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摘要：听力受到伤害是由不同的因素导致的，其中遗传因素占很大一部分。根据是否伴有其他器官或系统症状，遗传性聋分为非综合征型聋（NSHI）和综合征型聋（SHL）。在语前聋中，大约70%为NSHL，30%为SHI。按照遗传模式区分，大约80%NSHI为常染色体隐性耳聋（DFNB），20%为常染色体显性耳聋（DFNA），1%为伴性染色体遗传性聋，不足1%为线粒体相关性聋。SHI的临床表现除耳聋外，常伴有其他器官或系统的症状或体征，目前已发现400多种伴有耳聋的综合征。本文主要针对遗传性聋基因诊断的最新进展进行综述，为临床医生和科研工作者一定的借鉴。
关键词：遗传性聋基因；策略；进展；诊断
1 基因芯片技术
基因芯片也称为突变芯片，是一种同时检测多个突变的方法。具体原理是将序列已知的突变所在的特定DNA片段作为靶基因有序地固定在载体（如：玻璃片）上，针对靶基因设计特异性的引物，通过PCR扩增技术在样品DNA中掺入荧光标记的双脱氧核昔酸（探针）；然后通过计算机系统扫描探针并获得需要的序列信息。目前，已报道的基因芯片可以检测4-30个最常见耳聋基因的15-300个突变。
北京博奥生物有限公司和迈阿密大学研究团队最近共同设计的一个DNA流体芯片（Capital Bio Miami OtoArray），主要针对白种人最常见5个基因的变异，其有效性和稳定性在160个DNA样品中得到直接测序验证。北京博奥生物有限公司和中国人民解放军301医院研发的晶芯九项遗传性聋基因检测试剂盒，是中国第一个取得医疗器械注册许可证的耳聋基因诊断芯片，目前已广泛应用于临床耳聋基因诊断。此外，吴宏等设计了针对中国人群耳聋遗传背景的具有384个位点的Goldengate高通量耳聋基因芯片，其中，包括240个耳聋相关突变位点（77个显性突变位点及163个隐性突变位点）和144个SNP位点。应用该耳聋基因芯片对465个DNA模板进行筛查，统计分析了芯片Call rate、SNP位点的等位基因频率；对一个非综合征型显性遗传性聋家系进行SNP位点的连锁分析，其结果与传统的微卫星定位扫描方法的定位结果相似，认为该芯片具备初步进行耳聋相关基因的排除定位连锁分析的能力。
2 二代测序（NGS）
虽然NGS技术最初是为研究而设计的，但它很快成为临床遗传性疾病基因诊断不可或缺的工具。有数百个相关致病基因的NSHI很难通过临床病史和听力学检查做出准确的病因诊断；耳聋基因检测已经成为耳聋患者优先选择的诊断方法并且推荐在体格检查、听力学检查和家族史确定后立即进行；这些策略正在快速应用到临床中。
目前，NGS技术已经相当成熟，而测序数据的完整解读是NGS技术应用的一大挑战，需要多个不同领域的专家：遗传学家、统计学家、生物信息学家、生物学家和临床医生，以便找出遗传性疾病确切的致病变异，因而，最大的改进之处也在于计算机设施和开发用于生物信息分析的高效准确的算法。最近开发的一种生物信息学pipeline能够进行有效的WGS分析，包括：比对、比对后处理和基因分型，并为后续费时不足2小时的临床解读产生一个变异列表。另一个快速发展的领域是对NGS数据的拷贝数变异（CNV）分析，由于实验噪声以及在目标捕获和扩增过程中引入的偏差和伪像，使得利用WES数据分析CNV变得非常复杂，并且WES的深度和覆盖率可能并不总是准确地反映真实的拷贝数。最近开发的算法越来越多，旨在解决CNV问题，以减少假阳性和假阴性结果。CNV是NSHI的一个特别重要的致病因素，从一项研究中可以确定，约15%的NSHI患者在已知的耳聋基因中至少携带一个CNV。艾吉泰康公司最近推出一款針对汉族人遗传特征制定的A1WholeExome外显子试剂盒，使用中国汉族人DNA标准物质数据作对照，并可分析大于100k区域的CNV变异。
3 其他检测技术
除了上述技术，目前应用于临床的遗传性耳聋的基因诊断技术还包括：直接测序法、PLRRFLP、质谱分析以及荧光PLR法等。目前直接测序法仍是基因诊断的金标准，其得出的结果直观、准确可靠，读长长，既可发现已知突变，也可发现未知突变，广泛应用于UJB2、SLC26A4以及线粒体12SrRNA的全序列分析，但其通量低，成本较高，不适用于大规模临床推广。PCRRFLP可以明确地确定突变的有无和位置，但需在突变位点处存在酶切位点或能够引入某种酶切位点；目前已有商品化的基于PLR - RFLP技术的线粒体12SrRNAA1555CU突变的检测试剂盒。目前已有商品化的基于荧光PLR的14个耳聋基因热点突变的检测试剂盒并被应用于临床。此外，市面上还有基于导流杂交技术，将PLR和低密度基因芯片技术结合用于检测4个耳聋相关基因的13个突变位点的试剂盒。上述方法各有优缺点，研究人员和临床工作者可以针对不同的研究和临床需求选择合适的技术进行耳聋基因检测。
4 展望
综上所述，随着高通量测序平台和数据分析的不断完善以及测序费用的降低，基因检测技术已从单基因水平发展到全基因组水平，NGS必将在包括耳聋在内的遗传性疾病的临床诊断和科学研究中发挥更大作用。例如，在耳聋高危家系中进行遗传咨询和产前诊断，可以降低后代耳聋的患病率；然而，对检测结果的分析仍然存在挑战。目前中国还缺乏完整的数据库，生物信息分析和解读时效低、成本高，从生物信息学到NGS诊断还面临很大的挑战，需要相关人员进行深层次的研究。
参考文献：
[1]王秋菊.袁水.常染色体隐性遗传性耳聋[J].听力学及言语疾病杂志2016，24：421.
[2]刘亚兰.汪俊程.邓宇元.等.荧光PCR法在非综合征型遗传性耳聋基因诊断中的应用研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志.2015，22：345.
关键词：遗传性聋基因；策略；进展；诊断
1 基因芯片技术
基因芯片也称为突变芯片，是一种同时检测多个突变的方法。具体原理是将序列已知的突变所在的特定DNA片段作为靶基因有序地固定在载体（如：玻璃片）上，针对靶基因设计特异性的引物，通过PCR扩增技术在样品DNA中掺入荧光标记的双脱氧核昔酸（探针）；然后通过计算机系统扫描探针并获得需要的序列信息。目前，已报道的基因芯片可以检测4-30个最常见耳聋基因的15-300个突变。
北京博奥生物有限公司和迈阿密大学研究团队最近共同设计的一个DNA流体芯片（Capital Bio Miami OtoArray），主要针对白种人最常见5个基因的变异，其有效性和稳定性在160个DNA样品中得到直接测序验证。北京博奥生物有限公司和中国人民解放军301医院研发的晶芯九项遗传性聋基因检测试剂盒，是中国第一个取得医疗器械注册许可证的耳聋基因诊断芯片，目前已广泛应用于临床耳聋基因诊断。此外，吴宏等设计了针对中国人群耳聋遗传背景的具有384个位点的Goldengate高通量耳聋基因芯片，其中，包括240个耳聋相关突变位点（77个显性突变位点及163个隐性突变位点）和144个SNP位点。应用该耳聋基因芯片对465个DNA模板进行筛查，统计分析了芯片Call rate、SNP位点的等位基因频率；对一个非综合征型显性遗传性聋家系进行SNP位点的连锁分析，其结果与传统的微卫星定位扫描方法的定位结果相似，认为该芯片具备初步进行耳聋相关基因的排除定位连锁分析的能力。
2 二代测序（NGS）
虽然NGS技术最初是为研究而设计的，但它很快成为临床遗传性疾病基因诊断不可或缺的工具。有数百个相关致病基因的NSHI很难通过临床病史和听力学检查做出准确的病因诊断；耳聋基因检测已经成为耳聋患者优先选择的诊断方法并且推荐在体格检查、听力学检查和家族史确定后立即进行；这些策略正在快速应用到临床中。
目前，NGS技术已经相当成熟，而测序数据的完整解读是NGS技术应用的一大挑战，需要多个不同领域的专家：遗传学家、统计学家、生物信息学家、生物学家和临床医生，以便找出遗传性疾病确切的致病变异，因而，最大的改进之处也在于计算机设施和开发用于生物信息分析的高效准确的算法。最近开发的一种生物信息学pipeline能够进行有效的WGS分析，包括：比对、比对后处理和基因分型，并为后续费时不足2小时的临床解读产生一个变异列表。另一个快速发展的领域是对NGS数据的拷贝数变异（CNV）分析，由于实验噪声以及在目标捕获和扩增过程中引入的偏差和伪像，使得利用WES数据分析CNV变得非常复杂，并且WES的深度和覆盖率可能并不总是准确地反映真实的拷贝数。最近开发的算法越来越多，旨在解决CNV问题，以减少假阳性和假阴性结果。CNV是NSHI的一个特别重要的致病因素，从一项研究中可以确定，约15%的NSHI患者在已知的耳聋基因中至少携带一个CNV。艾吉泰康公司最近推出一款針对汉族人遗传特征制定的A1WholeExome外显子试剂盒，使用中国汉族人DNA标准物质数据作对照，并可分析大于100k区域的CNV变异。
3 其他检测技术
除了上述技术，目前应用于临床的遗传性耳聋的基因诊断技术还包括：直接测序法、PLRRFLP、质谱分析以及荧光PLR法等。目前直接测序法仍是基因诊断的金标准，其得出的结果直观、准确可靠，读长长，既可发现已知突变，也可发现未知突变，广泛应用于UJB2、SLC26A4以及线粒体12SrRNA的全序列分析，但其通量低，成本较高，不适用于大规模临床推广。PCRRFLP可以明确地确定突变的有无和位置，但需在突变位点处存在酶切位点或能够引入某种酶切位点；目前已有商品化的基于PLR - RFLP技术的线粒体12SrRNAA1555CU突变的检测试剂盒。目前已有商品化的基于荧光PLR的14个耳聋基因热点突变的检测试剂盒并被应用于临床。此外，市面上还有基于导流杂交技术，将PLR和低密度基因芯片技术结合用于检测4个耳聋相关基因的13个突变位点的试剂盒。上述方法各有优缺点，研究人员和临床工作者可以针对不同的研究和临床需求选择合适的技术进行耳聋基因检测。
4 展望
综上所述，随着高通量测序平台和数据分析的不断完善以及测序费用的降低，基因检测技术已从单基因水平发展到全基因组水平，NGS必将在包括耳聋在内的遗传性疾病的临床诊断和科学研究中发挥更大作用。例如，在耳聋高危家系中进行遗传咨询和产前诊断，可以降低后代耳聋的患病率；然而，对检测结果的分析仍然存在挑战。目前中国还缺乏完整的数据库，生物信息分析和解读时效低、成本高，从生物信息学到NGS诊断还面临很大的挑战，需要相关人员进行深层次的研究。
参考文献：
[1]王秋菊.袁水.常染色体隐性遗传性耳聋[J].听力学及言语疾病杂志2016，24：421.
[2]刘亚兰.汪俊程.邓宇元.等.荧光PCR法在非综合征型遗传性耳聋基因诊断中的应用研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志.2015，22：345.