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摘要：SOS2（SaltOverlySensitive2）是植物中一类耐盐相关基因的统称，在植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本试验以花生AhSOS2基因全长cDNA为模板，经PCR扩增获得AhSOS2的蛋白编码区，将该区段与表达载体pET-28a（+）融合，构建获得原核表达载体pET-28a-AhSOS2，并进一步在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。经1.0mmol/LIPTG诱导后，获得一条约51kD的融合蛋白条带，且随着IPTG诱导时间的延长，蛋白表达量逐渐提高，诱导8h可获得较高的蛋白表达水平。
关键词：花生；AhSOS2；原核表达；融合蛋白
中图分类号：Q788文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0006-04
花生（ArachishypogaeaL.）是重要的油料兼经济作物，我国花生总产居油料作物首位，种植面积居第二位[1]。花生生长过程中经常受到生物或非生物胁迫的影响[2]。其中高盐胁迫是严重危害植物生长发育的非生物胁迫因子之一，对农业生产造成极大的负面影响[3，4]。在受到高盐胁迫时，植物体内离子平衡遭到破坏，但在长期的进化过程中植物体也形成了一系列防御机制。其中SOS信号途径是调节离子稳态和提高植物耐钠性的重要途径之一[2]。
近年来，国内外对SOS基因家族的研究越来越多，其中SOS1、SOS2、SOS3基因等都已进行转基因研究，对转基因拟南芥[5]、苹果[6]、甘蓝[7]等材料的研究结果均证明该家族基因在提高转基因植物的耐盐性方面具有一定作用。SOS2是SOS途径中一类关键抗逆相关基因，拟南芥中的研究结果显示其在耐盐、抗逆过程中具有重要作用[8]。
前人关于SOS2基因的研究多集中在分子水平上，虽然对部分SOS2基因编码蛋白的分子量进行了预测，但关于基因原核表达及表达条件优化的报道较少。前期工作中，克隆到花生SOS2基因AhSOS2，大小约1462bp，编码一个含446个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，预测该蛋白激酶分子量为51ku[9]。本研究将AhSOS2基因编码区与原核表达载体pET-28a（+）融合，获得pET-28a-AhSOS2，测序正确后，转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，进行诱导表达，最终获得蛋白表达产物，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；高纯质粒回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；序列测定由山东省农业科学院生物技术研究中心测序室完成。
1.2AhSOS2基因的扩增
以AhSOS2基因的全长cDNA序列为模板，以AhSOS2EcoRⅠ1（5′CGGAATTCATGAAGAAGGTGAGGAATAAGATCG3′）和AhSOS2SalⅠ2（5′-GCGTCGACTACAGTCATTTGTCGAAGCATACC3′）（下划线分别为EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点）为引物，经PCR扩增获得AhSOS2基因蛋白编码区。PCR反应体系（20μl）为：PCRmix10μl、10μmol/L上、下游引物各0.5μl、质粒0.1μl、ddH2O补齐。反应程序如下：94℃3min；94℃30s，56℃1.5min，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
1.3AhSOS2原核表达载体的构建及转化
PCR产物及原核表达载体pET-28a（+）分别经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，回收酶切片段并纯化，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，并送山东省农业科学院生物技术研究中心测序室进行测序，最终获得重组表达载体pET-28a-AhSOS2。
将测序正确的pET-28a-AhSOS2转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经50μg/ml的Kan筛选及PCR鉴定，获得阳性克隆。
1.4AhSOS2基因的诱导表达及SDS-PAGE检测
将含有重组质粒pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）阳性克隆振荡培养，菌液以1∶100比例稀释于预热的抗性LB培养液中，培养至OD600值约为0.6后，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，25℃、200r/min条件下，分别诱导0、2、4、6、8、10和12h。收获菌液经等量还原性2×SDS样品缓冲液裂解，12%SDS-PAGE电泳，染色后凝胶成像仪上鉴定并照相。
2结果与分析
2.1AhSOS2基因扩增
经PCR扩增，获得一条约1350bp的条带，与预测条带大小一致（图1）。
2.3融合蛋白的SDS-PAGE鉴定
如图5，在25℃下，含有pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）菌体经1.0mmol/LIPTG诱导2h后即可得到明显的诱导带，大小约51kD，与预期大小一致，表明AhSOS2基因可在原核系统中表达并获得诱导产物。且随诱导时间的延长，AhSOS2蛋白表达量逐渐提高，诱导8h，蛋白表达丰度达到较高水平，之后随诱导时间的延长略有提高。
3结论与讨论
大肠杆菌表达系统是外源基因表达中最成熟、应用最广泛的原核表达系统[10]，与其它表达系统相比，该系统有诸多优点，如遗传背景和生化特性非常清楚、操作简便、成本低、周期短、表达蛋白可大量生产且易于纯化等[11]。BL21是目前应用最广的宿主菌，IPTG在其蛋白表达中起着十分重要的作用。加入IPTG后可使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，从而使外源基因大量转录，达到高效表达的效果[12]。不同的基因因生化特征及表达蛋白特性不同，其原核表达特点也不同。张传义等[13]对苹果AFL1基因进行原核表达时，虽然外源施加IPTG能够诱导AFL1蛋白的表达，但蛋白表达量不随诱导时间的延长而改变。李静等[14]在研究拟南芥AtCOR15a抗寒基因的原核表达时发现，加入IPTG诱导5h，蛋白表达达到较高水平，进一步诱导至8h，蛋白表达量则有所降低。 SOS2是一类公认的抗逆相关基因，在不同物种中关于其生理及功能的研究较多，但原核表达的研究则相对较少。本研究以前期试验中获得的AhSOS2基因全长cDNA为模板，通过特异性引物，获得了AhSOS2基因的蛋白编码区。在此基础上，利用pET系列载体，构建了AhSOS2基因的原核表达载体pET-28a-AhSOS2，经酶切鉴定及测序正确后，将该重组质粒转入BL21感受态中。经诱导及条件优化，最终实现了AhSOS2基因在大肠杆菌中的成功表达。且随诱导时间的延长，蛋白表达量提高，1mmol/LIPTG诱导8h，蛋白表达丰度达到较高水平，之后随诱导时间的延长蛋白表达量略有提高。本试验结果为进一步研究AhSOS2基因及编码蛋白的理化性质、表达调控机制、空间结构及制备特异性抗体等奠定了基础。
参考文献：
[1]汤松，禹山林，廖伯寿，等.我国花生产业现状、存在问题及发展对策[J].花生学报，2010，39（3）：35-38.
[2]邵凤霞.花生NAC转录因子的克隆和功能分析[D].济南：山东师范大学，2009.
[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.
[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.
[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.
[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.
[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.
[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.
[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.
[10]戴汉川，张晓伟，龙良启，等.鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析[J].中国农业科学，2007，40（11）：2615-2620.
[11]罗文新，张军，杨海杰，等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报，2000，16（5）：578-581.
[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.
[13]张传义，孟玉平，孙海峰，等.苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达[J].山西农业科学，2008，36（7）：14-16.
[14]李静，李晓荣，王冬梅，等.拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达[J].新疆农业科学，2010，47（10）：2031-2036.
关键词：花生；AhSOS2；原核表达；融合蛋白
中图分类号：Q788文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0006-04
花生（ArachishypogaeaL.）是重要的油料兼经济作物，我国花生总产居油料作物首位，种植面积居第二位[1]。花生生长过程中经常受到生物或非生物胁迫的影响[2]。其中高盐胁迫是严重危害植物生长发育的非生物胁迫因子之一，对农业生产造成极大的负面影响[3，4]。在受到高盐胁迫时，植物体内离子平衡遭到破坏，但在长期的进化过程中植物体也形成了一系列防御机制。其中SOS信号途径是调节离子稳态和提高植物耐钠性的重要途径之一[2]。
近年来，国内外对SOS基因家族的研究越来越多，其中SOS1、SOS2、SOS3基因等都已进行转基因研究，对转基因拟南芥[5]、苹果[6]、甘蓝[7]等材料的研究结果均证明该家族基因在提高转基因植物的耐盐性方面具有一定作用。SOS2是SOS途径中一类关键抗逆相关基因，拟南芥中的研究结果显示其在耐盐、抗逆过程中具有重要作用[8]。
前人关于SOS2基因的研究多集中在分子水平上，虽然对部分SOS2基因编码蛋白的分子量进行了预测，但关于基因原核表达及表达条件优化的报道较少。前期工作中，克隆到花生SOS2基因AhSOS2，大小约1462bp，编码一个含446个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，预测该蛋白激酶分子量为51ku[9]。本研究将AhSOS2基因编码区与原核表达载体pET-28a（+）融合，获得pET-28a-AhSOS2，测序正确后，转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，进行诱导表达，最终获得蛋白表达产物，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
大肠杆菌DH5α及BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；高纯质粒回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；序列测定由山东省农业科学院生物技术研究中心测序室完成。
1.2AhSOS2基因的扩增
以AhSOS2基因的全长cDNA序列为模板，以AhSOS2EcoRⅠ1（5′CGGAATTCATGAAGAAGGTGAGGAATAAGATCG3′）和AhSOS2SalⅠ2（5′-GCGTCGACTACAGTCATTTGTCGAAGCATACC3′）（下划线分别为EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点）为引物，经PCR扩增获得AhSOS2基因蛋白编码区。PCR反应体系（20μl）为：PCRmix10μl、10μmol/L上、下游引物各0.5μl、质粒0.1μl、ddH2O补齐。反应程序如下：94℃3min；94℃30s，56℃1.5min，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
1.3AhSOS2原核表达载体的构建及转化
PCR产物及原核表达载体pET-28a（+）分别经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，回收酶切片段并纯化，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行酶切鉴定，并送山东省农业科学院生物技术研究中心测序室进行测序，最终获得重组表达载体pET-28a-AhSOS2。
将测序正确的pET-28a-AhSOS2转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经50μg/ml的Kan筛选及PCR鉴定，获得阳性克隆。
1.4AhSOS2基因的诱导表达及SDS-PAGE检测
将含有重组质粒pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）阳性克隆振荡培养，菌液以1∶100比例稀释于预热的抗性LB培养液中，培养至OD600值约为0.6后，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，25℃、200r/min条件下，分别诱导0、2、4、6、8、10和12h。收获菌液经等量还原性2×SDS样品缓冲液裂解，12%SDS-PAGE电泳，染色后凝胶成像仪上鉴定并照相。
2结果与分析
2.1AhSOS2基因扩增
经PCR扩增，获得一条约1350bp的条带，与预测条带大小一致（图1）。
2.3融合蛋白的SDS-PAGE鉴定
如图5，在25℃下，含有pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）菌体经1.0mmol/LIPTG诱导2h后即可得到明显的诱导带，大小约51kD，与预期大小一致，表明AhSOS2基因可在原核系统中表达并获得诱导产物。且随诱导时间的延长，AhSOS2蛋白表达量逐渐提高，诱导8h，蛋白表达丰度达到较高水平，之后随诱导时间的延长略有提高。
3结论与讨论
大肠杆菌表达系统是外源基因表达中最成熟、应用最广泛的原核表达系统[10]，与其它表达系统相比，该系统有诸多优点，如遗传背景和生化特性非常清楚、操作简便、成本低、周期短、表达蛋白可大量生产且易于纯化等[11]。BL21是目前应用最广的宿主菌，IPTG在其蛋白表达中起着十分重要的作用。加入IPTG后可使阻遏蛋白不能与操纵基因结合，从而使外源基因大量转录，达到高效表达的效果[12]。不同的基因因生化特征及表达蛋白特性不同，其原核表达特点也不同。张传义等[13]对苹果AFL1基因进行原核表达时，虽然外源施加IPTG能够诱导AFL1蛋白的表达，但蛋白表达量不随诱导时间的延长而改变。李静等[14]在研究拟南芥AtCOR15a抗寒基因的原核表达时发现，加入IPTG诱导5h，蛋白表达达到较高水平，进一步诱导至8h，蛋白表达量则有所降低。 SOS2是一类公认的抗逆相关基因，在不同物种中关于其生理及功能的研究较多，但原核表达的研究则相对较少。本研究以前期试验中获得的AhSOS2基因全长cDNA为模板，通过特异性引物，获得了AhSOS2基因的蛋白编码区。在此基础上，利用pET系列载体，构建了AhSOS2基因的原核表达载体pET-28a-AhSOS2，经酶切鉴定及测序正确后，将该重组质粒转入BL21感受态中。经诱导及条件优化，最终实现了AhSOS2基因在大肠杆菌中的成功表达。且随诱导时间的延长，蛋白表达量提高，1mmol/LIPTG诱导8h，蛋白表达丰度达到较高水平，之后随诱导时间的延长蛋白表达量略有提高。本试验结果为进一步研究AhSOS2基因及编码蛋白的理化性质、表达调控机制、空间结构及制备特异性抗体等奠定了基础。
参考文献：
[1]汤松，禹山林，廖伯寿，等.我国花生产业现状、存在问题及发展对策[J].花生学报，2010，39（3）：35-38.
[2]邵凤霞.花生NAC转录因子的克隆和功能分析[D].济南：山东师范大学，2009.
[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.
[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.
[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.
[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.
[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.
[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.
[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.
[10]戴汉川，张晓伟，龙良启，等.鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析[J].中国农业科学，2007，40（11）：2615-2620.
[11]罗文新，张军，杨海杰，等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报，2000，16（5）：578-581.
[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.
[13]张传义，孟玉平，孙海峰，等.苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达[J].山西农业科学，2008，36（7）：14-16.
[14]李静，李晓荣，王冬梅，等.拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达[J].新疆农业科学，2010，47（10）：2031-2036.