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2，李琳1，徐明亮3，高岱岳1，王丽丽1，李志强4，郭宇洁2，金龙2，任烨2
1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091；
3.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150080；4.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222002
摘要：目的 研究降糖消脂片对糖尿病大鼠视网膜病变的作用。方法 SD大鼠以链脲佐菌素50 mg/kg腹腔注射造模。3 d后测定血糖，筛选成模大鼠。将造模成功大鼠随机分为模型组、空白组、阳性药组及降糖消脂片低、中、高剂量组，每组12只。降糖消脂片低、中、高剂量组分别给予降糖消脂片2、4、8 g/kg体质量，阳性药组给予二甲双胍0.3 g/kg体质量，模型组和空白组给予等体积蒸馏水。给药8周后处死大鼠，分离视网膜，进行PAS染色，观察各组血管形态，计数非细胞血管、血管密度、血管条索数、血管周细胞与内皮细胞数量。结果 降糖消脂片各剂量组给药后能明显保持视网膜血管网的生理结构，明显减少视网膜非细胞血管数、降低血管密度、减少血管条索数、增高周细胞与内皮细胞比值。结论 降糖消脂片对糖尿病视网膜血管具有明显的保护作用。
关键词：降糖消脂片；视网膜毛细血管；糖尿病视网膜血管病变；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0036-03
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其发病率随年龄增长和糖尿病病程延长而增加。据统计，有10年糖尿病史者，7%并发DR，15年者约25%，15年以上者达63%，DR是成年人失明的重要原因[1]。实验研究表明，降糖消脂片对糖尿病模型动物具有明显的降糖作用[2]，但在血糖水平降低的同时，是否对DR具有防治作用，尚
基金项目：综合性中药新药研究开发技术大平台（2009ZX09301-005-007）；重大新药创制-中药医院制剂新药研发（2010ZX09102-213）
未进行研究。本实验采用链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）致大鼠糖尿病模型，观察了降糖消脂片对视网膜血管的保护作用。
1 实验材料
1.1 动物
SD大鼠，雄性，体质量180～220 g。购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0007。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房内[SCXK（京） 2008-0019]。饲养环境：温度20 ℃，照明时间12 h昼夜交替。
1.2 药物
降糖消脂片浸膏，含原药材3.37 g/g，中国中医科学院西苑医院实验研究中心药化室提供，批号050401。盐酸二甲双胍片，北京协和药厂，批号H11020976。
1.3 主要试剂
STZ（Sigma公司，北京莱伯赫斯生物技术有限公司分装，批号S0130），柠檬酸、柠檬酸钠（国药集团化学试剂有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司）。
1.4 仪器
恒温水浴箱（型号XMTE-8112，上海精宏实验设备有限公司），拜安康血糖仪（拜耳医药保健有限公司），拜安康血糖试纸（拜耳医药保健有限公司），Leica生物显微镜（型号DM500）。
2 实验方法
2.1 造模
100只SD大鼠适应性喂养1周，禁食过夜18 h，次日测空腹血糖，作为造模前的基础血糖。取12只作为空白组，另88只大鼠经腹腔注射STZ（0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解STZ，配制后15 min内给药），剂量为50 mg/kg体质量。给药72 h后，禁食12 h，测空腹血糖，以血糖>16.7 mmol/L为造模成功。空白组仅腹腔注射等体积0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。
2.2 分组与给药
将造模成功大鼠分为模型组、阳性药组及降糖消脂片高（8 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）剂量组，每组12只。正常饲料喂养，自由摄水和饮食。将降糖消脂片内容物溶于蒸馏水，配制成高、中、低浓度药液（0.8、0.4、0.2 g/mL）灌胃给药，空白组和模型组予等体积蒸馏水灌胃，阳性药组二甲双胍0.3 g/kg（按成人剂量换算）灌胃。连续给药8周。
2.3 视网膜毛细血管消化与铺片
末次给药后各组大鼠禁食水12 h，乙醚麻醉，脊椎脱臼法处死大鼠，摘除大鼠左右眼球，分别置于10%福尔马林溶液中，4 ℃固定24 h以上。充分水洗后，沿锯齿缘环形剪开眼球，在蒸馏水中分离视网膜，剪成4份以备消化铺片。视网膜毛细血管消化及铺片参照文献[3]方法操作。将分离好的视网膜组织放入3%胰蛋白酶37 ℃消化，每小时观察1次消化情况。待视网膜组织完全消化，仅剩血管网时，将视网膜移至蒸馏水中轻轻漂洗，在体视显微镜下观察血管网的状况，出现一层薄的半透明血管网即为消化成功。将消化好的视网膜移至防脱载玻片上，室温风干，进行PAS染色和苏木素复染，中性树胶封片。
2.4 视网膜毛细血管形态学观察
将染色后的玻片置于Leica DM500生物显微镜下，分别以×200和×400不同放大倍率，观察各组视网膜血管的排列状况、形态结构以及分布走行等病理变化。上述观察的同时，参照文献[4-5]方法，每只大鼠均按照×400的放大倍数，随机存储5个视野的图像，用ImagPro Plus 6.0图像软件读入图像，进行视网膜非细胞血管、血管周细胞、内皮细胞以及血管面积和血管条索的计数。各视野毛细血管面积除以视野总面积，得到毛细血管面积与视野总面积的比值，作为血管密度值。 3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，并进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 视网膜毛细血管的病理形态学观察
空白组大鼠视网膜毛细血管网分布均匀规则，内皮细胞胞核较长多呈梭形，染色较浅，周细胞呈圆形或三角形，染色较深。模型组大鼠视网膜毛细血管排列紊乱，毛细血管管径粗细不均匀，可见内皮细胞增生，周细胞减少。降糖消脂片低、中、高剂量组毛细血管的分布较均匀，血管形态较规则，未见明显扭曲和扩张，内皮细胞的增生状况不明显。见图1。
注：A.模型组；B.空白组；C.阳性药组；
D～F.降糖消脂片低、中、高剂量组
图1 各组大鼠给药后视网膜血管形态学比较（×400）
4.2 视网膜非细胞血管计数
模型组可见大量非细胞血管，降糖消脂片高、中、低剂量组非细胞血管数量明显减少，高、中、低剂量组与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），低剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。阳性药组与模型组比较，非细胞血管数亦显著减少（P<0.01）。与阳性药组比较，降糖消脂片高、中、低剂量组阻止非细胞血管发生作用与阳性药二甲双胍作用相当（P>0.05）。结果见图2。
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01（下同）
4.3 视网膜单位面积毛细血管密度比较
与模型组比较，降糖消脂片中、高剂量组血管密度值比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与阳性药组比较，降糖消脂片高、中、低剂量组血管密度比值差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图3。
4.4 血管条索数的变化
将PAS染色后的切片在显微镜下随机选取不同视野的图像储存，统计各视野中纵、横血管条索数。结果表明，与模型组比较，阳性药组及降糖消脂片低、中、高剂量组差异均有统计学意义（P<0.01）。结果见图4。
图4 各组血管条索数比较
4.5 血管周细胞数和内皮细胞数比值
对各组大鼠视网膜染色结果中的血管周细胞和内皮细胞数量进行统计，计算内皮细胞数和周细胞数（E/P）的百分比。结果表明，模型组周细胞数明显减少，内皮细胞数增多。阳性药组及降糖消脂片高、中、低剂量组能明显控制血管周细胞的缺失，其E/P比值与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图5。
5 讨论
DR是糖尿病最主要的微血管并发症之一，是导致成人失明的重要原因[6]。流行病学研究表明，糖尿病患者确诊20年后，绝大部分的1型糖尿病患者合并DR，80%的胰岛素依赖的2型糖尿病患者和50%的非胰岛素依赖的2型糖尿病患者发生DR[9]。目前DR尚无特效的治疗药物，中医药在防治糖尿病视网膜病变的方面具有一定的优势[8-10]。
降糖消脂片为纯中药制，以往的研究表明，其对糖尿病大鼠具有良好的降糖作用[2]。本实验采用大鼠腹腔注射STZ造模，并设立空白组（正常大鼠），从给药各组的情况看，降糖消脂片低、中、高剂量组给药后在保持血管形态学的特征方面与空白组相似，而与模型组比较差异明显，说明降糖消脂片对于保持糖尿病大鼠的视网膜整体血管的完整性方面具有明显作用。
DR中，由于高血糖的刺激，血管通透性、细胞、血管数量等均发生变化，因而视网膜血液循环障碍的改变较为常见[11]。本实验模型组大鼠可见大量无血流的纤细非细胞血管，微血管呈扩张状态，血管密度及条索数增加，表明在高血糖状态下，视网膜血管受到损伤，造成了视网膜血液循环障碍。降糖消脂片低、中、高剂量组大鼠与模型组大鼠比较，视网膜非细胞血管数量明显减少、血管密度及条索数降低，其作用以高剂量最好，中剂量次之，低剂量作用最弱，存在明显的量效关系。显示降糖消脂片能显著减少高血糖状态对血管的损伤，保护视网膜的微循环功能。降糖消脂片高剂量组的保护作用与阳性药二甲双胍相当，2组差异无统计学意义（P>0.05）。
本实验研究表明，降糖消脂片对于STZ诱导的大鼠糖尿病模型视网膜血管病变具有良好的控制作用，显示了降糖消脂片在防治DR方面的临床应用前景。
参考文献：
[1] 易茜璐，于明香.糖尿病视网膜病变的发病机制[J].复旦学报：医学版，2010，37（5）：604-608.
[2] 葛争艳，金龙，闫爱国，等.降糖消脂片对糖尿病动物降糖作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（16）：143-146.
[3] Stitt A， Gardiner TA， Alderson NL， et al. The AGE inhibitor pyridoxamine inhibits development of retinopathy in experimental diabetes[J]. Diabetes，2002，51（9）：2826-2832.
[4] Robison WG， Laver NM， Jacot JL， et al. Efficacy of treatment after measurable diabeticlike retinopathy in galactose-fed rats[J]. Invest Opthalmol vis Sci，1997，38（6）：1066-1073.
[5] Hammes HP， Lin J， Wagner P， et al. Angiopoietin-2 causes pericyte dropout in the normal retina evidence for involvement in diabetic retinopathy[J]. Diabetes，2004，53（4）：1104-1110.
[6] Marshall SM， Flyvbjerg A. Prevention and early detection of vascular complications of diabetes[J]. BMJ，2006，333：475-480.
[7] Klein R， Klein BE， Moss SE. Epidemiology of proliferative diabetic retinopathy[J]. Diabetes Care，1992，15：1875-1891.
[8] 遇颖，杨明，张庆生，等.葛根素对糖尿病大鼠视网膜病变的影响[J].黑龙江医药科学，2009，32（2）：1-2.
[9] 刘中文，杨涛，谭洪辉.补阳还五汤对糖尿病大鼠视网膜病变的干预研究[J].中国中医药现代远程教育，2010，8（3）：173-174.
[10] 邵永红.糖尿病视网膜病变的中医药治疗[J].吉林中医药，2012， 32（5）：464-465.
[11] David AA， Ronald K， Thomas WG. Diabetic Retinopathy[J]. N Engl J Med，2012，366：1227-1239.
（收稿日期：2012-07-11，编辑：华强）
1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.中国中医科学院西苑医院实验研究中心，北京 100091；
3.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150080；4.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222002
摘要：目的 研究降糖消脂片对糖尿病大鼠视网膜病变的作用。方法 SD大鼠以链脲佐菌素50 mg/kg腹腔注射造模。3 d后测定血糖，筛选成模大鼠。将造模成功大鼠随机分为模型组、空白组、阳性药组及降糖消脂片低、中、高剂量组，每组12只。降糖消脂片低、中、高剂量组分别给予降糖消脂片2、4、8 g/kg体质量，阳性药组给予二甲双胍0.3 g/kg体质量，模型组和空白组给予等体积蒸馏水。给药8周后处死大鼠，分离视网膜，进行PAS染色，观察各组血管形态，计数非细胞血管、血管密度、血管条索数、血管周细胞与内皮细胞数量。结果 降糖消脂片各剂量组给药后能明显保持视网膜血管网的生理结构，明显减少视网膜非细胞血管数、降低血管密度、减少血管条索数、增高周细胞与内皮细胞比值。结论 降糖消脂片对糖尿病视网膜血管具有明显的保护作用。
关键词：降糖消脂片；视网膜毛细血管；糖尿病视网膜血管病变；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0036-03
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，其发病率随年龄增长和糖尿病病程延长而增加。据统计，有10年糖尿病史者，7%并发DR，15年者约25%，15年以上者达63%，DR是成年人失明的重要原因[1]。实验研究表明，降糖消脂片对糖尿病模型动物具有明显的降糖作用[2]，但在血糖水平降低的同时，是否对DR具有防治作用，尚
基金项目：综合性中药新药研究开发技术大平台（2009ZX09301-005-007）；重大新药创制-中药医院制剂新药研发（2010ZX09102-213）
未进行研究。本实验采用链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）致大鼠糖尿病模型，观察了降糖消脂片对视网膜血管的保护作用。
1 实验材料
1.1 动物
SD大鼠，雄性，体质量180～220 g。购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0007。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房内[SCXK（京） 2008-0019]。饲养环境：温度20 ℃，照明时间12 h昼夜交替。
1.2 药物
降糖消脂片浸膏，含原药材3.37 g/g，中国中医科学院西苑医院实验研究中心药化室提供，批号050401。盐酸二甲双胍片，北京协和药厂，批号H11020976。
1.3 主要试剂
STZ（Sigma公司，北京莱伯赫斯生物技术有限公司分装，批号S0130），柠檬酸、柠檬酸钠（国药集团化学试剂有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司）。
1.4 仪器
恒温水浴箱（型号XMTE-8112，上海精宏实验设备有限公司），拜安康血糖仪（拜耳医药保健有限公司），拜安康血糖试纸（拜耳医药保健有限公司），Leica生物显微镜（型号DM500）。
2 实验方法
2.1 造模
100只SD大鼠适应性喂养1周，禁食过夜18 h，次日测空腹血糖，作为造模前的基础血糖。取12只作为空白组，另88只大鼠经腹腔注射STZ（0.1 mol/L柠檬酸缓冲液溶解STZ，配制后15 min内给药），剂量为50 mg/kg体质量。给药72 h后，禁食12 h，测空腹血糖，以血糖>16.7 mmol/L为造模成功。空白组仅腹腔注射等体积0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。
2.2 分组与给药
将造模成功大鼠分为模型组、阳性药组及降糖消脂片高（8 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）剂量组，每组12只。正常饲料喂养，自由摄水和饮食。将降糖消脂片内容物溶于蒸馏水，配制成高、中、低浓度药液（0.8、0.4、0.2 g/mL）灌胃给药，空白组和模型组予等体积蒸馏水灌胃，阳性药组二甲双胍0.3 g/kg（按成人剂量换算）灌胃。连续给药8周。
2.3 视网膜毛细血管消化与铺片
末次给药后各组大鼠禁食水12 h，乙醚麻醉，脊椎脱臼法处死大鼠，摘除大鼠左右眼球，分别置于10%福尔马林溶液中，4 ℃固定24 h以上。充分水洗后，沿锯齿缘环形剪开眼球，在蒸馏水中分离视网膜，剪成4份以备消化铺片。视网膜毛细血管消化及铺片参照文献[3]方法操作。将分离好的视网膜组织放入3%胰蛋白酶37 ℃消化，每小时观察1次消化情况。待视网膜组织完全消化，仅剩血管网时，将视网膜移至蒸馏水中轻轻漂洗，在体视显微镜下观察血管网的状况，出现一层薄的半透明血管网即为消化成功。将消化好的视网膜移至防脱载玻片上，室温风干，进行PAS染色和苏木素复染，中性树胶封片。
2.4 视网膜毛细血管形态学观察
将染色后的玻片置于Leica DM500生物显微镜下，分别以×200和×400不同放大倍率，观察各组视网膜血管的排列状况、形态结构以及分布走行等病理变化。上述观察的同时，参照文献[4-5]方法，每只大鼠均按照×400的放大倍数，随机存储5个视野的图像，用ImagPro Plus 6.0图像软件读入图像，进行视网膜非细胞血管、血管周细胞、内皮细胞以及血管面积和血管条索的计数。各视野毛细血管面积除以视野总面积，得到毛细血管面积与视野总面积的比值，作为血管密度值。 3 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，并进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 视网膜毛细血管的病理形态学观察
空白组大鼠视网膜毛细血管网分布均匀规则，内皮细胞胞核较长多呈梭形，染色较浅，周细胞呈圆形或三角形，染色较深。模型组大鼠视网膜毛细血管排列紊乱，毛细血管管径粗细不均匀，可见内皮细胞增生，周细胞减少。降糖消脂片低、中、高剂量组毛细血管的分布较均匀，血管形态较规则，未见明显扭曲和扩张，内皮细胞的增生状况不明显。见图1。
注：A.模型组；B.空白组；C.阳性药组；
D～F.降糖消脂片低、中、高剂量组
图1 各组大鼠给药后视网膜血管形态学比较（×400）
4.2 视网膜非细胞血管计数
模型组可见大量非细胞血管，降糖消脂片高、中、低剂量组非细胞血管数量明显减少，高、中、低剂量组与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01），低剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。阳性药组与模型组比较，非细胞血管数亦显著减少（P<0.01）。与阳性药组比较，降糖消脂片高、中、低剂量组阻止非细胞血管发生作用与阳性药二甲双胍作用相当（P>0.05）。结果见图2。
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01（下同）
4.3 视网膜单位面积毛细血管密度比较
与模型组比较，降糖消脂片中、高剂量组血管密度值比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与阳性药组比较，降糖消脂片高、中、低剂量组血管密度比值差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图3。
4.4 血管条索数的变化
将PAS染色后的切片在显微镜下随机选取不同视野的图像储存，统计各视野中纵、横血管条索数。结果表明，与模型组比较，阳性药组及降糖消脂片低、中、高剂量组差异均有统计学意义（P<0.01）。结果见图4。
图4 各组血管条索数比较
4.5 血管周细胞数和内皮细胞数比值
对各组大鼠视网膜染色结果中的血管周细胞和内皮细胞数量进行统计，计算内皮细胞数和周细胞数（E/P）的百分比。结果表明，模型组周细胞数明显减少，内皮细胞数增多。阳性药组及降糖消脂片高、中、低剂量组能明显控制血管周细胞的缺失，其E/P比值与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图5。
5 讨论
DR是糖尿病最主要的微血管并发症之一，是导致成人失明的重要原因[6]。流行病学研究表明，糖尿病患者确诊20年后，绝大部分的1型糖尿病患者合并DR，80%的胰岛素依赖的2型糖尿病患者和50%的非胰岛素依赖的2型糖尿病患者发生DR[9]。目前DR尚无特效的治疗药物，中医药在防治糖尿病视网膜病变的方面具有一定的优势[8-10]。
降糖消脂片为纯中药制，以往的研究表明，其对糖尿病大鼠具有良好的降糖作用[2]。本实验采用大鼠腹腔注射STZ造模，并设立空白组（正常大鼠），从给药各组的情况看，降糖消脂片低、中、高剂量组给药后在保持血管形态学的特征方面与空白组相似，而与模型组比较差异明显，说明降糖消脂片对于保持糖尿病大鼠的视网膜整体血管的完整性方面具有明显作用。
DR中，由于高血糖的刺激，血管通透性、细胞、血管数量等均发生变化，因而视网膜血液循环障碍的改变较为常见[11]。本实验模型组大鼠可见大量无血流的纤细非细胞血管，微血管呈扩张状态，血管密度及条索数增加，表明在高血糖状态下，视网膜血管受到损伤，造成了视网膜血液循环障碍。降糖消脂片低、中、高剂量组大鼠与模型组大鼠比较，视网膜非细胞血管数量明显减少、血管密度及条索数降低，其作用以高剂量最好，中剂量次之，低剂量作用最弱，存在明显的量效关系。显示降糖消脂片能显著减少高血糖状态对血管的损伤，保护视网膜的微循环功能。降糖消脂片高剂量组的保护作用与阳性药二甲双胍相当，2组差异无统计学意义（P>0.05）。
本实验研究表明，降糖消脂片对于STZ诱导的大鼠糖尿病模型视网膜血管病变具有良好的控制作用，显示了降糖消脂片在防治DR方面的临床应用前景。
参考文献：
[1] 易茜璐，于明香.糖尿病视网膜病变的发病机制[J].复旦学报：医学版，2010，37（5）：604-608.
[2] 葛争艳，金龙，闫爱国，等.降糖消脂片对糖尿病动物降糖作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（16）：143-146.
[3] Stitt A， Gardiner TA， Alderson NL， et al. The AGE inhibitor pyridoxamine inhibits development of retinopathy in experimental diabetes[J]. Diabetes，2002，51（9）：2826-2832.
[4] Robison WG， Laver NM， Jacot JL， et al. Efficacy of treatment after measurable diabeticlike retinopathy in galactose-fed rats[J]. Invest Opthalmol vis Sci，1997，38（6）：1066-1073.
[5] Hammes HP， Lin J， Wagner P， et al. Angiopoietin-2 causes pericyte dropout in the normal retina evidence for involvement in diabetic retinopathy[J]. Diabetes，2004，53（4）：1104-1110.
[6] Marshall SM， Flyvbjerg A. Prevention and early detection of vascular complications of diabetes[J]. BMJ，2006，333：475-480.
[7] Klein R， Klein BE， Moss SE. Epidemiology of proliferative diabetic retinopathy[J]. Diabetes Care，1992，15：1875-1891.
[8] 遇颖，杨明，张庆生，等.葛根素对糖尿病大鼠视网膜病变的影响[J].黑龙江医药科学，2009，32（2）：1-2.
[9] 刘中文，杨涛，谭洪辉.补阳还五汤对糖尿病大鼠视网膜病变的干预研究[J].中国中医药现代远程教育，2010，8（3）：173-174.
[10] 邵永红.糖尿病视网膜病变的中医药治疗[J].吉林中医药，2012， 32（5）：464-465.
[11] David AA， Ronald K， Thomas WG. Diabetic Retinopathy[J]. N Engl J Med，2012，366：1227-1239.
（收稿日期：2012-07-11，编辑：华强）