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摘 要 为研究苜蓿（Medicago truncatula）防卫素基因MtDef4的抑菌功能，以含有该基因片段的质粒pAND-MtDef4为模板，扩增出相应的目的基因，测序正确后将MtDef4基因片段连接到带有GST标签的原核表达载体 pGEX6P-1中，转化大肠杆菌 TransB（DE3），经 IPTG 诱导，Glutathione Sepharose 4B亲和纯化，通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定融合蛋白的表达。体外抑菌试验表明，MtDef4能够抑制病原真菌Corynespora cassiicola 而非Collectotrichum gloeosporioides的生长。本研究结果可为进一步培育转基因橡胶抗病品种奠定基础。
关键词 苜蓿防卫素基因；原核表达；抗真菌活性；多主棒孢菌；胶孢炭疽菌
中图分类号 Q782 文献标识码 A
The Purification of GST-MtDef4 Fusion Protein and
Detection of Its Antifungal Activity in vitro
JING Xiaohui1， WU Lunying1 *， SHEN Yan2，3 *， ZHAO Hui4 * *， WU Lin5
1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource / College of Agronomy， Hainan University， Haikou，
Hainan 570228， China
2 Key Laboratory of Tropical Horticultural Plant Resources and Genetic Improvement， Ministry of Education / College of
Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 571737， China
3 Coconut Research Institute，CATAS，Wenchang，Hainan 571339， China
4 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience
and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
5 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract MtDef4 was amplified from pAND-MtDef4 by PCR， and cloned into vector pGEX-6P-1 with glutathione-S-transferase（GST）tag. After identified by restriction endonuclease digestion and sequencing， the recombinant plasmids pGEX-6P-1-MtDef4 were transformed into Escherichia coli TransB（DE3）， an efficient strain to guarantee the correct fold of disulfide bond. The recombined cells were grown and induced by IPTG. After purification using glutathione sepharose 4B affinity chromatography， the expressed protein was separated by SDS-PAGE and detected by western blot. The results showed that the MtDef4-GST fusion protein was successfully expressed. Antifungal assay indicated that MtDef4-GST fusion protein could inhibit the growth of a filamentous fungus Corynespora cassiicola but not Collectotrichum gloeosporioides.
Key words Medicago truncatula Defensin gene MtDef4； Prokaryotic expression； Antifungal activity； Corynespora cassiicola； Collectotrichum gloeosporioides
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.018
由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的橡胶树棒孢霉落叶病（Corynespora leaf fall disease，CLFD）现已成为南亚、东南亚和中非橡胶树最具破坏性的叶部病害[1-2]。据 Chee[3]估计，该病一旦严重发生，胶树产量损失将达20%。2006年6月Pu等[4]首次在海南西庆农场的橡胶树苗圃上采到疑似病样，至2007年9月已在海南的12个市（县）发现该病的危害。该病蔓延速度相当快，已经成为中国天然橡胶健康发展的潜在威胁。由胶孢炭疽菌 [Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz. and Sacc.]引起的炭疽病是中国橡胶树的另一重要病害，直接会导致橡胶树叶片组织坏死或大量脱落，树体衰弱，缩短割胶期限，最终总产量显著下降[5]。中国每年发生面积超 20万hm2，造成干胶损失近1万t[6]。目前还未见有效的化学农药可用于防治棒孢霉落叶病或炭疽病。传统的抗病品种选育是最有效的防治方法，但抗性种质资源有限，且选育新品种周期过长。而转基因育种有常规育种不具备的优势，可用于培育广谱高效的抗性品种。 植物防卫素是一类广泛分布的抗真菌蛋白，成熟肽含有45～54个氨基酸，有8个保守的半胱氨酸，形成4个二硫键[7-8]。体外实验中发现，多个植物防卫素可在微摩尔浓度下抑制半活体寄生型（hemibiotrophic）或腐生型（necrotrophic）真菌的生长[8-10]，如苜蓿（Medicago truncatula）防卫素MtDef4能够抑制包括Fusarium graminearum在内的多个真菌生长[11-14]。Gao等[15]采用转MtDef4基因技术转化马铃薯取得对马铃薯黄萎病（Verticillium dahliae）不错的田间防效，因而有一定的潜力用于抗病育种。本研究拟利用原核表达技术纯化MtDef4，研究其体外抑制橡胶多主棒孢菌和炭疽病菌生长的能力，为将来转基因培育抗病橡胶品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 试验于 2012年7月至2013年3月在中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行。质粒pAND-MtDef4由Dilip Shah教授惠赠。大肠杆菌菌株为本实验室保存的E. coli DH5α，表达载体为本实验室保存的pGEX6P-1，表达菌株为TransB（DE3）。多主棒孢菌HCCHN01和胶孢炭疽菌Y262由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所黄贵修实验室提供。
1.1.2 试剂 PCR 反应所用试剂、PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均为大连TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，TransB（DE3）感受态、anti-GST直接购自北京全式金生物技术有限公司，Bradford 蛋白质定量检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 MtDef4基因片段的回收纯化 根据MtDef4开放阅读框序列设计带有酶切位点的引物MtDef4-F：CACGAATTCATGGCTAGGTCCGTGCCACTC（划线显示引入的EcoRI位点），MtDef4-R ATACTCGAGTT
AGCAGTGGGTGGTGCAGAAGC（划线显示引入的XhoⅠ位点）。PCR程序为 94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带大小。
1.2.2 原核表达载体的构建 获得的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，在T4 DNA连接酶作用下连接到以相同酶切后回收的 pGEX6P-1载体上，16 ℃连接过夜。将连接产物转入DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性的LB平板上挑取重组质粒，通过 PCR、双酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆测序验证。构建成功的表达质粒命名为pGEX6P-1-MtDef4，将测序正确的质粒转化TransB（DE3）感受态细胞。
1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 挑取测序正确的单克隆接种到5 mL LB（100 μg/mL Amp）培养基中，振荡培养12 h后，将菌液按1 ∶ 100的比例加入到500 mL LB（100 μg/mL Amp）培养基中 200 r/min 37 ℃振荡培养至OD600为0.5～0.6时，加入IPTG（使终浓度为1 mmol/L）进行诱导表达，20 ℃诱导16 h后收集菌液，4 000 r/min离心15 min收集菌体后用1×PBS将沉菌悬起，经过超声波细胞破碎（20 mm的变幅杆，400 W，超声3 s，间隔5 s，重复50次），13 000 r/min离心10 min，上清保存-20 ℃备用。pGEX6P-1作为阴性对照。
1.2.4 GST-MtDef4的纯化、SDS-PAGE及western blot检测 预冷的PBS处理谷胱甘肽琼脂糖树脂，50 mL保存的上清液中加入1 mL预处理的树脂，4 ℃颠倒混匀1 h，1 000 r/min离心5 min弃上清，预冷的PBS溶液清洗谷胱甘肽树脂数次，洗净未与树脂结合的杂蛋白，1 mL还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱GST-MtDef4和GST。利用Bradford蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度。稀释500倍后，分别取10 μL GST-MtDef4和GST加入SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴3 min，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶），然后利用湿转法转膜至PVDF膜，anti-GST检测蛋白表达情况。
1.2.5 原核表达产物抑菌活性的检测 配制含50 μmol/L GST-MtDef4的PDA培养基，在培养基中间打孔，接种多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌块，28 ℃下培养5 d后观察多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌的生长情况。50 μmol/L GST的PDA培养基为对照。GST-MtDef4抑菌率计算公式为：（含GST的PDA培养基上菌落直径-含GST-MtDef4的PDA培养基上菌落直径）/含GST的PDA培养基上菌落直径×100%。所有数据采用SigmaPlot作图，所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 原核表达载体pGEX6P-1-MtDef4的构建及鉴定
用带有酶切位点的引物进行PCR扩增，得到MtDef4基因的cDNA编码区序列。电泳检测结果表明与片段预期大小相一致，且无非特异扩增带（图1-A）。将目的片段回收纯化后，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，连接到pGEX6P-1上，获得pGEX6P-1-MtDef4原核表达载体，转化大肠杆菌 DH5α。对重组质粒进行 PCR及双酶切鉴定，都能获得1条长约250 bp的条带（图1-B），与预期大小一致。将目的条带测序，序列比对结果正确，表明pGEX6P-1-MtDef4原核表达载体已构建成功。然后将鉴定正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌TransB（DE3）中，进行蛋白诱导。 2.2 GST-MtDef4的western blot检测
重组质粒pGEX6P-1-MtDef4转化表达菌株TransB（DE3）后，用IPTG诱导重组蛋白的表达，谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后利用anti-GST进行western-blot检测。pGEX6P-1作为阴性对照。从图2可以看出，利用TransB（DE3）菌株成功表达出GST和GST-MtDef4，GST和GST-MtDef4的大小分别约为26 ku和37 ku。利用Bradford蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度，将GST和GST-MtDef4终浓度调整为1 mmol/L。
2.3 原核表达产物抑菌活性的检测
28 ℃下培养5 d后观察多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌的生长情况，发现在含有50 μmol/L GST-MtDef4的PDA平板上，多主棒孢病菌生长缓慢，平均菌落直径为（3.6±0.2）cm，而胶孢炭疽菌生长正常，平均菌落直径为（9±0.12）cm（图3-C）；而在含有50 μmol/L GST的PDA平板上，多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌都生长正常，菌落直径分别为（9±0.2）和（9±0.15）cm（图3）。GST-MtDef4在50 μmol/L时显著抑制多主棒孢病菌生长，抑制率达到60%（p<0.05），GST-MtDef4在50 μmol/L时对胶孢炭疽菌的生长无显著影响。
3 讨论与结论
现代农业的主要挑战之一是如何能够获得对真菌病害高效且持久抗性的品种[16-17]。尽管各种作物中已经培育出许多抗病品种并应用于田间生产，但抗病品种不够多，抗性易丧失或者对有些病害没有抗病品种等，导致每年由真菌病害造成的损失使作物减产10%[17]。植物转基因技术可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，增大遗传多样性，可用于培育广谱高效的抗性品种。
植物抗微生物蛋白（plant antimicrobial proteins，AMPs）也被称为防卫素（defensin），是在整个植物界分布广泛的富含半胱氨酸的碱性肽，对多种植物真菌病原菌具有广谱抗性[18]。体外的抑菌活性以及防卫素的广泛分布性表明其可能在植物先天免疫中扮演重要作用。研究发现，苜蓿和拟南芥中至少有300个类防卫素肽[19-21]，水稻中93个类防卫素肽[22]。苜蓿防卫素MtDef4能够抑制包括Fusarium graminearum在内的多个真菌生长[14]。目前的研究表明，植物防卫素的抗真菌活性主要取决于γ-core motif[14，23]。利用MtDef4的γ-core motif替换MsDef1的γ-core motif，能够提高MsDef1的2倍抑菌活性[14]。甚至仅仅合成MtDef4的γ-core motif也能够抑制真菌生长[14]。
植物防卫素能够抑制植物及人类病原真菌的生长，但它们对植物和人类本身完全无毒。植物防卫素很可能通过靶向真菌细胞膜的独特位点进而发挥功能。先前的研究表明，植物防卫素特异结合敏感真菌的细胞膜[24]，刺透细胞膜进而抑制真菌生长[25]。有学者认为一些植物防卫素特异性地结合敏感真菌细胞膜上的特异鞘脂类（sphingolipids），鞘脂类是植物防卫素的受体[24]。一些真菌对植物防卫素表现出抗性很可能是这些真菌细胞膜上并不含有这类的鞘脂。然而现阶段并不清楚防卫素/鞘脂互作后是怎样影响真菌生长的，真菌细胞膜上是否存在除鞘脂类之外的受体，真菌体内是否存在特定的信号级联。有关植物防卫素作用机理的另一主要问题是真菌细胞是否内吸植物防卫素，导致防卫素在真菌细胞内结合特定靶标。van der Weerden[26]发现Nicotiana alata防卫素NaD1能够被真菌细胞内吸。NaD1首先结合位于真菌细胞壁上的受体，进而在Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum细胞膜上形成直径为14～22 A。的小孔，并刺透细胞膜。
Gao等[15]采用转MtDef4基因技术转化马铃薯取得对马铃薯黄萎病（Verticillium dahliae）不错的田间防效，本研究成功将MtDef4基因与GST标签融合表达于大肠杆菌TransB（DE3）中，体外抑菌实验表明，MtDef4-GST融合蛋白能够抑制橡胶多主棒孢菌的生长，而未能抑制橡胶胶孢炭疽菌的生长，其可能的原因是橡胶多主棒孢菌而非胶孢炭疽菌的细胞膜上存在特异识别MtDef4的鞘脂，导致MtDef4能够与橡胶多主棒孢菌互作，进入多主棒孢菌细胞。然而具体的抑菌机制值得进一步研究，以期为培育转基因抗病橡胶品种奠定坚实的理论基础。
参考文献
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关键词 苜蓿防卫素基因；原核表达；抗真菌活性；多主棒孢菌；胶孢炭疽菌
中图分类号 Q782 文献标识码 A
The Purification of GST-MtDef4 Fusion Protein and
Detection of Its Antifungal Activity in vitro
JING Xiaohui1， WU Lunying1 *， SHEN Yan2，3 *， ZHAO Hui4 * *， WU Lin5
1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource / College of Agronomy， Hainan University， Haikou，
Hainan 570228， China
2 Key Laboratory of Tropical Horticultural Plant Resources and Genetic Improvement， Ministry of Education / College of
Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 571737， China
3 Coconut Research Institute，CATAS，Wenchang，Hainan 571339， China
4 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience
and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
5 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract MtDef4 was amplified from pAND-MtDef4 by PCR， and cloned into vector pGEX-6P-1 with glutathione-S-transferase（GST）tag. After identified by restriction endonuclease digestion and sequencing， the recombinant plasmids pGEX-6P-1-MtDef4 were transformed into Escherichia coli TransB（DE3）， an efficient strain to guarantee the correct fold of disulfide bond. The recombined cells were grown and induced by IPTG. After purification using glutathione sepharose 4B affinity chromatography， the expressed protein was separated by SDS-PAGE and detected by western blot. The results showed that the MtDef4-GST fusion protein was successfully expressed. Antifungal assay indicated that MtDef4-GST fusion protein could inhibit the growth of a filamentous fungus Corynespora cassiicola but not Collectotrichum gloeosporioides.
Key words Medicago truncatula Defensin gene MtDef4； Prokaryotic expression； Antifungal activity； Corynespora cassiicola； Collectotrichum gloeosporioides
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.018
由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的橡胶树棒孢霉落叶病（Corynespora leaf fall disease，CLFD）现已成为南亚、东南亚和中非橡胶树最具破坏性的叶部病害[1-2]。据 Chee[3]估计，该病一旦严重发生，胶树产量损失将达20%。2006年6月Pu等[4]首次在海南西庆农场的橡胶树苗圃上采到疑似病样，至2007年9月已在海南的12个市（县）发现该病的危害。该病蔓延速度相当快，已经成为中国天然橡胶健康发展的潜在威胁。由胶孢炭疽菌 [Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz. and Sacc.]引起的炭疽病是中国橡胶树的另一重要病害，直接会导致橡胶树叶片组织坏死或大量脱落，树体衰弱，缩短割胶期限，最终总产量显著下降[5]。中国每年发生面积超 20万hm2，造成干胶损失近1万t[6]。目前还未见有效的化学农药可用于防治棒孢霉落叶病或炭疽病。传统的抗病品种选育是最有效的防治方法，但抗性种质资源有限，且选育新品种周期过长。而转基因育种有常规育种不具备的优势，可用于培育广谱高效的抗性品种。 植物防卫素是一类广泛分布的抗真菌蛋白，成熟肽含有45～54个氨基酸，有8个保守的半胱氨酸，形成4个二硫键[7-8]。体外实验中发现，多个植物防卫素可在微摩尔浓度下抑制半活体寄生型（hemibiotrophic）或腐生型（necrotrophic）真菌的生长[8-10]，如苜蓿（Medicago truncatula）防卫素MtDef4能够抑制包括Fusarium graminearum在内的多个真菌生长[11-14]。Gao等[15]采用转MtDef4基因技术转化马铃薯取得对马铃薯黄萎病（Verticillium dahliae）不错的田间防效，因而有一定的潜力用于抗病育种。本研究拟利用原核表达技术纯化MtDef4，研究其体外抑制橡胶多主棒孢菌和炭疽病菌生长的能力，为将来转基因培育抗病橡胶品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 试验于 2012年7月至2013年3月在中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行。质粒pAND-MtDef4由Dilip Shah教授惠赠。大肠杆菌菌株为本实验室保存的E. coli DH5α，表达载体为本实验室保存的pGEX6P-1，表达菌株为TransB（DE3）。多主棒孢菌HCCHN01和胶孢炭疽菌Y262由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所黄贵修实验室提供。
1.1.2 试剂 PCR 反应所用试剂、PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均为大连TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，TransB（DE3）感受态、anti-GST直接购自北京全式金生物技术有限公司，Bradford 蛋白质定量检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 MtDef4基因片段的回收纯化 根据MtDef4开放阅读框序列设计带有酶切位点的引物MtDef4-F：CACGAATTCATGGCTAGGTCCGTGCCACTC（划线显示引入的EcoRI位点），MtDef4-R ATACTCGAGTT
AGCAGTGGGTGGTGCAGAAGC（划线显示引入的XhoⅠ位点）。PCR程序为 94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带大小。
1.2.2 原核表达载体的构建 获得的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，在T4 DNA连接酶作用下连接到以相同酶切后回收的 pGEX6P-1载体上，16 ℃连接过夜。将连接产物转入DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性的LB平板上挑取重组质粒，通过 PCR、双酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆测序验证。构建成功的表达质粒命名为pGEX6P-1-MtDef4，将测序正确的质粒转化TransB（DE3）感受态细胞。
1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 挑取测序正确的单克隆接种到5 mL LB（100 μg/mL Amp）培养基中，振荡培养12 h后，将菌液按1 ∶ 100的比例加入到500 mL LB（100 μg/mL Amp）培养基中 200 r/min 37 ℃振荡培养至OD600为0.5～0.6时，加入IPTG（使终浓度为1 mmol/L）进行诱导表达，20 ℃诱导16 h后收集菌液，4 000 r/min离心15 min收集菌体后用1×PBS将沉菌悬起，经过超声波细胞破碎（20 mm的变幅杆，400 W，超声3 s，间隔5 s，重复50次），13 000 r/min离心10 min，上清保存-20 ℃备用。pGEX6P-1作为阴性对照。
1.2.4 GST-MtDef4的纯化、SDS-PAGE及western blot检测 预冷的PBS处理谷胱甘肽琼脂糖树脂，50 mL保存的上清液中加入1 mL预处理的树脂，4 ℃颠倒混匀1 h，1 000 r/min离心5 min弃上清，预冷的PBS溶液清洗谷胱甘肽树脂数次，洗净未与树脂结合的杂蛋白，1 mL还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱GST-MtDef4和GST。利用Bradford蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度。稀释500倍后，分别取10 μL GST-MtDef4和GST加入SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴3 min，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶），然后利用湿转法转膜至PVDF膜，anti-GST检测蛋白表达情况。
1.2.5 原核表达产物抑菌活性的检测 配制含50 μmol/L GST-MtDef4的PDA培养基，在培养基中间打孔，接种多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌块，28 ℃下培养5 d后观察多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌的生长情况。50 μmol/L GST的PDA培养基为对照。GST-MtDef4抑菌率计算公式为：（含GST的PDA培养基上菌落直径-含GST-MtDef4的PDA培养基上菌落直径）/含GST的PDA培养基上菌落直径×100%。所有数据采用SigmaPlot作图，所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 原核表达载体pGEX6P-1-MtDef4的构建及鉴定
用带有酶切位点的引物进行PCR扩增，得到MtDef4基因的cDNA编码区序列。电泳检测结果表明与片段预期大小相一致，且无非特异扩增带（图1-A）。将目的片段回收纯化后，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，连接到pGEX6P-1上，获得pGEX6P-1-MtDef4原核表达载体，转化大肠杆菌 DH5α。对重组质粒进行 PCR及双酶切鉴定，都能获得1条长约250 bp的条带（图1-B），与预期大小一致。将目的条带测序，序列比对结果正确，表明pGEX6P-1-MtDef4原核表达载体已构建成功。然后将鉴定正确的阳性克隆质粒转化到大肠杆菌TransB（DE3）中，进行蛋白诱导。 2.2 GST-MtDef4的western blot检测
重组质粒pGEX6P-1-MtDef4转化表达菌株TransB（DE3）后，用IPTG诱导重组蛋白的表达，谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后利用anti-GST进行western-blot检测。pGEX6P-1作为阴性对照。从图2可以看出，利用TransB（DE3）菌株成功表达出GST和GST-MtDef4，GST和GST-MtDef4的大小分别约为26 ku和37 ku。利用Bradford蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白浓度，将GST和GST-MtDef4终浓度调整为1 mmol/L。
2.3 原核表达产物抑菌活性的检测
28 ℃下培养5 d后观察多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌的生长情况，发现在含有50 μmol/L GST-MtDef4的PDA平板上，多主棒孢病菌生长缓慢，平均菌落直径为（3.6±0.2）cm，而胶孢炭疽菌生长正常，平均菌落直径为（9±0.12）cm（图3-C）；而在含有50 μmol/L GST的PDA平板上，多主棒孢病菌和胶孢炭疽菌都生长正常，菌落直径分别为（9±0.2）和（9±0.15）cm（图3）。GST-MtDef4在50 μmol/L时显著抑制多主棒孢病菌生长，抑制率达到60%（p<0.05），GST-MtDef4在50 μmol/L时对胶孢炭疽菌的生长无显著影响。
3 讨论与结论
现代农业的主要挑战之一是如何能够获得对真菌病害高效且持久抗性的品种[16-17]。尽管各种作物中已经培育出许多抗病品种并应用于田间生产，但抗病品种不够多，抗性易丧失或者对有些病害没有抗病品种等，导致每年由真菌病害造成的损失使作物减产10%[17]。植物转基因技术可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，增大遗传多样性，可用于培育广谱高效的抗性品种。
植物抗微生物蛋白（plant antimicrobial proteins，AMPs）也被称为防卫素（defensin），是在整个植物界分布广泛的富含半胱氨酸的碱性肽，对多种植物真菌病原菌具有广谱抗性[18]。体外的抑菌活性以及防卫素的广泛分布性表明其可能在植物先天免疫中扮演重要作用。研究发现，苜蓿和拟南芥中至少有300个类防卫素肽[19-21]，水稻中93个类防卫素肽[22]。苜蓿防卫素MtDef4能够抑制包括Fusarium graminearum在内的多个真菌生长[14]。目前的研究表明，植物防卫素的抗真菌活性主要取决于γ-core motif[14，23]。利用MtDef4的γ-core motif替换MsDef1的γ-core motif，能够提高MsDef1的2倍抑菌活性[14]。甚至仅仅合成MtDef4的γ-core motif也能够抑制真菌生长[14]。
植物防卫素能够抑制植物及人类病原真菌的生长，但它们对植物和人类本身完全无毒。植物防卫素很可能通过靶向真菌细胞膜的独特位点进而发挥功能。先前的研究表明，植物防卫素特异结合敏感真菌的细胞膜[24]，刺透细胞膜进而抑制真菌生长[25]。有学者认为一些植物防卫素特异性地结合敏感真菌细胞膜上的特异鞘脂类（sphingolipids），鞘脂类是植物防卫素的受体[24]。一些真菌对植物防卫素表现出抗性很可能是这些真菌细胞膜上并不含有这类的鞘脂。然而现阶段并不清楚防卫素/鞘脂互作后是怎样影响真菌生长的，真菌细胞膜上是否存在除鞘脂类之外的受体，真菌体内是否存在特定的信号级联。有关植物防卫素作用机理的另一主要问题是真菌细胞是否内吸植物防卫素，导致防卫素在真菌细胞内结合特定靶标。van der Weerden[26]发现Nicotiana alata防卫素NaD1能够被真菌细胞内吸。NaD1首先结合位于真菌细胞壁上的受体，进而在Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum细胞膜上形成直径为14～22 A。的小孔，并刺透细胞膜。
Gao等[15]采用转MtDef4基因技术转化马铃薯取得对马铃薯黄萎病（Verticillium dahliae）不错的田间防效，本研究成功将MtDef4基因与GST标签融合表达于大肠杆菌TransB（DE3）中，体外抑菌实验表明，MtDef4-GST融合蛋白能够抑制橡胶多主棒孢菌的生长，而未能抑制橡胶胶孢炭疽菌的生长，其可能的原因是橡胶多主棒孢菌而非胶孢炭疽菌的细胞膜上存在特异识别MtDef4的鞘脂，导致MtDef4能够与橡胶多主棒孢菌互作，进入多主棒孢菌细胞。然而具体的抑菌机制值得进一步研究，以期为培育转基因抗病橡胶品种奠定坚实的理论基础。
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