胞核; 雌激素受体基因mRNA表达也明显高于对照组，提示雌激素受体表達确实与紫外线照射作用明显关联。
总之，我们利用体外培养黑素细胞方法，探讨UVA和UVB对于人黑素细胞在细胞数量、酪氨酸酶活性、雌激素受体等方面的影响，进一步明确了UVA和UVB对于黑素细胞增殖的最适剂量，初步了解了酪氨酸酶活性在不同波长、剂量紫外线照射下的变化，加深了雌激素对人体生理和病理状态下色素变化的认识，提高了内分泌系统与皮肤颜色关系的认识。通过本实验，使雌激素对人体皮肤色素形成的作用研究进一步扩大，同时也将会增加它在皮肤病临床应用的前景。
参考文献
［1］张宪旗，郑敏，牟宽厚等.8-甲氧沙林对黑素细胞内游离钙浓度及细胞骨架蛋白形成的影响［J］.浙江大学学报（医学版），2009，38（4）：348-350
［2］ 王伯云，李玉松主编.病理学技术［M］.北京人民卫生出版社。2000：423
［3］ 赵辩，黄秋玲.人正常黑素细胞体外纯培养及其细胞生物学鉴定［J］.临床皮肤科杂志,1991：（5）：226-228
［4］ Boyd MR,Bacon TH,Sutton D. Antiherpesvirus activity of 9-（4-Hydroxy-3-Hydroxymelnylbut-1-yl） guanine （BRL 39123） in animals ［J］.Antimicro Agents Chemother,1988,32:358-363
［5］ 韩静绮，王丰梅，冶俊玲.乳腺癌中的ER、PR、p53 、C— erbB2和 PCNA的表达及临床意义.第四军医大学学报，2008；29： 663
［6］ 尹志华，叶志中，罗秀霞等.系统性红斑狼疮患者 hTERT，c—my c和雌激素受体基因的表达.广东医学，2008，2， 29（2），238-239
［7］ 龚石，赵志国，张晴等.外源性雌激素己烯雌酚对体外培养正常人表皮黑素细胞的作用［J］.中国美容医学，2008，5，17（5）：728-730
【关键词】雌激素受体；紫外线；黑素细胞
【中图分类号】R329【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0001-02
雌激素对皮肤不同类型细胞，如表皮角质形成细胞，真皮成纤维细胞以及黑色素细胞都有显著效应,也关系到毛囊，皮脂腺，顶泌汗腺等附属器官的调节功能;同时对皮肤老化，色素形成，毛发生长，皮脂分泌乃至皮肤肿瘤均有显著作用。研究证实 ：雌激素对皮肤细胞的调节功能是通过两种不相同的特殊第二信号传导通路完成的，而这两种不同通路的激活主要依赖于雌激素对其细胞内受体（ERαand ERβ）和其胞膜受体发挥作用。
紫外线（UV）对于人类黑素细胞及黑素合成有着复杂的影响。在影响黑素细胞和黑素生成（包括色素沉着）的因素中，中波紫外线（UVB）、长波紫外线（UVA）以及角质形成细胞三者最关键。UVB影响力相对较大，它在刺激黑素细胞增生及诱导凋亡方面都有强烈的影响，也可促进黑素生成及导致延迟性色沉 （DT）。
为了研究体外培养人黑素细胞对于紫外线照射后黑素细胞雌激素受体的作用影响，我们采用体外培养人类黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB照射，参考Nakajima M多巴比色方法测定酪氨酸酶活性，采用PSA免疫组织化学方法和半定量RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞ER的表达情况，具体内容如下：
1 材料和方法
1.1 主要试剂及材料：试剂：黑色素细胞培养液（美国Cascade公司）；噻唑蓝（MTT，Sigma公司）。TAB250和 PV-9000通用型两步法检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。
雌激素受体基因引物由上海生物工程技术公司合成。C-myc 基因扩增片段192 bp，上游引物为5’-CCCTG-GCAAAAGGTCAGAGTC-3’，下游引物为 5-TCGGTT-GTrGCTGATCTGTC-3’；雌激素受体基因扩增片段 181bp，上游引物为5-GTGTACCTGGACAGCAGCAA-3，下游引物5’TCGGAGACACGC或GAGT-3’。
光源 紫外线治疗仪（上海Sigma公司）。
1.2 正常人黑素细胞的培养及传代［1］:取3-20岁正常人包皮环切标本，生理盐水反复多次冲洗，去除皮下组织，切成3mm×5mm的小条，DispaseⅡ酶4℃消化15hr后，仔细分离表皮和真皮，取表皮剪碎，0.25%胰酶37℃消化20min，终止消化后吹打成单细胞悬液，筛网过滤后离心，以5×106/ml接种于含黑色素细胞培养液的培养瓶中。置入CO2孵箱中37℃培养，24小时后首次换液以去除未贴壁细胞，然后按情况进行换液。原代接近融合时，胰酶消化传代，实验选用2-4代细胞。
1.3 黑色素细胞鉴定［2,3］:收集第二代细胞进行多巴染色鉴定。
1.4 酪氨酸酶活性测定［4］:A将第三代成熟黑素细胞计数、接种于35mm培养皿置于37℃孵箱，待细胞生长至80%融合时，弃上清培养液，每个培养皿中加入PBS lml，分别予以限定剂量的UVB和UvA照射（限定剂量根据MTT法测得的对于黑素细胞增殖影响最大的UV剂量而定），照射后迅速弃去PBS，每个培养皿加入含有添加物的M一254完全培养基3ml，置于37℃5%CO2孵箱中孵育48小时。胰蛋白酶消化并分别收集细胞到15ml离心管中，以胎牛血清中和后，离心并弃去上清液，加入0.1%Trixton-100200ul，用力振荡15min，加入l% L-DOPA，以之定容至lml。将以上溶液充分混匀，加入至96孔板中，每孔100ul，置于37℃5%CO2孵箱孵育30分钟，在室温下于490nm酶标仪上比色，记录OD值进行统计学分析。
1.5 雌激素受体表达试验（PSA免疫组织化学方法）［5］：按上述步骤进行黑素细胞爬片，生长至80%融合时，弃上清培养液，每个培养皿中加入PBS lml，分别予以限定剂量的UVB和UVA照射,后标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋,4um厚连续切片。免疫组化试剂ER由上海长岛生物技术公司提供，染色方法采用S—P法。染色程度判断：阳性细胞数<5%为（-），5%～25%为（+）,26%～50%为（++），>50%为（+++）。
统计分析:全部ER染色结果,用SPSS统计软件包进行统计分析。
1.6 UVR照射后雌激素受体基因mRNA表达检测：半定量 RT—PCR法［6］:按上述步骤进行黑素细胞培养，后分别予以限定剂量的UVB和UVA照射（限定剂量根据MTT法测得的对黑素细胞增殖影响最大的UV剂量而定），后胰酶消化细胞，用Trizol裂解细胞，提取总RNA，逆转录试剂盒将mRNA逆转录为c D NA。半定量RT—PCR法检测雌激素受体基因的mRNA表达，结果以与看家基因GAPDH的灰度比值表示。统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件行t检验及确切概率计算法检验。
2 结果
2.1 形态学结果：体外培养的正常人黑素细胞为树突状细胞,有较多树突,胞体内可见黑素颗粒,细胞增殖良好,连接成网，约7～10 d 传一代 （图1，2）
图1 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
图2 传代培养的第2代正常人黑素细胞（×200）。
2.2 黑素细胞鉴定：Dopa染色可见细胞浆内阳性着色（黑色或灰色）（图3）。
2.3 MTT法測定不同剂量UVB 照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数1×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.3 MTT法测定不同剂量UVA照射后黑素细胞数量的变化（细胞计数0.75×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.4 多巴比色法测定不同剂量UVA照射后酪氨酸酶的变化（细胞计数1.68×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
多巴比色法测定不同剂量UVB照射后酪氨酸酶的变化（细胞计数1.68×104/ml）
注：*表示 P<0.05，与对照相比有显著性差异。
2.5 PSA免疫组织化学方法检测：免疫组化结果示:ER阳性表达主要在黑素细胞的核内,呈棕黄色。
2.6 雌激素受体基因mRNA的表达：照射组的雌激素受体基因mRNA的表达也明显高于对照组（0.58±0.021vs 0.19±0.034,p0.001）。
3 讨论
黑素细胞决定人类肤色及光线性色素沉着的产生。 雌激素受体 （ER）是一核转录因子，有ERa和ERB两亚型。体外培养人正常黑素细胞也表现了一种17β-雌二醇生物学效应，如含有雌二醇的人黑素细胞培养，培养第二天黑素细胞变形且树突增多，说明外源性雌激素在结构或功能上与内源性雌激素很相似，可模拟或干扰内源性雌激素功能，与人体各脏器雌激素受体结合后发挥作用［7］。雌激素与雌激素受体结合才发挥作用。研究表明，影响黑素细胞和黑素生成（包括色素沉着）的因素中，中波紫外线（UVB）、长波紫外线（UVA）以及角质形成细胞三者是最关键的。其中，UVB的影响力相对较大，它在刺激黑素细胞增生及诱导其凋亡方面都有显著影响，可促进黑素生成及能够导致延迟性色沉。
图4 PSA免疫组织化学染色阳性，胞核呈棕黄色（×200）
为了研究体外培养人黑素细胞对紫外线照射后黑素细胞雌激素受体的作用影响，进一步研究中国人黑素细胞对紫外线照射反应，我们采用体外培养人类黑素细胞作为研究对象，对其进行UVA和UVB的照射，然后分别采用MTT法测定照射前后的细胞数量变化;多巴比色法测定酪氨酸酶活性的变化; PSA免疫组织化学方法和半定量 RT—PCR法检测UVR照射后黑素细胞ER的表达。结果发现:UVA照射后，黑素细胞数量在低照射剂量时升高，高剂量时无明显变化;酪氨酸酶活性在低剂量时升高，高剂量时随着剂量加大而逐渐下降。UVB照射后，黑素细胞数量在低照射剂量时升高，在照射剂量到达某个临界点后随着照射剂量的增加而迅速降低;酪氨酸酶活性在低剂量时增加，在高剂量照射时继续保持高度活性，不随照射剂量增加而变化。以上结果与目前相关研究报道数据基本一致。另外，UVA和UVB照射后黑素细胞ER免疫组化结果表明均可产生棕黄色颗粒，主要定位于细胞核; 雌激素受体基因mRNA表达也明显高于对照组，提示雌激素受体表達确实与紫外线照射作用明显关联。
总之，我们利用体外培养黑素细胞方法，探讨UVA和UVB对于人黑素细胞在细胞数量、酪氨酸酶活性、雌激素受体等方面的影响，进一步明确了UVA和UVB对于黑素细胞增殖的最适剂量，初步了解了酪氨酸酶活性在不同波长、剂量紫外线照射下的变化，加深了雌激素对人体生理和病理状态下色素变化的认识，提高了内分泌系统与皮肤颜色关系的认识。通过本实验，使雌激素对人体皮肤色素形成的作用研究进一步扩大，同时也将会增加它在皮肤病临床应用的前景。
参考文献
［1］张宪旗，郑敏，牟宽厚等.8-甲氧沙林对黑素细胞内游离钙浓度及细胞骨架蛋白形成的影响［J］.浙江大学学报（医学版），2009，38（4）：348-350
［2］ 王伯云，李玉松主编.病理学技术［M］.北京人民卫生出版社。2000：423
［3］ 赵辩，黄秋玲.人正常黑素细胞体外纯培养及其细胞生物学鉴定［J］.临床皮肤科杂志,1991：（5）：226-228
［4］ Boyd MR,Bacon TH,Sutton D. Antiherpesvirus activity of 9-（4-Hydroxy-3-Hydroxymelnylbut-1-yl） guanine （BRL 39123） in animals ［J］.Antimicro Agents Chemother,1988,32:358-363
［5］ 韩静绮，王丰梅，冶俊玲.乳腺癌中的ER、PR、p53 、C— erbB2和 PCNA的表达及临床意义.第四军医大学学报，2008；29： 663
［6］ 尹志华，叶志中，罗秀霞等.系统性红斑狼疮患者 hTERT，c—my c和雌激素受体基因的表达.广东医学，2008，2， 29（2），238-239
［7］ 龚石，赵志国，张晴等.外源性雌激素己烯雌酚对体外培养正常人表皮黑素细胞的作用［J］.中国美容医学，2008，5，17（5）：728-730