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摘要 为探讨农用酵素处理对提高葡萄耐铝性的作用及相关机制，以2个砧木品种“贝达”和“通化-3”葡萄为材料，采用管道无土栽培的方法研究铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化产物及耐铝毒相关基因表达的影响。结果表明，农用酵素处理后，葡萄的SOD活性与POD活性、氧自由基产生速率以及MATE相对表达量低于胁迫处理前1 d;H2O2含量、丙二醛含量以及STOP1相对表达量低于铝胁迫处理14 d，根系活力高于铝胁迫处理14 d。农用酵素处理后葡萄膜脂过氧化系统的受害程度和耐铝毒相关基因表达量均下降，可见农用酵素在缓解铝毒对葡萄的伤害方面起着重要作用，能够有效提高葡萄的耐铝性。
关键词 农用酵素;葡萄;铝胁迫;膜脂过氧化系統;耐铝毒基因;表达量
中图分类号 S663.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）17-0015-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.004
Abstract In order to explore the effect of agricultural enzyme treatment on improving aluminum tolerance of grape and its related mechanism， two rootstock varieties ‘Beta’ and ‘Tonghua-3’ grape were used as materials，the effects of agricultural enzymes on the expression of membrane lipid peroxidation products and aluminum tolerance related genes in grape under aluminum stress were studied by means of pipe soilless cultivation. The results showed that the activity of SOD and POD， the production rate of oxygen free radicals and the relative expression of MATE in grape after agricultural enzyme treatment were lower than those one day before stress treatment， the contents of hydrogen peroxide， malondialdehyde and the relative expression of STOP1 were lower than those of aluminum stress for 14 days，the root activity was higher than that of aluminum stress for 14 days. The damage degree of grape membrane lipid peroxidation system and the expression of genes related to aluminum tolerance decreased after agricultural enzyme treatment， which showed that agricultural enzyme played an important role in alleviating the damage of aluminum toxicity to grapes and could effectively improve the aluminum tolerance of grapes.
Key words Agricultural enzyme;Grape;Aluminum stress;Membrane lipid peroxidation system;Aluminum tolerance gene;Expression quantity
在土壤呈非酸性时，植物不会因为铝产生毒害现象，但当土壤呈酸性时，大量铝溶于土壤溶液而形成对植物具有毒害作用的Al3+，植物根系的发育被抑制，从而影响根系吸收水分和养分[1]，因此在酸性土壤中，制约植物产量最关键的是铝毒[2]。葡萄（Vitis spp.）原产中亚，其营养价值高，具有抗癌、抗衰老等作用[3]。我国南方酸性土壤上种植的葡萄极易受铝毒害，葡萄生长危害严重，其超氧化物歧化酶（SOD）活性与过氧化物酶（POD）活性加强，根系活力降低等，使其浆果产量和品种大幅度下降[4]。
泰国的Rosukun利用有机固体废物发酵获得了一种溶液形式的产品，称为酵素（enzyme）[5]。酵素富含有机酸、有益微生物以及SOD等生物催化酶，因此具有抑制病原菌和生物催化的双重作用[6]。研究表明，农用酵素能长期分泌抗生物质，也能长期分泌天然植物生长调节剂[7]。亦有研究表明，农用酵素能够使植物体内与抗逆性相关的关键生理生化指标大幅度提高[8]。此外，农用酵素抗氧化活性物质丰富[9]，具备较强清除超氧自由基等的能力[10]。在逆境胁迫下，活性氧产生和清除是不均衡，引发植物细胞损伤，而农用酵素保护细胞免受损伤，提高其抗氧化能力[11]。
近年来，农用酵素在提高农作物抗氧化能力方面的研究成为热点，但农用酵素对铝胁迫下葡萄膜脂过氧化系统及耐铝毒相关基因表达的影响鲜见报道。我国南方土壤由于遭受农业和工业过程的影响，其酸化程度日益加剧，铝毒对葡萄的伤害日趋严重。通过利用农用酵素处理来提高葡萄的耐铝性为酸性土壤地区解决葡萄生产中的铝毒问题提供一条行之有效的途径。为此，该研究采用无土栽培的方法，先进行铝胁迫处理14 d后，再用稀释100倍的农用酵素处理铝胁迫下的葡萄，然后测定葡萄抗氧化系统的相关生理指标及耐铝相关基因（STOP1、MATE）的表达情况，探讨铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化系统及耐铝毒相关基因表达的影响，为使用农用酵素来提高葡萄耐铝毒能力提供理论依据。 1 材料与方法
1.1 试验材料
供试葡萄品种为美洲种内杂种品种“贝达”（Vitis riparia × V.labrusca ‘Beta’）和山葡萄品种“通化-3”（Vitis amurensis ‘Tonghua-3’）的1年生扦插苗，二者均为砧木品种，由云南省弥勒市东风农场管理局提供。农用酵素的制作按水∶ 果蔬残渣（切碎后的番茄果实和枝叶）∶糖蜜=10∶3∶1（质量比）比例混合后，装入50 L塑料桶中，盖好桶盖，室温避光发酵180 d以上，期间时常进行搅动，使其充分发酵，并排出发酵产生的气体，防止塑料桶被撑裂。
1.2 试验设计
參考以前不同铝浓度对葡萄生长胁迫影响研究的结果[12]，设置5 mmol/L铝[Al2（SO4）3·18H2O，pH = 4.5]，进行胁迫处理。采用PVP管进行管道栽培，PVP管长220 cm、直径20 cm，管壁上有6个排成一排直径为12 cm的圆孔，孔间距为40 cm。把栽培基质装入上口直径35 cm、下口直径10 cm、高28 cm的PVP塑料栽培容器中，然后挑选健康、无病虫害的1年生葡萄扦插苗定植于栽培容器中，每个栽培容器定植1株，之后把塑料栽培容器的下口8 cm插入管培的管道上的圆孔中进行管培。移栽后，在管培的管道中加满改良Hoagland’s营养液（pH 4.5），进行缓苗10 d再开始铝胁迫处理。铝胁迫处理分为2个阶段，第1阶段为处理的第1～14天，仅在Hoagland’s营养液中加入5 mmol/L铝进行胁迫处理;第2阶段为处理的第15～28天，在用Hoagland’s营养液配制的5 mmol/L铝处理液中加入稀释100倍的农用酵素进行复合处理。在整个试验期间，根据天气，每周添加处理液2～3次，管道中处理液每天用通气泵进行通气1 h。在处理的第0天、第7天、第14天、第21天和第28天进行采样检测各项指标，其中，处理的第0天为铝胁迫处理的前1 d，处理的第7天和第14天为单独铝胁迫处理，处理的第21天和第28天为铝胁迫和农用酵素复合处理。样品是健壮且无病虫害的植株中部叶片和白色根尖。用于检测耐铝基因的叶片，立刻用液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。试验重复3次。
1.3 项目测定
葡萄SOD活性采用氮蓝四唑光氧化法;氧自由基产生速率采用羟胺法;过氧化氢（H2O2）含量采用硫酸钛-浓氨水法;丙二醛（MDA）含量采用双组分光光度法[13]。POD活性采用愈创木酚显色法;根系活力采用TTC还原法[14]。
葡萄STOP、MATE基因表达分析：采用Biozol试剂法，将采样的葡萄叶片进行总RNA的提取，纯化，反转录成cDNA，稀释至70 ng/μL。IQTM 5 实时定量监测系统（BIO-RAD），荧光定量PCR;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，试剂盒;GAPDH，UBQ，内参基因，引物序列如表1。25 μL的反应体系：1.0 μL稀释好的cDNA模板，上下游引物 各1 μL，9.5 μL的RNase-free H2O，12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ。PCR扩增：95 ℃预变性1 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 5 s、72 ℃ 10 s，40个循环;95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、0.3 ℃ 20 s，熔解阶段。
1.4 数据分析
试验数据为3次重复的平均值，选用SPSS 17.0 软件进行邓肯式新复极差检验（P<0.05），比较平均值之间的参数差异。选用Excel 2010作图。
2 结果与分析
2.1 铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化系统的影响
2.1.1 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其SOD和POD活性的影响。
从图1可看出，“贝达”和“通化-3”在铝胁迫后，SOD活性和POD活性明显上升，在使用农用酵素处理后又明显下降。其中，从胁迫前到第7天时，“贝达”和“通化-3”的SOD活性分别上升了25.12%和21.65%，POD活性分别上升了162.23%和146.34%。从胁迫前到第14天时，二者的SOD活性分别上升了94.36%和83.68%，POD活性上升了30440%和243.90%，达到了差异显著性水平。从第14天到第21天时，“贝达”和“通化-3”的SOD活性下降幅度不大，但二者的POD活性分别下降了86.26%、54.61%。从第14天到第28天时，“贝达”和“通化-3”的SOD活性分别下降了55.10%、56.34%，POD活性分别下降了91.43%、75.18%，达到了差异显著性水平。这些结果表明，农用酵素可能通过调节葡萄体内抗氧化酶的活性，清除铝胁迫下产生的活性氧物质，减轻活性氧对细胞膜的氧化破坏程度，从而提高其耐铝性。
2.1.2 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其氧自由基产生速率和H2O2含量的影响。
由图2可知，铝胁迫下，葡萄的氧自由基产生速率持续上升，H2O2含量也呈现同样的趋势。从铝胁迫前到第14天，“贝达”的氧自由基产生速率上升了6272%，H2O2含量上升了105.34%，而“通化-3”分别上升了31.97%和49.85%。农用酵素处理后，从第14天到第21天“贝达”和“通化-3”氧自由基产生速率显著降低，分别下降了71.17%和50.46%，H2O2含量持续增加。从第14天到第28天时，“贝达”氧自由基产生速率和H2O2含量分别下降了80.29%和28.43%，“通化-3”的氧自由基产生速率和H2O2含量分别下降了68.54%和30.42%。可见，铝胁迫下，葡萄氧自由基产生速率和H2O2含量增加，但加入农用酵素后，二者均呈现下降趋势。
49卷17期 徐仕琴等 铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化系统及耐铝毒相关基因表达的影响 2.1.3 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其MDA含量和根系活力的影响。
由图3可知，铝胁迫导致“贝达”和“通化-3”的MDA含量显著增加，从胁迫前到第14天，二者的MDA含量分别上升了89.51%和140.83%。加入农用酵素后，从第14天到第28天时“贝达”和“通化-3”MDA含量分别降低了31.69%和31.14%。说明农用酵素可以有效降低铝胁迫对葡萄细胞膜脂过氧化的破坏程度，有效提高了葡萄耐铝性。
铝胁迫下，“贝达”和“通化-3”的根系活力不断下降，从铝胁迫前到第14天时，二者的根系活力分别下降了69.14%和66.39%，且均达到差异显著性水平，说明此时葡萄根系受到了伤害。加入农用酵素后，二者的根系活力逐渐增强，从第14天到第28天时，二者的根系活力分别提高了93.84%和380.61%。
2.2 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其叶片STOP1和MATE基因相对表达量的影响
STOP1和MATE基因已经被证实对提高植物耐铝毒能力起着重要作用。从图4可以看出，“贝达”和“通化-3”随铝处理时间延长，其基因表达量上升，但农用酵素处理后，基因表达量急速下降。从胁迫前到第14天，STOP1基因的表达量在“贝达”和“通化-3”分别上调了704.11%和504.10%，MATE基因的表达量在“贝达”和“通化-3”分别上调了331.19%和56.46%，这说明葡萄通过调控相应耐铝毒基因的上调表达来提高耐铝毒能力。
加入农用酵素处理后，“贝达”和“通化-3”的STOP1和MATE基因的表达量均有所下降。从第14天到第28天时，二者的STOP1基因的表达量分别下降了80.27%和77.69%，二者的MATE基因的表达量分别下降了92.36%和91.59%，且均达到差异显著性水平。
可见，STOP1基因和MATE基因均参与了铝胁迫的响应过程，同时加入农用酵素后，STOP1和MATE基因的表达量下降，表明酵素对提高葡萄耐铝性具有积极作用。
3 讨论与结论
我国南方大部分土壤呈酸性，大量铝元素会被溶解，毒害了植物的生长，导致植物营养缺乏和生长受阻甚至产量下降[15]。在我国南方酸性土壤中种植的葡萄极其容易受到铝毒的危害，铝胁迫下其植株生长受抑、果实品质差、树势衰弱、品种退化等[16]。
当植物受到铝胁迫时，多余活性氧无法清除，氧化损伤加重。该研究发现，5 mmol/L铝胁迫下，为减少葡萄产生过量活性氧，“贝达”和“通化-3”的SOD和POD活性均增强，从而保护细胞结构免受损伤，这与彭艳等[17]的研究结果相似，铝不仅诱导氧化应激，而且还诱导抗氧化酶增加，植物的抗性也增加[18];但在加入稀释100倍的农用酵素后，“贝达”和“通化-3”的SOD和POD活性显著下降，说明农用酵素对缓解铝胁迫下葡萄的氧化损伤具有一定的作用，保护其膜脂过氧化系统，从而提高了葡萄耐铝性。
5 mmol/L的鋁胁迫下，“贝达”和“通化-3”的氧自由基产生速率上升，二者的H2O2含量也增加，对生物膜造成氧化伤害[19]，铝毒造成的膜损伤与剧毒氧自由基的产生增加有关[20]，但农用酵素处理后，二者的氧自由基产生速率显著下降，农用酵素处理时间增加自由基清除率不断上升，与贾丽丽等[21]的研究结果相符合;农用酵素处理后二者的H2O2含量也显著下降，农用酵素能够增加土壤氮[22]、磷[23]、钾[24]的含量，氮、磷、钾的增加能够提高抵抗铝毒的能力[25]，说明农用酵素在缓解铝胁迫下葡萄膜脂过氧化有着积极作用。
MDA含量反映植物体内氧化应激的程度[26]，5 mmol/L铝胁迫下，“贝达”和“通化-3”的MDA含量均增加，这与Tewari等[27]的研究结果一致;在农用酵素处理后，二者的MDA含量便大幅度下降，说明农用酵素在清除活性氧并减轻细胞膜受到的氧化受害中起关键作用。根系活力是反映植物根系生理特性的重要指标，与植物根系呼吸有关。“贝达”和“通化-3”的根系活力随着铝胁迫时间延长而降低，农用酵素处理后，二者的根系活力均有所上升，根系活力增强是耐铝性提高的具体表现，因为根系活力增强后可向地上部分提供更多的养分和水分，以确保植物在铝胁迫环境中正常生长。铝中毒关键部位根尖，为阻碍Al3+侵入其细胞，会分泌有机酸。有机酸、蛋白质链（酶）、无机盐组成了酵素，由此可见，酵素处理在提高葡萄耐铝性中有极其重要的作用。
STOP1基因能抵抗非生物胁迫。在该研究中，铝胁迫下葡萄STOP1基因被激活，增强了植株的抗性从而诱导其他的耐铝基因，转录分泌更多的有机酸[28]。但加入农用酵素以后STOP1基因的表达量下降，这是由于农用酵素富含有机质和有机酸等成分，具有酸碱缓冲能力改善土壤和根际pH，从而降低了铝的活性阻碍铝对葡萄的毒害。MATE基因是植物中通过分泌有机酸而产生的转运蛋白家族，在铝诱导下，MATE转运体调节柠檬酸的分泌，将Al3+离子螯合成无毒化合物，防止Al3+进入植物体内。铝胁迫能显著诱导葡萄MATE基因表达上调，增强了抵御铝毒害的能力，其中MATE基因的表达量升高促进了柠檬酸分泌;同时提高SOD与POD 的活性来减弱铝胁迫对质膜造成的氧化损伤，这与前人在大豆[29]和甘蓝[30]的研究结果一致。但加入农用酵素后MATE基因的表达量下降，农用酵素中的微生物自身代谢产生乙酸、柠檬酸和氨基酸，这些酸性物质具有螯合、酸溶和抑菌作用[31]，其能够与铝螯合，铝离子活性被降低，从而减轻铝胁迫对葡萄的毒害。
综上所述，铝毒胁迫对葡萄产生了氧化伤害，并诱导了抗氧化酶和激活耐铝毒相关基因（STOP1和MATE）的表达，酵素能够有效提高葡萄耐铝性。铝胁迫下，提高SOD和POD活性及氧自由基产生速率，MDA和H2O2含量增加，并且STOP1基因和MATE基因表达量上调，根系活力下降，说明葡萄受到了铝毒的影响，不能正常生长发育。然而，农用酵素处理后，降低SOD和POD活性及氧自由基产生速率，MDA和H2O2含量减少，STOP1基因和MATE基因的表达下调，根系活力上升，说明农用酵素在清除葡萄活性氧中发挥着重要作用，降低其膜脂过氧化水平，有效缓解了铝毒对葡萄的生理伤害。 参考文献
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关键词 农用酵素;葡萄;铝胁迫;膜脂过氧化系統;耐铝毒基因;表达量
中图分类号 S663.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）17-0015-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.004
Abstract In order to explore the effect of agricultural enzyme treatment on improving aluminum tolerance of grape and its related mechanism， two rootstock varieties ‘Beta’ and ‘Tonghua-3’ grape were used as materials，the effects of agricultural enzymes on the expression of membrane lipid peroxidation products and aluminum tolerance related genes in grape under aluminum stress were studied by means of pipe soilless cultivation. The results showed that the activity of SOD and POD， the production rate of oxygen free radicals and the relative expression of MATE in grape after agricultural enzyme treatment were lower than those one day before stress treatment， the contents of hydrogen peroxide， malondialdehyde and the relative expression of STOP1 were lower than those of aluminum stress for 14 days，the root activity was higher than that of aluminum stress for 14 days. The damage degree of grape membrane lipid peroxidation system and the expression of genes related to aluminum tolerance decreased after agricultural enzyme treatment， which showed that agricultural enzyme played an important role in alleviating the damage of aluminum toxicity to grapes and could effectively improve the aluminum tolerance of grapes.
Key words Agricultural enzyme;Grape;Aluminum stress;Membrane lipid peroxidation system;Aluminum tolerance gene;Expression quantity
在土壤呈非酸性时，植物不会因为铝产生毒害现象，但当土壤呈酸性时，大量铝溶于土壤溶液而形成对植物具有毒害作用的Al3+，植物根系的发育被抑制，从而影响根系吸收水分和养分[1]，因此在酸性土壤中，制约植物产量最关键的是铝毒[2]。葡萄（Vitis spp.）原产中亚，其营养价值高，具有抗癌、抗衰老等作用[3]。我国南方酸性土壤上种植的葡萄极易受铝毒害，葡萄生长危害严重，其超氧化物歧化酶（SOD）活性与过氧化物酶（POD）活性加强，根系活力降低等，使其浆果产量和品种大幅度下降[4]。
泰国的Rosukun利用有机固体废物发酵获得了一种溶液形式的产品，称为酵素（enzyme）[5]。酵素富含有机酸、有益微生物以及SOD等生物催化酶，因此具有抑制病原菌和生物催化的双重作用[6]。研究表明，农用酵素能长期分泌抗生物质，也能长期分泌天然植物生长调节剂[7]。亦有研究表明，农用酵素能够使植物体内与抗逆性相关的关键生理生化指标大幅度提高[8]。此外，农用酵素抗氧化活性物质丰富[9]，具备较强清除超氧自由基等的能力[10]。在逆境胁迫下，活性氧产生和清除是不均衡，引发植物细胞损伤，而农用酵素保护细胞免受损伤，提高其抗氧化能力[11]。
近年来，农用酵素在提高农作物抗氧化能力方面的研究成为热点，但农用酵素对铝胁迫下葡萄膜脂过氧化系统及耐铝毒相关基因表达的影响鲜见报道。我国南方土壤由于遭受农业和工业过程的影响，其酸化程度日益加剧，铝毒对葡萄的伤害日趋严重。通过利用农用酵素处理来提高葡萄的耐铝性为酸性土壤地区解决葡萄生产中的铝毒问题提供一条行之有效的途径。为此，该研究采用无土栽培的方法，先进行铝胁迫处理14 d后，再用稀释100倍的农用酵素处理铝胁迫下的葡萄，然后测定葡萄抗氧化系统的相关生理指标及耐铝相关基因（STOP1、MATE）的表达情况，探讨铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化系统及耐铝毒相关基因表达的影响，为使用农用酵素来提高葡萄耐铝毒能力提供理论依据。 1 材料与方法
1.1 试验材料
供试葡萄品种为美洲种内杂种品种“贝达”（Vitis riparia × V.labrusca ‘Beta’）和山葡萄品种“通化-3”（Vitis amurensis ‘Tonghua-3’）的1年生扦插苗，二者均为砧木品种，由云南省弥勒市东风农场管理局提供。农用酵素的制作按水∶ 果蔬残渣（切碎后的番茄果实和枝叶）∶糖蜜=10∶3∶1（质量比）比例混合后，装入50 L塑料桶中，盖好桶盖，室温避光发酵180 d以上，期间时常进行搅动，使其充分发酵，并排出发酵产生的气体，防止塑料桶被撑裂。
1.2 试验设计
參考以前不同铝浓度对葡萄生长胁迫影响研究的结果[12]，设置5 mmol/L铝[Al2（SO4）3·18H2O，pH = 4.5]，进行胁迫处理。采用PVP管进行管道栽培，PVP管长220 cm、直径20 cm，管壁上有6个排成一排直径为12 cm的圆孔，孔间距为40 cm。把栽培基质装入上口直径35 cm、下口直径10 cm、高28 cm的PVP塑料栽培容器中，然后挑选健康、无病虫害的1年生葡萄扦插苗定植于栽培容器中，每个栽培容器定植1株，之后把塑料栽培容器的下口8 cm插入管培的管道上的圆孔中进行管培。移栽后，在管培的管道中加满改良Hoagland’s营养液（pH 4.5），进行缓苗10 d再开始铝胁迫处理。铝胁迫处理分为2个阶段，第1阶段为处理的第1～14天，仅在Hoagland’s营养液中加入5 mmol/L铝进行胁迫处理;第2阶段为处理的第15～28天，在用Hoagland’s营养液配制的5 mmol/L铝处理液中加入稀释100倍的农用酵素进行复合处理。在整个试验期间，根据天气，每周添加处理液2～3次，管道中处理液每天用通气泵进行通气1 h。在处理的第0天、第7天、第14天、第21天和第28天进行采样检测各项指标，其中，处理的第0天为铝胁迫处理的前1 d，处理的第7天和第14天为单独铝胁迫处理，处理的第21天和第28天为铝胁迫和农用酵素复合处理。样品是健壮且无病虫害的植株中部叶片和白色根尖。用于检测耐铝基因的叶片，立刻用液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。试验重复3次。
1.3 项目测定
葡萄SOD活性采用氮蓝四唑光氧化法;氧自由基产生速率采用羟胺法;过氧化氢（H2O2）含量采用硫酸钛-浓氨水法;丙二醛（MDA）含量采用双组分光光度法[13]。POD活性采用愈创木酚显色法;根系活力采用TTC还原法[14]。
葡萄STOP、MATE基因表达分析：采用Biozol试剂法，将采样的葡萄叶片进行总RNA的提取，纯化，反转录成cDNA，稀释至70 ng/μL。IQTM 5 实时定量监测系统（BIO-RAD），荧光定量PCR;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，试剂盒;GAPDH，UBQ，内参基因，引物序列如表1。25 μL的反应体系：1.0 μL稀释好的cDNA模板，上下游引物 各1 μL，9.5 μL的RNase-free H2O，12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ。PCR扩增：95 ℃预变性1 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 5 s、72 ℃ 10 s，40个循环;95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、0.3 ℃ 20 s，熔解阶段。
1.4 数据分析
试验数据为3次重复的平均值，选用SPSS 17.0 软件进行邓肯式新复极差检验（P<0.05），比较平均值之间的参数差异。选用Excel 2010作图。
2 结果与分析
2.1 铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化系统的影响
2.1.1 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其SOD和POD活性的影响。
从图1可看出，“贝达”和“通化-3”在铝胁迫后，SOD活性和POD活性明显上升，在使用农用酵素处理后又明显下降。其中，从胁迫前到第7天时，“贝达”和“通化-3”的SOD活性分别上升了25.12%和21.65%，POD活性分别上升了162.23%和146.34%。从胁迫前到第14天时，二者的SOD活性分别上升了94.36%和83.68%，POD活性上升了30440%和243.90%，达到了差异显著性水平。从第14天到第21天时，“贝达”和“通化-3”的SOD活性下降幅度不大，但二者的POD活性分别下降了86.26%、54.61%。从第14天到第28天时，“贝达”和“通化-3”的SOD活性分别下降了55.10%、56.34%，POD活性分别下降了91.43%、75.18%，达到了差异显著性水平。这些结果表明，农用酵素可能通过调节葡萄体内抗氧化酶的活性，清除铝胁迫下产生的活性氧物质，减轻活性氧对细胞膜的氧化破坏程度，从而提高其耐铝性。
2.1.2 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其氧自由基产生速率和H2O2含量的影响。
由图2可知，铝胁迫下，葡萄的氧自由基产生速率持续上升，H2O2含量也呈现同样的趋势。从铝胁迫前到第14天，“贝达”的氧自由基产生速率上升了6272%，H2O2含量上升了105.34%，而“通化-3”分别上升了31.97%和49.85%。农用酵素处理后，从第14天到第21天“贝达”和“通化-3”氧自由基产生速率显著降低，分别下降了71.17%和50.46%，H2O2含量持续增加。从第14天到第28天时，“贝达”氧自由基产生速率和H2O2含量分别下降了80.29%和28.43%，“通化-3”的氧自由基产生速率和H2O2含量分别下降了68.54%和30.42%。可见，铝胁迫下，葡萄氧自由基产生速率和H2O2含量增加，但加入农用酵素后，二者均呈现下降趋势。
49卷17期 徐仕琴等 铝胁迫下农用酵素对葡萄膜脂过氧化系统及耐铝毒相关基因表达的影响 2.1.3 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其MDA含量和根系活力的影响。
由图3可知，铝胁迫导致“贝达”和“通化-3”的MDA含量显著增加，从胁迫前到第14天，二者的MDA含量分别上升了89.51%和140.83%。加入农用酵素后，从第14天到第28天时“贝达”和“通化-3”MDA含量分别降低了31.69%和31.14%。说明农用酵素可以有效降低铝胁迫对葡萄细胞膜脂过氧化的破坏程度，有效提高了葡萄耐铝性。
铝胁迫下，“贝达”和“通化-3”的根系活力不断下降，从铝胁迫前到第14天时，二者的根系活力分别下降了69.14%和66.39%，且均达到差异显著性水平，说明此时葡萄根系受到了伤害。加入农用酵素后，二者的根系活力逐渐增强，从第14天到第28天时，二者的根系活力分别提高了93.84%和380.61%。
2.2 葡萄在铝胁迫下农用酵素对其叶片STOP1和MATE基因相对表达量的影响
STOP1和MATE基因已经被证实对提高植物耐铝毒能力起着重要作用。从图4可以看出，“贝达”和“通化-3”随铝处理时间延长，其基因表达量上升，但农用酵素处理后，基因表达量急速下降。从胁迫前到第14天，STOP1基因的表达量在“贝达”和“通化-3”分别上调了704.11%和504.10%，MATE基因的表达量在“贝达”和“通化-3”分别上调了331.19%和56.46%，这说明葡萄通过调控相应耐铝毒基因的上调表达来提高耐铝毒能力。
加入农用酵素处理后，“贝达”和“通化-3”的STOP1和MATE基因的表达量均有所下降。从第14天到第28天时，二者的STOP1基因的表达量分别下降了80.27%和77.69%，二者的MATE基因的表达量分别下降了92.36%和91.59%，且均达到差异显著性水平。
可见，STOP1基因和MATE基因均参与了铝胁迫的响应过程，同时加入农用酵素后，STOP1和MATE基因的表达量下降，表明酵素对提高葡萄耐铝性具有积极作用。
3 讨论与结论
我国南方大部分土壤呈酸性，大量铝元素会被溶解，毒害了植物的生长，导致植物营养缺乏和生长受阻甚至产量下降[15]。在我国南方酸性土壤中种植的葡萄极其容易受到铝毒的危害，铝胁迫下其植株生长受抑、果实品质差、树势衰弱、品种退化等[16]。
当植物受到铝胁迫时，多余活性氧无法清除，氧化损伤加重。该研究发现，5 mmol/L铝胁迫下，为减少葡萄产生过量活性氧，“贝达”和“通化-3”的SOD和POD活性均增强，从而保护细胞结构免受损伤，这与彭艳等[17]的研究结果相似，铝不仅诱导氧化应激，而且还诱导抗氧化酶增加，植物的抗性也增加[18];但在加入稀释100倍的农用酵素后，“贝达”和“通化-3”的SOD和POD活性显著下降，说明农用酵素对缓解铝胁迫下葡萄的氧化损伤具有一定的作用，保护其膜脂过氧化系统，从而提高了葡萄耐铝性。
5 mmol/L的鋁胁迫下，“贝达”和“通化-3”的氧自由基产生速率上升，二者的H2O2含量也增加，对生物膜造成氧化伤害[19]，铝毒造成的膜损伤与剧毒氧自由基的产生增加有关[20]，但农用酵素处理后，二者的氧自由基产生速率显著下降，农用酵素处理时间增加自由基清除率不断上升，与贾丽丽等[21]的研究结果相符合;农用酵素处理后二者的H2O2含量也显著下降，农用酵素能够增加土壤氮[22]、磷[23]、钾[24]的含量，氮、磷、钾的增加能够提高抵抗铝毒的能力[25]，说明农用酵素在缓解铝胁迫下葡萄膜脂过氧化有着积极作用。
MDA含量反映植物体内氧化应激的程度[26]，5 mmol/L铝胁迫下，“贝达”和“通化-3”的MDA含量均增加，这与Tewari等[27]的研究结果一致;在农用酵素处理后，二者的MDA含量便大幅度下降，说明农用酵素在清除活性氧并减轻细胞膜受到的氧化受害中起关键作用。根系活力是反映植物根系生理特性的重要指标，与植物根系呼吸有关。“贝达”和“通化-3”的根系活力随着铝胁迫时间延长而降低，农用酵素处理后，二者的根系活力均有所上升，根系活力增强是耐铝性提高的具体表现，因为根系活力增强后可向地上部分提供更多的养分和水分，以确保植物在铝胁迫环境中正常生长。铝中毒关键部位根尖，为阻碍Al3+侵入其细胞，会分泌有机酸。有机酸、蛋白质链（酶）、无机盐组成了酵素，由此可见，酵素处理在提高葡萄耐铝性中有极其重要的作用。
STOP1基因能抵抗非生物胁迫。在该研究中，铝胁迫下葡萄STOP1基因被激活，增强了植株的抗性从而诱导其他的耐铝基因，转录分泌更多的有机酸[28]。但加入农用酵素以后STOP1基因的表达量下降，这是由于农用酵素富含有机质和有机酸等成分，具有酸碱缓冲能力改善土壤和根际pH，从而降低了铝的活性阻碍铝对葡萄的毒害。MATE基因是植物中通过分泌有机酸而产生的转运蛋白家族，在铝诱导下，MATE转运体调节柠檬酸的分泌，将Al3+离子螯合成无毒化合物，防止Al3+进入植物体内。铝胁迫能显著诱导葡萄MATE基因表达上调，增强了抵御铝毒害的能力，其中MATE基因的表达量升高促进了柠檬酸分泌;同时提高SOD与POD 的活性来减弱铝胁迫对质膜造成的氧化损伤，这与前人在大豆[29]和甘蓝[30]的研究结果一致。但加入农用酵素后MATE基因的表达量下降，农用酵素中的微生物自身代谢产生乙酸、柠檬酸和氨基酸，这些酸性物质具有螯合、酸溶和抑菌作用[31]，其能够与铝螯合，铝离子活性被降低，从而减轻铝胁迫对葡萄的毒害。
综上所述，铝毒胁迫对葡萄产生了氧化伤害，并诱导了抗氧化酶和激活耐铝毒相关基因（STOP1和MATE）的表达，酵素能够有效提高葡萄耐铝性。铝胁迫下，提高SOD和POD活性及氧自由基产生速率，MDA和H2O2含量增加，并且STOP1基因和MATE基因表达量上调，根系活力下降，说明葡萄受到了铝毒的影响，不能正常生长发育。然而，农用酵素处理后，降低SOD和POD活性及氧自由基产生速率，MDA和H2O2含量减少，STOP1基因和MATE基因的表达下调，根系活力上升，说明农用酵素在清除葡萄活性氧中发挥着重要作用，降低其膜脂过氧化水平，有效缓解了铝毒对葡萄的生理伤害。 参考文献
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