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【摘要】 目的：观察兔激素性股骨头缺血坏死体外冲击波疗法（ESWT）干预后，血浆中血小板α-颗粒膜蛋白（GMP-140）、血栓调节蛋白（TM）及骨保护素（OPG）的表达。方法：选取健康成年雄性日本大耳兔50只，激素造模后随机处死2只验证造模成功，其余按随机数字表法分为模型对照组（A组）24只和冲击波治疗组（B组）24只。干预前，两组随机选取8只兔耳动脉采血测血浆GMP-140、TM、OPG含量；ESWT干预第2、4、8周时A、B组各随机选取8只兔，耳动脉采血后处死，测血浆GMP-140、TM、OPG含量；留取股骨头标本行HE染色观察大体病理变化，免疫组化观察股骨头中OPG阳性表达，并进行半定量分析。结果：ESWT干预2、4、8周后，B组血浆中的GMP-140、TM含量较A组均降低（P<0.05）；ESWT干预4周、8周时B组血浆中OPG含量较A组均升高（P<0.05）。ESWT干预2、4、8周时B组股骨头中的OPG阳性表达较A组均升高（P<0.05）。结论：兔激素性股骨头坏死ESWT干预可使血浆中OPG含量增高，GMP-140、TM含量降低，局部坏死区OPG表达增强。
【关键词】 股骨头坏死； 体外冲击波； 骨保护素； 血小板α-颗粒膜蛋白； 血栓调节蛋白
激素性股骨头缺血坏死（Steroid induced Avascular Necrosis of Femoral Head，SANFH）居非创伤性股骨头缺血坏死诸多病因首位，尽管人工关节置换效果满意，但对于年轻或不能行手术的患者，治疗上仍是骨科的难题。体外冲击波治疗（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）经证实对股骨头缺血坏死有效，但其治疗机制仍不十分清楚[1]。本文旨在观察体外冲击波对GMP-140、TM、OPG表达的影响，探讨体外冲击波疗法的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 健康成年日本大耳兔50只，体重2.5～3.5 kg，雄性（由山西医科大学实验动物中心提供），颗粒饲料分笼喂养。大肠杆菌脂多糖（LPS，Sigma公司）；甲泼尼龙琥珀酸钠（MP，辉瑞公司）；OPG分析试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）；OPG兔抗鼠多克隆抗体（北京中山生物技术公司），GMP-140试剂盒（上海太阳生物技术公司），TM试剂盒（American Diagostica公司），SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；冲击波骨科治疗机（深圳慧康医疗器械有限公司，HK.ESWOAJII型）。
1.2 造模及分组 健康成年雄性日本大耳兔50只，造模方法采用Yamamoto法[2]，于兔耳缘静脉注射LPS（10 μg/kg），24 h后重复给药1次；在第2次注射大肠杆菌内毒素后，立即臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠（40 mg/kg），共3次，每次间隔24 h（每次给药前均测量体重，调整剂量）；注射激素期间青霉素20万单位/kg臀肌注射，预防感染。造模完成后随机选取2只兔予以空气栓塞法处死，留取股骨头，10%甲醛固定，脱钙液进行脱钙，脱钙满意后纵行剖开，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察股骨头见：部分骨小梁变细，空骨陷窝较多，骨小梁内脂滴较多，证明股骨头有坏死，造模成功。将造模后的动物按随机数字表法分为模型对照组（A组）和冲击波治疗组（B组），每组24只，各组动物相同条件喂养。
1.3 ESWT干预 B组麻醉后，股骨头区剃毛、涂抹耦合剂，X线透视定位确定冲击波焦点，电压10.5 kV，频率70次/min，15 min/次，1次/d，共5次，给予冲击波干预。
1.4 标本采集与检测 ESWT干预前各组随机选取8只兔耳动脉采血2～4 mL，缓慢加入含有200 μL 20%EDTA-Na2的试管中，离心处理（3000 r/min，离心10 min），取上层血浆，置于-80 ℃冰箱保存；ESWT干预2、4、8周时分别于各组随机抽取8只兔，耳动脉采血2～4 mL后依前法处理后保存；空气栓塞法处死兔，留取股骨头，10%甲醛固定，脱钙液进行脱钙，脱钙满意后纵行剖开，石蜡包埋，切片，HE染色镜下观察股骨头病理变化；切片常规脱蜡、脱水后，SABC法免疫组织化学染色。以已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照，严格按说明书操作。光镜下免疫阳性细胞胞浆呈棕黄色，每个股骨头标本相同部位各切片2张，每张切片在高倍镜（400倍）下随机选取5个非重叠视野，采用BI-2000医学图像分析系统，计算每个视野中阳性染色面积占总视野面积的百分比并求其平均值。血浆中GMP-140、TM、OPG测量严格按照试剂盒说明操作。
1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用重复测量方差分析，组间均数间比较用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 股骨头组织形态学变化 大体标本：造模完成后股骨头纵剖面有含铁血黄素沉着，软骨下可见囊性变；A组股骨头在各个观察时间点与造模完成时无明显变化；ESWT干预2周时B组股骨头软骨下囊性变较干预前减轻；ESWT干预4周时B组股骨头表面光滑、软骨下病变较前减轻；干预8周后B组股骨头软骨面平滑，软骨下病变不明显。
2.2 两组HE染色变化 A组镜下可见骨小梁稀疏、断裂，成骨细胞核固缩，骨细胞空骨陷窝>50%，且随着实验时间的推移，镜下所见基本相同。ESWT干预2周时B组可见散在的骨髓细胞结构模糊、淡染的粉红色区域及空骨陷窝；干预4周时B组成骨细胞清晰可见，空骨陷窝较2周前减少；干预8周时镜下可见B组空骨陷窝很少见，骨小梁排布趋于正常。
2.3 两组血浆中GMP-140、TM、OPG含量变化 ESWT干预2、4、8周后，B组血浆中GMP-140、TM含量较A组均降低（P<0.05）。ESWT干预2周后两组血浆中OPG含量变化不明显（P>0.05）；4、8周时B组血浆中OPG含量较A组均升高（P<0.05） 2.4 两组股骨头中OPG阳性表达 ESWT干预2、4、8周时A组股骨头中OPG表达均低于B组同时间点（P<0.05）。
3 讨论
股骨头缺血坏死多发于30～59岁的中青年，激素所致的股骨头坏死是最常见原因之一[3]。其发病机制多与激素导致的脂代谢紊乱、血管内皮细胞损伤及骨质疏松等有关，而脂质代谢紊乱、高凝低纤溶状态正是股骨头缺血坏死的病理生理学基础[4-7]。
3.1 GMP-140、TM和OPG的生物学特性 GMP-140主要分布在α-颗粒膜上，在血小板活化后，α-颗粒可迅速与血小板膜融合并释放，使GMP-140重新分布于血小板表面，故GMP-140在血小板表面的表达是血小板活化的特异性标志物之一[8]。有文献[9]报道，GMP-140较β-血栓球蛋白等其他指标更能准确反映体内血小板的活化状态。也有文献[10]报道，血小板表面GMP-140表达明显增高和HDL-胆固醇呈负相关，与前β脂蛋白呈正相关，说明血小板激活可能依赖于脂代谢紊乱。
血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）是一种膜糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成，是一种重要的内皮保护因子和抗凝分子，正常生理情况下血管内皮细胞不分泌和释放TM，只有出现血管内皮细胞损伤时，TM降解段会释放入血。故TM可作为血管内皮损伤和破坏的一个标志[11]。有文献[12]也表明，股骨头坏死前后TM有明显变化，说明在股骨头坏死过程中存在血管内皮细胞损伤。
OPG是一种新的肿瘤坏死因子，在体内多器官中都有较高水平的表达。骨骼中的OPG主要由成骨细胞谱系的各种细胞产生，随细胞的分化而增加。OPG能促进成骨细胞样细胞分化为成熟的成骨细胞，激发成骨细胞的成骨活性。同时又可抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡[13]。体外实验也证实，OPG抑制破骨细胞前体细胞的分化以及成熟破骨细胞形成骨吸收陷窝，并诱导破骨细胞凋亡[14]。有研究报道，OPG还可通过减少内皮细胞凋亡从而对其起到保护作用，而激素可抑制OPG mRNA的表达，使OPG表达下调，加重细胞内皮损伤，导致微血管血栓形成[15]。
3.2 ESWT的作用 激素性股骨头缺血坏死的病变是因脂代谢紊乱使血管内皮细胞损伤，血流淤滞缓慢，诱发血小板聚集，易形成血栓。同时脂肪代谢紊乱致股骨头内脂肪占位挤压微血管，加剧血管栓塞和血栓形成，最终使股骨头内血管栓塞，骨细胞缺血坏死而致骨丢失，表现为软骨下骨囊性变，股骨头塌陷[4]。ESWT经临床证实可治疗股骨头缺血坏死，其作用机制可能是通过影响机体生物学环境和细胞因子的调节而发挥作用。有学者的研究发现，体外冲击波治疗后骨坏死区出现明显的成骨过程，且伴有血管内皮生长因子表达增多[16-17]。Takahashi等[18]也发现，体外冲击波可促使成骨细胞表达细胞外基质蛋白相关基因从而促进成骨。王大伟等[19]研究发现三七总皂苷可干预股骨头缺血性坏死兔骨保护骨素基囚的表达，从而起到治疗作用。
本实验通过对兔进行激素造模，观察到A组各个时间点股骨头坏死局部OPG表达较B组均低，且随着时间推移逐渐降低，并逐渐出现成骨细胞核固缩、空骨陷窝增加等典型的激素性股骨头坏死病变。而B股骨头局部OPG表达均较A组增强，也未出现典型骨坏死病理改变，说明ESWT对股骨头缺血坏死的过程有干预作用，可能是ESWT干预了激素对OPG转录及表达的抑制作用，或是直接促进OPG的转录和表达，从而阻断兔激素性股骨头坏死骨丢失这一过程。在ESWT干预第2周时B组GMP-140、TM均较A组降低，OPG含量B组较A组无明显变化；第4周及8周时B组GMP-140、TM均较A组降低，OPG含量较A组高，可能是ESWT对GMP-140、TM表达直接的抑制作用或是通过其他途径间接致其表达降低，ESWT对局部OPG表达有优先促进作用或是通过直接促进局部OPG表达进而使血浆中OPG含量增高。
综上所述，ESWT可干预兔激素性股骨头缺血坏死的病变过程，本实验结果显示对实验动物血浆中的GMP-140、TM、OPG的表达有影响，但究竟是直接作用还是间接干预仍不十分清楚，还有待进一步研究。
参考文献
[1]孔繁荣，秦树光，李建军，等.体外冲击波治疗股骨头缺血性坏死的疗效观察[J].中国康复医学杂志，2009，23（9）：846-848.
[2] Yamamoto T，Hirano K，Tsutsui H，et al.Corticosteroid enhances the experimental induction of osteonecrosis in rabbits with shwartzman reaction[J].Clin Orthop Relat Res，1995，32（316）：235-243.
[3]魏立友，孟和，徐文娟，等.股骨头缺血性坏死病因相关性研究[J].实用骨科杂志，2011，17（5）：423-426.
[4] Wang C J.Extracorporeal shockwave therapy in musculoskeletal disorders[J].J Orthop Surg Res，2012，7（5）：11.
[5] Lee M S，Hsieh P H，Shih C H，et al.Non-traumatic osteonecrosis of the femoral head - from clinical to bench[J].Chang Gung Med J，2010，33（4）：351-360.
[6]邵阳，赵晓艳，马勇.激素性股骨头坏死发病机制的研究进展[J].中国中医骨伤科杂志，2012，19（8）：88-90.
[7]李平，刘强.高凝低纤溶状态与激素性股骨头缺血坏死[J].骨科，2011，16（3）：169-170. [8] Kang P，Shen B，Yang J，et al.Circulating platelet-derived microparticles and endothelium-derived microparticles may be a potential cause of microthrombosis in patients with osteonecrosis of the femoral head[J].Thromb Res，2008，123（2）：367-373.
[9] Wei Y，Wu Z H，Qiu G X，et al.Impacts of microparticles on vascular endothelial cells[J].National Medical Journal of China，2008，88（11）：754-759.
[10]王志军，柯元南，程文立，等.阿托伐他汀对高脂大鼠血小板功能的干预研究[J].中日友好医院学报，2007，20（6）：345-348.
[11] Martin F A，Murphy R P，Cummins P M.Thrombomodulin and the vascular endothelium： insights into functional， regulatory， and therapeutic aspects[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，304（12）：H1585-H1597.
[12]辛大森，姜文学.股骨头坏死相关标志物研究进展[J].国际骨科学杂志，2013，49（5）：329-332.
[13] Kim H K，Morgan-Bagley S，Kostenuik P.Rankl inhibition： a novel strategy to decrease femoral head deformity after ischemic osteonecrosis[J].J Bone Miner Res，2006，21（12）：1946-1954.
[14] Schoppet M，Preissner K T，Hofbauer L C.Rank ligand and osteoprotegerin： paracrine regulators of bone metabolism and vascular function[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，22（4）：549-553.
[15]宋奕，丁道芳，李玲慧，等.细胞凋亡在激素性股骨头坏死机制中的研究进展[J].中国矫形外科杂志，2013，25（21）：2163-2165.
[16]郭小波，李平，卢向东，等.体外冲击波对兔缺血坏死股骨头血管内皮生长因子表达的研究[J].山西医药杂志，2009，52（3）：210-212.
[17]韩永斌，李平.体外冲击波对兔激素性股骨头坏死中opg含量及表达的影响[J].中国医疗前沿，2011，5（21）：33-34.
[18]Takahashi K，Yamazaki M，Saisu T，et al.Gene expression for extracellular matrix proteins in shockwave-induced osteogenesis in rats[J].Calcif Tissue Int，2004，74（2）：187-193.
[19]王大伟，史宝明，李小峰，等.三七总皂苷干预股骨头缺血性坏死兔成骨细胞护骨素基因的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，14（20）：3728-3732.
（收稿日期：2014-05-28） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 股骨头坏死； 体外冲击波； 骨保护素； 血小板α-颗粒膜蛋白； 血栓调节蛋白
激素性股骨头缺血坏死（Steroid induced Avascular Necrosis of Femoral Head，SANFH）居非创伤性股骨头缺血坏死诸多病因首位，尽管人工关节置换效果满意，但对于年轻或不能行手术的患者，治疗上仍是骨科的难题。体外冲击波治疗（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）经证实对股骨头缺血坏死有效，但其治疗机制仍不十分清楚[1]。本文旨在观察体外冲击波对GMP-140、TM、OPG表达的影响，探讨体外冲击波疗法的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 健康成年日本大耳兔50只，体重2.5～3.5 kg，雄性（由山西医科大学实验动物中心提供），颗粒饲料分笼喂养。大肠杆菌脂多糖（LPS，Sigma公司）；甲泼尼龙琥珀酸钠（MP，辉瑞公司）；OPG分析试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）；OPG兔抗鼠多克隆抗体（北京中山生物技术公司），GMP-140试剂盒（上海太阳生物技术公司），TM试剂盒（American Diagostica公司），SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；冲击波骨科治疗机（深圳慧康医疗器械有限公司，HK.ESWOAJII型）。
1.2 造模及分组 健康成年雄性日本大耳兔50只，造模方法采用Yamamoto法[2]，于兔耳缘静脉注射LPS（10 μg/kg），24 h后重复给药1次；在第2次注射大肠杆菌内毒素后，立即臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠（40 mg/kg），共3次，每次间隔24 h（每次给药前均测量体重，调整剂量）；注射激素期间青霉素20万单位/kg臀肌注射，预防感染。造模完成后随机选取2只兔予以空气栓塞法处死，留取股骨头，10%甲醛固定，脱钙液进行脱钙，脱钙满意后纵行剖开，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察股骨头见：部分骨小梁变细，空骨陷窝较多，骨小梁内脂滴较多，证明股骨头有坏死，造模成功。将造模后的动物按随机数字表法分为模型对照组（A组）和冲击波治疗组（B组），每组24只，各组动物相同条件喂养。
1.3 ESWT干预 B组麻醉后，股骨头区剃毛、涂抹耦合剂，X线透视定位确定冲击波焦点，电压10.5 kV，频率70次/min，15 min/次，1次/d，共5次，给予冲击波干预。
1.4 标本采集与检测 ESWT干预前各组随机选取8只兔耳动脉采血2～4 mL，缓慢加入含有200 μL 20%EDTA-Na2的试管中，离心处理（3000 r/min，离心10 min），取上层血浆，置于-80 ℃冰箱保存；ESWT干预2、4、8周时分别于各组随机抽取8只兔，耳动脉采血2～4 mL后依前法处理后保存；空气栓塞法处死兔，留取股骨头，10%甲醛固定，脱钙液进行脱钙，脱钙满意后纵行剖开，石蜡包埋，切片，HE染色镜下观察股骨头病理变化；切片常规脱蜡、脱水后，SABC法免疫组织化学染色。以已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照，严格按说明书操作。光镜下免疫阳性细胞胞浆呈棕黄色，每个股骨头标本相同部位各切片2张，每张切片在高倍镜（400倍）下随机选取5个非重叠视野，采用BI-2000医学图像分析系统，计算每个视野中阳性染色面积占总视野面积的百分比并求其平均值。血浆中GMP-140、TM、OPG测量严格按照试剂盒说明操作。
1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用重复测量方差分析，组间均数间比较用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 股骨头组织形态学变化 大体标本：造模完成后股骨头纵剖面有含铁血黄素沉着，软骨下可见囊性变；A组股骨头在各个观察时间点与造模完成时无明显变化；ESWT干预2周时B组股骨头软骨下囊性变较干预前减轻；ESWT干预4周时B组股骨头表面光滑、软骨下病变较前减轻；干预8周后B组股骨头软骨面平滑，软骨下病变不明显。
2.2 两组HE染色变化 A组镜下可见骨小梁稀疏、断裂，成骨细胞核固缩，骨细胞空骨陷窝>50%，且随着实验时间的推移，镜下所见基本相同。ESWT干预2周时B组可见散在的骨髓细胞结构模糊、淡染的粉红色区域及空骨陷窝；干预4周时B组成骨细胞清晰可见，空骨陷窝较2周前减少；干预8周时镜下可见B组空骨陷窝很少见，骨小梁排布趋于正常。
2.3 两组血浆中GMP-140、TM、OPG含量变化 ESWT干预2、4、8周后，B组血浆中GMP-140、TM含量较A组均降低（P<0.05）。ESWT干预2周后两组血浆中OPG含量变化不明显（P>0.05）；4、8周时B组血浆中OPG含量较A组均升高（P<0.05） 2.4 两组股骨头中OPG阳性表达 ESWT干预2、4、8周时A组股骨头中OPG表达均低于B组同时间点（P<0.05）。
3 讨论
股骨头缺血坏死多发于30～59岁的中青年，激素所致的股骨头坏死是最常见原因之一[3]。其发病机制多与激素导致的脂代谢紊乱、血管内皮细胞损伤及骨质疏松等有关，而脂质代谢紊乱、高凝低纤溶状态正是股骨头缺血坏死的病理生理学基础[4-7]。
3.1 GMP-140、TM和OPG的生物学特性 GMP-140主要分布在α-颗粒膜上，在血小板活化后，α-颗粒可迅速与血小板膜融合并释放，使GMP-140重新分布于血小板表面，故GMP-140在血小板表面的表达是血小板活化的特异性标志物之一[8]。有文献[9]报道，GMP-140较β-血栓球蛋白等其他指标更能准确反映体内血小板的活化状态。也有文献[10]报道，血小板表面GMP-140表达明显增高和HDL-胆固醇呈负相关，与前β脂蛋白呈正相关，说明血小板激活可能依赖于脂代谢紊乱。
血栓调节蛋白（Thrombomodulin，TM）是一种膜糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成，是一种重要的内皮保护因子和抗凝分子，正常生理情况下血管内皮细胞不分泌和释放TM，只有出现血管内皮细胞损伤时，TM降解段会释放入血。故TM可作为血管内皮损伤和破坏的一个标志[11]。有文献[12]也表明，股骨头坏死前后TM有明显变化，说明在股骨头坏死过程中存在血管内皮细胞损伤。
OPG是一种新的肿瘤坏死因子，在体内多器官中都有较高水平的表达。骨骼中的OPG主要由成骨细胞谱系的各种细胞产生，随细胞的分化而增加。OPG能促进成骨细胞样细胞分化为成熟的成骨细胞，激发成骨细胞的成骨活性。同时又可抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡[13]。体外实验也证实，OPG抑制破骨细胞前体细胞的分化以及成熟破骨细胞形成骨吸收陷窝，并诱导破骨细胞凋亡[14]。有研究报道，OPG还可通过减少内皮细胞凋亡从而对其起到保护作用，而激素可抑制OPG mRNA的表达，使OPG表达下调，加重细胞内皮损伤，导致微血管血栓形成[15]。
3.2 ESWT的作用 激素性股骨头缺血坏死的病变是因脂代谢紊乱使血管内皮细胞损伤，血流淤滞缓慢，诱发血小板聚集，易形成血栓。同时脂肪代谢紊乱致股骨头内脂肪占位挤压微血管，加剧血管栓塞和血栓形成，最终使股骨头内血管栓塞，骨细胞缺血坏死而致骨丢失，表现为软骨下骨囊性变，股骨头塌陷[4]。ESWT经临床证实可治疗股骨头缺血坏死，其作用机制可能是通过影响机体生物学环境和细胞因子的调节而发挥作用。有学者的研究发现，体外冲击波治疗后骨坏死区出现明显的成骨过程，且伴有血管内皮生长因子表达增多[16-17]。Takahashi等[18]也发现，体外冲击波可促使成骨细胞表达细胞外基质蛋白相关基因从而促进成骨。王大伟等[19]研究发现三七总皂苷可干预股骨头缺血性坏死兔骨保护骨素基囚的表达，从而起到治疗作用。
本实验通过对兔进行激素造模，观察到A组各个时间点股骨头坏死局部OPG表达较B组均低，且随着时间推移逐渐降低，并逐渐出现成骨细胞核固缩、空骨陷窝增加等典型的激素性股骨头坏死病变。而B股骨头局部OPG表达均较A组增强，也未出现典型骨坏死病理改变，说明ESWT对股骨头缺血坏死的过程有干预作用，可能是ESWT干预了激素对OPG转录及表达的抑制作用，或是直接促进OPG的转录和表达，从而阻断兔激素性股骨头坏死骨丢失这一过程。在ESWT干预第2周时B组GMP-140、TM均较A组降低，OPG含量B组较A组无明显变化；第4周及8周时B组GMP-140、TM均较A组降低，OPG含量较A组高，可能是ESWT对GMP-140、TM表达直接的抑制作用或是通过其他途径间接致其表达降低，ESWT对局部OPG表达有优先促进作用或是通过直接促进局部OPG表达进而使血浆中OPG含量增高。
综上所述，ESWT可干预兔激素性股骨头缺血坏死的病变过程，本实验结果显示对实验动物血浆中的GMP-140、TM、OPG的表达有影响，但究竟是直接作用还是间接干预仍不十分清楚，还有待进一步研究。
参考文献
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（收稿日期：2014-05-28） （本文编辑：蔡元元）