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摘 要：
以花生胚小叶为外植体，观察花生胚小叶在添加不同浓度卡那霉素的分化培养基上的生长状况，研究不同花生品种对卡那霉素的敏感性，以确定各品种的卡那霉素临界浓度。结果表明，在供试品种中，D16对卡那霉素最敏感，其临界浓度为100 mg/L；花育22对卡那霉素的耐受性最高，其临界浓度为200 mg/L；J11及鲁花11的卡那霉素临界浓度均为150 mg/L。
关键词：花生；胚小叶；卡那霉素；敏感性；临界值
中图分类号：S565.203.53 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0036-03
生 （Arachis hypogaea L.）是世界四大油料作物之一，在我国经济发展中占有重要地位，是我国重要的经济和油料作物[1]。近几年随着花生离体培养的快速发展，花生遗传转化也飞速发展着，农杆菌介导是花生遗传转化最常用的方法[2～4]。在转基因植株的初步检测中，抗生素筛选是最为常用的方法[5～10]，其中卡那霉素最为常用[4，6～16]。卡那霉素（Kanamycin，简称Km）能强烈抑制细胞生长，能够使多种植物绿色器官黄化；低浓度卡那霉素能够抑制植物细胞分化，高浓度卡那霉素则能够导致植物死亡[1，5，6，12，13]。在转基因植物筛选中，常用抗性基因作为标记基因[7，11，17]，NPTⅡ、HPT、CAT、SPT、Gent等是使用最多的抗生素抗性酶基因[18]。NPTⅡ（新霉素磷酸转移酶）基因是目前植物遗传转化中常用的标记基因，含有该基因的植物能够对卡那霉素产生抗性，从而存活下来[11，17，21]。
不同花生品种对卡那霉素的敏感程度不同，单世华等[1]对泉花10号和金花1012的带胚单子叶进行研究，得到的卡那霉素临界浓度为200 mg/L；庄振宏等[19]研究得到泉花10号花生小叶的临界卡那霉素浓度为150 mg/L；胡晓君等[20]的试验结果则表明，花生离体叶片的卡那霉素筛选浓度为400 mg/L，不同苗龄叶片对卡那霉素的敏感性不同。本试验研究了4个不同花生品种胚小叶对卡那霉素的敏感性，以期得到各品种的卡那霉素临界浓度，为其遗传转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
花生品种J11、花育22号、D16、鲁花11号，均由山东省花生研究所提供。
1.2 试剂
卡那霉素，购于上海生工；MS基本培养基（添加适量NAA、6-BA）、分化培养基、75%乙醇、0.1%升汞，所用药品或试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器设备
高温高压蒸汽灭菌锅，江南仪器厂；人工气候箱，宁波江南仪器厂；微量移液器，Enpendorf，德国；AA-680型原子吸收分光光度计，日本岛津；J-20XP高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司；PB303-N电子精密天平，梅特勒-托利多公司；79HW-1恒温磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器厂；PHS-3 pH计，上海精密仪器有限公司；超纯水系统，Millipore，美国。
1.4 试验方法
1.4.1 种子消毒 选取成熟饱满、活力高的花生种子，用自来水冲洗2～3次；在超净工作台上用75%乙醇消毒3次，1 min/次；然后用0.1%升汞浸泡10 min；再用无菌水漂洗3～4次，1 min/次，然后于无菌水中浸泡2～4 h。
1.4.2 外植体获得 在超净工作台上剥去消毒处理后的种子种皮，接种于MS基本培养基上，培养4～6 d后，切取花生胚小叶作为外植体。
1.4.3 敏感性试验 设卡那霉素浓度梯度：0、50、100、150、200 mg/L，在培养基高温高压灭菌并冷至65℃左右时加入。切取生长状况良好的胚小叶，接种于添加不同浓度卡那霉素的分化培养基上，培养3周后统计各品种外植体的白化率和出愈率。
白化率（%）=白化外植体数/接种总外植体数×100
出愈率（%）=产生愈伤组织外植体数/接种总外植体数×100
2 结果与分析
2.1 卡那霉素对不同品种花生出愈率的影响
由图1可以看出，Km浓度越高，出愈率越低；0、50 mg/L时，4个品种均能够产生愈伤组织；100 mg/L时，D16的出愈率为零，说明与其他3个品种相比，D16对Km最为敏感；当Km浓度达到150 mg/L时，只有花育22号还有愈伤组织产生，出愈率为10%，说明4个品种中，花育22号对Km最不敏感；但当Km浓度达到200 mg/L时，4个品种均不产生愈伤组织。
图1 各品种在不同Km浓度下的出愈率
2.2 卡那霉素对不同品种花生白化率的影响
由图2可以看出，在未添加Km的培养基上，各品种均无白化植株出现；Km浓度为50 mg/L时，花育22号仍无明显的白化株出现，而其他3个品种的白化率均超过了10%，D16的白化率最高，为33.33%；当Km浓度超过100 mg/L后，4个品种均有不同程度的白化。Km浓度越高，白化率越高，4个品种的白化率由高到低依次为D16>J11>鲁花11号>花育22号。
图2 各品种在Km不同浓度下的白化率
2.3 D16与花育22号在Km不同浓度下的生长状况比较
上述分析显示，4个品种中D16对Km最敏感，而花育22号对Km的耐受性最高。由两者培养3周后的生长状况（图3、图4）可以看出，两品种间差异明显，在添加50 mg/L Km的培养基上，花育22号产生愈伤组织的外植体数明显多于D16，而D16的白化率也明显高于花育22号。
图3 D16在Km不同浓度下的生长状况
图4 花育22号在Km不同浓度下的生长状况
3 讨论与结论 王萍等[5]研究表明，卡那霉素明显抑制大豆胚尖不定芽的形成，随浓度的增加而减少。刘方等[6]研究表明高浓度的卡那霉素抑制棉花体细胞胚的形成，而低浓度的作用较弱。任艳等[22]研究表明，抗生素浓度与抑菌效果呈正比，但与组培苗生长状况呈反比，因此选择适宜的抗生素浓度是必不可少的。不同基因型植物对卡那霉素的内源抗性有差异[7]。本试验结果显示，花育22号对Km的敏感性最弱，胚小叶在添加200 mg/L Km的培养基上出现明显变化；D16对Km敏感性最强，在添加50 mg/L Km 的培养基上即出现明显变化。
D16在Km 100 mg/L时不产生愈伤组织，丧失分化能力，且白化率达到45%，因此，确定其Km临界浓度为100 mg/L；依此确定J11、鲁花11号、花育22号的Km临界值分别为150、150、200 mg/L。但本试验得出的Km临界浓度仅为理论值，实际的使用浓度还有待进一步试验确定。
参 考 文 献：
[1]
单世华，李春娟，刘思衡，等. 以农杆菌为介导花生遗传转化研究[J]. 中国油料作物学报，2003，25（1）：9-13.
[2] 许泽永. 花生转化和再生研究进展[J]. 农业生物技术学报，2001，9（2）：107-111.
[3] 周桂元，梁炫强，李一聪，等. 国内外花生遗传转化研究的现状[J]. 作物杂志，1999（1）：1-3.
[4] 梁丽琨，由翠荣，林荣双，等. 花生基因工程[J]. 生物学通报，2005，40（10）：3-5.
[5] 王萍，张淑珍，李文滨，等. 大豆不同品种基因型胚尖不定芽的诱导及对抗生素的敏感性[J]. 作物杂志，2010（2）：50-53.
[6] 刘方，张宝红，姚长兵，等. 卡那霉素对棉花胚性愈伤组织生长发育的影响[J]. 棉花学报，1999，11（2）：70-72.
[7] 张静妮，马晖玲，曹志忠. 紫花苜蓿不同品种对卡那霉素敏感性分析[J]. 草原与草坪，2005（5）：30-33.
[8] 卢龙斗，李爱花，彭仁海，等. 茶菊再生体系及其卡那霉素筛选体系的建立[J]. 安徽农业科学，2009，37（21）：9872-9875.
[9] 徐鹏飞，张淑珍，吴俊江，等. 利用卡那霉素对花粉管通道法转基因大豆的筛选研究[J]. 大豆科学，2006（3）：275-278.
[10]彭金库，徐青青，周莉凡，等. 卡那霉素和潮霉素对芦竹不定芽诱导与生长的影响[J]. 安徽农业科学，2011，39（15）：8858-8860.
[11]李玲. 杨树对卡那霉素（Kanamycin）敏感性的测定[J]. 林业科学，1992，28（1）：95-96.
[12]刘玉汇，张俊莲，王蒂，等. 不同烟草品种对卡那霉素抗性及耐盐性的差异[J].中国农学通报，2008，24（3）：180-185.
[13]尹智慧，宋丽莉，司亮，等. 大岩桐叶片再生体系的建立及卡那霉素敏感性研究[J]. 北方园艺，2013（10）：100-102.
[14]张寅玲，刘艳军，张伟玉，等. 番茄基因转化中抗生素筛选压力的确定办法[J]. 西南园艺，2005，33（5）：4-6.
[15]周春丽，郭卫东，张燕燕. 佛手组织培养和Km敏感性试验[J]. 西北林学院学报，2005，20（4）：76-79.
[16]魏爱民，张文珠，杜胜利，等. 黄瓜花粉管通道法抗虫基因导入及卡那霉素抗性筛选[J]. 华北农学报，2008，23（6）：54-57.
[17]de Vries J， Wackernagel W.Detection of nptⅡ（Kanamycin resistance） genes in genomes of transgenic plants by marker-rescue transformation[J].Mol. Gen. Genet.， 1998， 257（6）： 606-613.
[18]侯爱菊，朱延明，张晶，等. 转基因植物中筛选标记基因的利用及消除[J]. 遗传，2003，25（4）：466-470.
[19]庄振宏，朱锦懋，陈由强，等. 花生再生和转化体系的初步研究[J]. 福建师范大学学报（自然科学版），2001，17（4）：88-113.
[20]胡晓君，刘风珍，万勇善，等. 花生组织培养及苗期nptⅡ标记基因筛选剂适宜浓度的研究[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），2007，38（1）：28-34.
[21]Nap J P，Bijvoet J，Stiekema W J. 转基因植物中的卡那霉素抗性[J]. 司家钢译. 生物技术通报，1998（1）：29-31.
[22]任艳，王辉，石延茂，等. 抗生素在花生组织培养中的抑菌效应研究[J]. 山东农业科学，2011（10）：74-75.
以花生胚小叶为外植体，观察花生胚小叶在添加不同浓度卡那霉素的分化培养基上的生长状况，研究不同花生品种对卡那霉素的敏感性，以确定各品种的卡那霉素临界浓度。结果表明，在供试品种中，D16对卡那霉素最敏感，其临界浓度为100 mg/L；花育22对卡那霉素的耐受性最高，其临界浓度为200 mg/L；J11及鲁花11的卡那霉素临界浓度均为150 mg/L。
关键词：花生；胚小叶；卡那霉素；敏感性；临界值
中图分类号：S565.203.53 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0036-03
生 （Arachis hypogaea L.）是世界四大油料作物之一，在我国经济发展中占有重要地位，是我国重要的经济和油料作物[1]。近几年随着花生离体培养的快速发展，花生遗传转化也飞速发展着，农杆菌介导是花生遗传转化最常用的方法[2～4]。在转基因植株的初步检测中，抗生素筛选是最为常用的方法[5～10]，其中卡那霉素最为常用[4，6～16]。卡那霉素（Kanamycin，简称Km）能强烈抑制细胞生长，能够使多种植物绿色器官黄化；低浓度卡那霉素能够抑制植物细胞分化，高浓度卡那霉素则能够导致植物死亡[1，5，6，12，13]。在转基因植物筛选中，常用抗性基因作为标记基因[7，11，17]，NPTⅡ、HPT、CAT、SPT、Gent等是使用最多的抗生素抗性酶基因[18]。NPTⅡ（新霉素磷酸转移酶）基因是目前植物遗传转化中常用的标记基因，含有该基因的植物能够对卡那霉素产生抗性，从而存活下来[11，17，21]。
不同花生品种对卡那霉素的敏感程度不同，单世华等[1]对泉花10号和金花1012的带胚单子叶进行研究，得到的卡那霉素临界浓度为200 mg/L；庄振宏等[19]研究得到泉花10号花生小叶的临界卡那霉素浓度为150 mg/L；胡晓君等[20]的试验结果则表明，花生离体叶片的卡那霉素筛选浓度为400 mg/L，不同苗龄叶片对卡那霉素的敏感性不同。本试验研究了4个不同花生品种胚小叶对卡那霉素的敏感性，以期得到各品种的卡那霉素临界浓度，为其遗传转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
花生品种J11、花育22号、D16、鲁花11号，均由山东省花生研究所提供。
1.2 试剂
卡那霉素，购于上海生工；MS基本培养基（添加适量NAA、6-BA）、分化培养基、75%乙醇、0.1%升汞，所用药品或试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器设备
高温高压蒸汽灭菌锅，江南仪器厂；人工气候箱，宁波江南仪器厂；微量移液器，Enpendorf，德国；AA-680型原子吸收分光光度计，日本岛津；J-20XP高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司；PB303-N电子精密天平，梅特勒-托利多公司；79HW-1恒温磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器厂；PHS-3 pH计，上海精密仪器有限公司；超纯水系统，Millipore，美国。
1.4 试验方法
1.4.1 种子消毒 选取成熟饱满、活力高的花生种子，用自来水冲洗2～3次；在超净工作台上用75%乙醇消毒3次，1 min/次；然后用0.1%升汞浸泡10 min；再用无菌水漂洗3～4次，1 min/次，然后于无菌水中浸泡2～4 h。
1.4.2 外植体获得 在超净工作台上剥去消毒处理后的种子种皮，接种于MS基本培养基上，培养4～6 d后，切取花生胚小叶作为外植体。
1.4.3 敏感性试验 设卡那霉素浓度梯度：0、50、100、150、200 mg/L，在培养基高温高压灭菌并冷至65℃左右时加入。切取生长状况良好的胚小叶，接种于添加不同浓度卡那霉素的分化培养基上，培养3周后统计各品种外植体的白化率和出愈率。
白化率（%）=白化外植体数/接种总外植体数×100
出愈率（%）=产生愈伤组织外植体数/接种总外植体数×100
2 结果与分析
2.1 卡那霉素对不同品种花生出愈率的影响
由图1可以看出，Km浓度越高，出愈率越低；0、50 mg/L时，4个品种均能够产生愈伤组织；100 mg/L时，D16的出愈率为零，说明与其他3个品种相比，D16对Km最为敏感；当Km浓度达到150 mg/L时，只有花育22号还有愈伤组织产生，出愈率为10%，说明4个品种中，花育22号对Km最不敏感；但当Km浓度达到200 mg/L时，4个品种均不产生愈伤组织。
图1 各品种在不同Km浓度下的出愈率
2.2 卡那霉素对不同品种花生白化率的影响
由图2可以看出，在未添加Km的培养基上，各品种均无白化植株出现；Km浓度为50 mg/L时，花育22号仍无明显的白化株出现，而其他3个品种的白化率均超过了10%，D16的白化率最高，为33.33%；当Km浓度超过100 mg/L后，4个品种均有不同程度的白化。Km浓度越高，白化率越高，4个品种的白化率由高到低依次为D16>J11>鲁花11号>花育22号。
图2 各品种在Km不同浓度下的白化率
2.3 D16与花育22号在Km不同浓度下的生长状况比较
上述分析显示，4个品种中D16对Km最敏感，而花育22号对Km的耐受性最高。由两者培养3周后的生长状况（图3、图4）可以看出，两品种间差异明显，在添加50 mg/L Km的培养基上，花育22号产生愈伤组织的外植体数明显多于D16，而D16的白化率也明显高于花育22号。
图3 D16在Km不同浓度下的生长状况
图4 花育22号在Km不同浓度下的生长状况
3 讨论与结论 王萍等[5]研究表明，卡那霉素明显抑制大豆胚尖不定芽的形成，随浓度的增加而减少。刘方等[6]研究表明高浓度的卡那霉素抑制棉花体细胞胚的形成，而低浓度的作用较弱。任艳等[22]研究表明，抗生素浓度与抑菌效果呈正比，但与组培苗生长状况呈反比，因此选择适宜的抗生素浓度是必不可少的。不同基因型植物对卡那霉素的内源抗性有差异[7]。本试验结果显示，花育22号对Km的敏感性最弱，胚小叶在添加200 mg/L Km的培养基上出现明显变化；D16对Km敏感性最强，在添加50 mg/L Km 的培养基上即出现明显变化。
D16在Km 100 mg/L时不产生愈伤组织，丧失分化能力，且白化率达到45%，因此，确定其Km临界浓度为100 mg/L；依此确定J11、鲁花11号、花育22号的Km临界值分别为150、150、200 mg/L。但本试验得出的Km临界浓度仅为理论值，实际的使用浓度还有待进一步试验确定。
参 考 文 献：
[1]
单世华，李春娟，刘思衡，等. 以农杆菌为介导花生遗传转化研究[J]. 中国油料作物学报，2003，25（1）：9-13.
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