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摘要：目的 ：探讨椎间盘突出患者椎间盘蛋白质组学差异。方法： 收集正常人腰椎间盘和4组不同退变程度腰椎间盘进行提取、培养，比较正常人腰椎间盘和退变人腰椎间盘髓核细胞和纤维环细胞蛋白质种类差异和不同退变程度腰椎间盘与正常人之间蛋白含量差异。结果 ：正常人和退变人腰椎间盘蛋白质种类有显著差异，蛋白质含量也随着退变严重程度逐渐降低。结论： 根据腰椎间盘不同蛋白质种类和含量可为腰椎间盘退行性疾病的诊断、治疗以及发病机制提供理论依据。
关键词：退变人;腰椎间盘;蛋白质
基金项目：广州市花都区2012年科技计划项目<<正常与退变人椎间盘的蛋白质组学差异比较>>（12-HDWS-013）
分子和蛋白质水平为近年研究腰椎间盘退变性疾病（disc degeneration disease， DDD）的热点[1]，为此笔者通过比较分析DDD发生过程中的差异蛋白表达谱以及特异标志蛋白，旨在为DDD的诊断、治疗以及发病机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料收集
根据腰椎间盘退变评分方[2]法将腰椎间盘退变分为4级，每个级别收集6例腰椎间盘进行实验，正常腰椎间盘作为对照组。退变腰椎间盘取自腰椎间盘突出行手术减压患者，正常腰椎间盘取自脊柱侧凸行矫形手术患者。腰椎间盘组织用生理盐水冲洗至无明显血迹后，清晰的分离出髓核组织、纤维环组织，置于-80度冰箱冷冻储藏，待收集足量的样本后进行蛋白质组学差异鉴定。取各个级别腰椎间盘组织，分离髓核与纤维环，进行髓核细胞与纤维环细胞的培养，取第一代细胞进行蛋白质组学实验。
1.2 纤维环和髓核蛋白质提取和鉴定
采用常规方法对腰椎间盘纤维环细胞、髓核细胞、纤维环组织、髓核组织的蛋白进行提取，双向凝胶电泳分离蛋白、银染，PD-Quest图像分析，选择、切取蛋白点原位酶解得到肽混合物，经过LCQ-MS-MS分析得到肽质纹谱，肽序列标签。使用Typhoon扫描仪，分别采用3种不同的波长488 nm（Cy2）、532 nm（Cy3）、633 nm（Cy5）进行扫描，获得图谱。用DeCyder 5.0分析软件（GE公司）分析结果，得到平均比值>1.2的差异点。电泳完毕，将凝胶用考马斯亮兰染色后，切下蛋白差异点用胰酶进行胶内酶解20 h，抽提酶解肽段，经ZipTip脱盐后，进行MALDI2TOF/TOF质谱，软件分析数据，鉴定蛋白质。
1.3 总蛋白提取
5组腰椎间盘各取2g腰椎间盘放入一研钵中，研钵置于冰上低温操作，先用剪刀将腰椎间盘剪成lmm×1mm×1mm大小的碎块，然后液氮冰浴下研磨至粉碎，将粉碎的组织全部转移至5.0mL Eppendorf管，按1g骨组织加入2.5～3.0mL裂解液的比例加入样品裂解液，冰浴下振荡60min（注意保持低温以防止蛋白质变性）。20，000g/min，4℃离心60 min，取少量上清进行蛋白浓度定量检测，其余上清液分装冻存于-80℃备用。采用改良Bradford法进行蛋白定量测定。
1.4 观察指标
检测统计正常人和退变人腰椎间盘蛋白总类及含量。
1.5 统计学方法
本研究采用SPSS18.0软件包对所得的数据进行统计学分析，计量资料采用表示，组间比较采用t检验，计数资料采用率表示，χ2检验，检验标准α=0.05，P< α则具有统计学意义。
2 结果
2.1 正常和退变人纤维环和髓核蛋白质差异
正常人腰椎间盘纤维环和髓核蛋白质以Ⅱ型胶原蛋白为主，占胶原蛋白绝大部分，另含有弹性蛋白、基质金属蛋白酶、纤维粘蛋白及少量其它蛋白;退变人腰椎间盘纤维环和髓核蛋白种类发生发生了显著变化，研究发现胶原蛋白和蛋白多糖被大量分解破坏，含量明显减少，另发现其它种类蛋白质表达增多，还发现有腰椎间盘不曾含有的蛋白质。电泳蛋白图谱见图1、2。
图1 正常腰腰椎间盘髓核蛋白质双相凝胶电泳图谱
2.2 正常人和退变人腰椎间盘蛋白含量差别
正常人腰椎间盘总蛋白含量明显高于退变人腰椎间盘总蛋白含量，且随着退变程度加重蛋白含量逐渐下降。正常人腰椎间盘胶原蛋白、弹性蛋白、基质金属蛋白酶、纤维粘蛋白和总蛋白量明显高于退变，比较有统计学意义（P<0.05），正常人腰椎间盘其它蛋白含量低于退变人，比较有统计学意义（P<0.05）。详见表1。
表1 正常人和退变人腰椎间盘蛋白组学比较（ ）
3 讨论
腰椎间盘主要由髓核和纤维环组成，含有水、胶原蛋白、非胶原蛋白级蛋白多糖，在正常腰椎间盘中非胶原蛋白含量较少，多数为胶原蛋白[3-4]。近年来国内外对退变腰椎间盘蛋白质组学研究日益增加，主要研究报告集中在大分子蛋白质，如弹性蛋白和蛋白多糖[5-7]。蛋白多糖为负电荷，对水具有较强的亲和力，可良好维持髓核中水份，蛋白多糖水化后填充在胶原纤维中，并压缩分子体积，使髓核具有弹性和膨胀性，可负荷外了作用[8]。腰椎间盘退变后，蛋白多糖分子改变，研究表明退变髓核中几乎不含多具体多糖蛋白[9-10]。另有研究证实退变腰椎间盘组织可产生白介素、金属蛋白酶级肿瘤坏死因子，可改变正常蛋白质性质可降低蛋白含量[11]。
本次研究通过提取正常和退变蛋白进行电泳、染色等处理，发现正常腰椎间盘纤维环和髓核中以胶原蛋白为主，而在退变腰椎间盘中蛋白含量有显著改变，出现多种异常蛋白质，而胶原蛋白含量明显降低;通过提取正常腰椎间盘和退变腰椎间盘蛋白测量总蛋白含量，发现正常腰椎间盘中蛋白含量明显高于退变腰椎间盘蛋白含量，且随着退变程度加重总蛋白含量逐渐降低。
4 结论
本研究通过提取正常和退变人纤维环组织、髓核组织的蛋白，并应用蛋白质组学技术寻找出两者的差异蛋白， 同时应用酶联免疫吸附试验对差异蛋白表达作进一步验证。从蛋白质水平上，通过比较分析正常腰椎间盘与不同程度腰椎间盘退行性疾病中的差异蛋白表达谱以及特异标志蛋白，为腰椎间盘退行性疾病的诊断、治疗以及发病机制提供理论依据。预期可证实某差异蛋白能作为腰椎间盘退行性疾病的生物学标志物并成为该疾病靶向治疗的新位点。
参考文献：
[1] 胡宝山，许喜筠，郭元利等.关于腰椎间盘退变过程中基质金属蛋白酶-13的来源[J].中国老年学杂志，2014，（17）：4894-4896.
[2] 张兴凯，曹鹏，王君等.多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（28）：5136-5140.
[3] 王亚平，邓幼文.Biglycan和细胞因子在小牛椎间盘组织中的信息编码[J].中南大学学报（医学版），2011，（9）：889-894.
[4] 任山，刘世恩，王淑春等.腺相关病毒介导的成骨蛋白-1和性别决定区Y框蛋白9双基因联合转染兔退变椎间盘的生物学效应[J].中华实验外科杂志，2013，30（10）：2152-2154.
[5] 刘勇君，刘世恩，王淑春等.腺相关病毒介导骨形态发生蛋白-7和性别决定区Y框蛋白9双基因共转染兔退变椎间盘的生物学效应[J].中华实验外科杂志，2013，30（5）：1023.
[6] 邓绍强，杜勇，杨汉丰等.弥散加权ADC值定量评价髓核蛋白多糖含量的研究[J].中国临床医学影像杂志，2013，24（9）：650-653.
[7] 卜国云.神经导向蛋白Netrin-1在腰椎间盘退变性疾病中的表达及意义[D].南开大学，2012.
[8] 宁斌，刘海飞，龚维明等.成人退变髓核细胞微载体旋转立体培养对细胞外基质合成的影响[J].中华外科杂志，2013，51（5）：432-436.
[9] 刘晓冬，刘际红，王传生等.Bcl-2蛋白表达与人类不同年龄段椎间盘组织细胞凋亡的相关性研究[J].河北医学，2011，17（3）：285-287.
[10] 林曦，叶君健.骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ，Ⅱ型胶原的影响[J].中国组织工程研究，2013，（43）：7501-7506.
[11] 李想，王以朋，邱贵兴等.软骨调节素在成人退变椎间盘中的表达[J].中华外科杂志，2011，49（7）：631-635.
关键词：退变人;腰椎间盘;蛋白质
基金项目：广州市花都区2012年科技计划项目<<正常与退变人椎间盘的蛋白质组学差异比较>>（12-HDWS-013）
分子和蛋白质水平为近年研究腰椎间盘退变性疾病（disc degeneration disease， DDD）的热点[1]，为此笔者通过比较分析DDD发生过程中的差异蛋白表达谱以及特异标志蛋白，旨在为DDD的诊断、治疗以及发病机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料收集
根据腰椎间盘退变评分方[2]法将腰椎间盘退变分为4级，每个级别收集6例腰椎间盘进行实验，正常腰椎间盘作为对照组。退变腰椎间盘取自腰椎间盘突出行手术减压患者，正常腰椎间盘取自脊柱侧凸行矫形手术患者。腰椎间盘组织用生理盐水冲洗至无明显血迹后，清晰的分离出髓核组织、纤维环组织，置于-80度冰箱冷冻储藏，待收集足量的样本后进行蛋白质组学差异鉴定。取各个级别腰椎间盘组织，分离髓核与纤维环，进行髓核细胞与纤维环细胞的培养，取第一代细胞进行蛋白质组学实验。
1.2 纤维环和髓核蛋白质提取和鉴定
采用常规方法对腰椎间盘纤维环细胞、髓核细胞、纤维环组织、髓核组织的蛋白进行提取，双向凝胶电泳分离蛋白、银染，PD-Quest图像分析，选择、切取蛋白点原位酶解得到肽混合物，经过LCQ-MS-MS分析得到肽质纹谱，肽序列标签。使用Typhoon扫描仪，分别采用3种不同的波长488 nm（Cy2）、532 nm（Cy3）、633 nm（Cy5）进行扫描，获得图谱。用DeCyder 5.0分析软件（GE公司）分析结果，得到平均比值>1.2的差异点。电泳完毕，将凝胶用考马斯亮兰染色后，切下蛋白差异点用胰酶进行胶内酶解20 h，抽提酶解肽段，经ZipTip脱盐后，进行MALDI2TOF/TOF质谱，软件分析数据，鉴定蛋白质。
1.3 总蛋白提取
5组腰椎间盘各取2g腰椎间盘放入一研钵中，研钵置于冰上低温操作，先用剪刀将腰椎间盘剪成lmm×1mm×1mm大小的碎块，然后液氮冰浴下研磨至粉碎，将粉碎的组织全部转移至5.0mL Eppendorf管，按1g骨组织加入2.5～3.0mL裂解液的比例加入样品裂解液，冰浴下振荡60min（注意保持低温以防止蛋白质变性）。20，000g/min，4℃离心60 min，取少量上清进行蛋白浓度定量检测，其余上清液分装冻存于-80℃备用。采用改良Bradford法进行蛋白定量测定。
1.4 观察指标
检测统计正常人和退变人腰椎间盘蛋白总类及含量。
1.5 统计学方法
本研究采用SPSS18.0软件包对所得的数据进行统计学分析，计量资料采用表示，组间比较采用t检验，计数资料采用率表示，χ2检验，检验标准α=0.05，P< α则具有统计学意义。
2 结果
2.1 正常和退变人纤维环和髓核蛋白质差异
正常人腰椎间盘纤维环和髓核蛋白质以Ⅱ型胶原蛋白为主，占胶原蛋白绝大部分，另含有弹性蛋白、基质金属蛋白酶、纤维粘蛋白及少量其它蛋白;退变人腰椎间盘纤维环和髓核蛋白种类发生发生了显著变化，研究发现胶原蛋白和蛋白多糖被大量分解破坏，含量明显减少，另发现其它种类蛋白质表达增多，还发现有腰椎间盘不曾含有的蛋白质。电泳蛋白图谱见图1、2。
图1 正常腰腰椎间盘髓核蛋白质双相凝胶电泳图谱
2.2 正常人和退变人腰椎间盘蛋白含量差别
正常人腰椎间盘总蛋白含量明显高于退变人腰椎间盘总蛋白含量，且随着退变程度加重蛋白含量逐渐下降。正常人腰椎间盘胶原蛋白、弹性蛋白、基质金属蛋白酶、纤维粘蛋白和总蛋白量明显高于退变，比较有统计学意义（P<0.05），正常人腰椎间盘其它蛋白含量低于退变人，比较有统计学意义（P<0.05）。详见表1。
表1 正常人和退变人腰椎间盘蛋白组学比较（ ）
3 讨论
腰椎间盘主要由髓核和纤维环组成，含有水、胶原蛋白、非胶原蛋白级蛋白多糖，在正常腰椎间盘中非胶原蛋白含量较少，多数为胶原蛋白[3-4]。近年来国内外对退变腰椎间盘蛋白质组学研究日益增加，主要研究报告集中在大分子蛋白质，如弹性蛋白和蛋白多糖[5-7]。蛋白多糖为负电荷，对水具有较强的亲和力，可良好维持髓核中水份，蛋白多糖水化后填充在胶原纤维中，并压缩分子体积，使髓核具有弹性和膨胀性，可负荷外了作用[8]。腰椎间盘退变后，蛋白多糖分子改变，研究表明退变髓核中几乎不含多具体多糖蛋白[9-10]。另有研究证实退变腰椎间盘组织可产生白介素、金属蛋白酶级肿瘤坏死因子，可改变正常蛋白质性质可降低蛋白含量[11]。
本次研究通过提取正常和退变蛋白进行电泳、染色等处理，发现正常腰椎间盘纤维环和髓核中以胶原蛋白为主，而在退变腰椎间盘中蛋白含量有显著改变，出现多种异常蛋白质，而胶原蛋白含量明显降低;通过提取正常腰椎间盘和退变腰椎间盘蛋白测量总蛋白含量，发现正常腰椎间盘中蛋白含量明显高于退变腰椎间盘蛋白含量，且随着退变程度加重总蛋白含量逐渐降低。
4 结论
本研究通过提取正常和退变人纤维环组织、髓核组织的蛋白，并应用蛋白质组学技术寻找出两者的差异蛋白， 同时应用酶联免疫吸附试验对差异蛋白表达作进一步验证。从蛋白质水平上，通过比较分析正常腰椎间盘与不同程度腰椎间盘退行性疾病中的差异蛋白表达谱以及特异标志蛋白，为腰椎间盘退行性疾病的诊断、治疗以及发病机制提供理论依据。预期可证实某差异蛋白能作为腰椎间盘退行性疾病的生物学标志物并成为该疾病靶向治疗的新位点。
参考文献：
[1] 胡宝山，许喜筠，郭元利等.关于腰椎间盘退变过程中基质金属蛋白酶-13的来源[J].中国老年学杂志，2014，（17）：4894-4896.
[2] 张兴凯，曹鹏，王君等.多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（28）：5136-5140.
[3] 王亚平，邓幼文.Biglycan和细胞因子在小牛椎间盘组织中的信息编码[J].中南大学学报（医学版），2011，（9）：889-894.
[4] 任山，刘世恩，王淑春等.腺相关病毒介导的成骨蛋白-1和性别决定区Y框蛋白9双基因联合转染兔退变椎间盘的生物学效应[J].中华实验外科杂志，2013，30（10）：2152-2154.
[5] 刘勇君，刘世恩，王淑春等.腺相关病毒介导骨形态发生蛋白-7和性别决定区Y框蛋白9双基因共转染兔退变椎间盘的生物学效应[J].中华实验外科杂志，2013，30（5）：1023.
[6] 邓绍强，杜勇，杨汉丰等.弥散加权ADC值定量评价髓核蛋白多糖含量的研究[J].中国临床医学影像杂志，2013，24（9）：650-653.
[7] 卜国云.神经导向蛋白Netrin-1在腰椎间盘退变性疾病中的表达及意义[D].南开大学，2012.
[8] 宁斌，刘海飞，龚维明等.成人退变髓核细胞微载体旋转立体培养对细胞外基质合成的影响[J].中华外科杂志，2013，51（5）：432-436.
[9] 刘晓冬，刘际红，王传生等.Bcl-2蛋白表达与人类不同年龄段椎间盘组织细胞凋亡的相关性研究[J].河北医学，2011，17（3）：285-287.
[10] 林曦，叶君健.骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ，Ⅱ型胶原的影响[J].中国组织工程研究，2013，（43）：7501-7506.
[11] 李想，王以朋，邱贵兴等.软骨调节素在成人退变椎间盘中的表达[J].中华外科杂志，2011，49（7）：631-635.