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【摘要】目的：研究双黄连制剂体外抗菌效价检测方法，建立基于生物检定的双黄连制剂质量评价模式。 方法：按照中国药典（2010版）规定的生物检定法中的管碟法，以金黄色葡萄球菌为菌种，建立生物效价评价双黄连制剂的方法，并对不同厂家的双黄连口服液的抗菌效价进行测定。结果：双黄连制剂体外抗菌实验量效之间具有良好的线性关系，不同厂家的双黄连口服液抗菌效价为10.278U～15.7276U。结论：生物效价检测方法可以作为双黄连制剂质量控制的一种方法。
【关键词】双黄连制剂；质量控制；生物效价；管碟法
【中图分类号】R927.11【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）08-0030-03
中药制剂质量控制方法目前常用含量测定法，一般以某种或几种有效成分为对照，但中药制剂不同于成分单一的化学药，其成分复杂，具有多成分、多靶点的药理作用，仅依靠某种或几种有效成分难以全面评价中药质量，更难以体现中药的整体效应。借鉴生物制品质量控制模式，建立中药制剂基于生物效价检测的中药质量控制方法，用以完善现行的中药质量控制体系[1]。
生物效价测定法是鉴定制剂质量的一种新方法，利用药物对生物体所产生的影响，测定药物的生物效价。用此方法控制中药质量，可以对药品的药效、毒副作用进行评价，尤其对于某些理化方法无法探明含量、无法表征生物活性的中药制剂更有其明显的优越性。目前已有文献采用生物鉴定法对含小檗碱类中药进行研究[2]，以生物效应为为核心药效控制药材的质量，取得了一定进展。迄今为止，尚未见采用生物效价测定法控制成方制剂质量的研究报道。
双黄连制剂由金银花、黄芩、连翘组成，具有疏风解表、清热解毒的功效。临床用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛[3]。本文以双黄连相关制剂为例，对处方中三味药材的生物效价进行系统研究，以期控制制剂的质量。为有效进行双黄连制剂的质量控制研究，以多种不同厂家的双黄连制剂为研究对象，以药典规定的双黄连含量测定成分为参考，制定基于生物效价的双黄连制剂质量标准。
1仪器与材料
1.1仪器1/10万电子天平（Sartorius公司，德国）；高温高压高湿灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；恒温培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；牛津杯[内径（6.0±0.1）mm、外径（7.8±0.1）mm、高（10.0±0.1）mm]；游标卡尺（上海宝琴工具有限公司）；陶瓦蓋。
1.2试剂庆大霉素（批号：130326-201015，标定效价为630U/mg，中国药品生物制品检定所提供）； 金黄色葡萄球菌[staphylocoeccus aureus CMCC（B）26003]（中国药品生物制品检定所）；营养琼脂培养基（蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，北京陆桥技术有限责任公司）；水为无菌超纯水；其余试剂均为分析纯。
1.3药品双黄连口服液（批号：112112025，河南太龙药业股份有限公司；批号：13052416，哈药集团三精制药股份有限公司；批号：10121321，河南太龙药业股份有限公司；批号：20141020，东莞市亚洲制药有限公司；批号：121021，河南福森药业有限公司；批号：120905，南阳市新生制药有限公司；批号：110317，哈尔滨汇利药业有限公司；批号：B20130104，黑龙江珍宝岛药业股份有限公司；批号：110306，黑龙江瑞格制药有限公司；批号：110506哈高科白天鹅药业集团有限公司）。
2方法与结果
2.1试验材料准备参照中国药典（2010年版）二部“抗生素微生物检定法-管碟法操作”[4]。
2.1.1标准品的制备精密称取庆大霉素适量，加pH7.8的磷酸盐溶液稀释0.01μg/ml作为标准品储备液。
2.1.2供试品的制备精密量取双黄连口服液样品5ml，至10ml容量瓶中，用无菌水定容至刻度，蒸汽灭菌30min，存于4℃保存备用。
2.1.3菌悬液的制备取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，另取营养琼脂接种，在37℃下培养20～22h，取3、4代细菌的培养物，用无菌水将菌苔洗下后，制成悬液，使用血球计数板调节浊度为2.0麦氏比浊度，备用。
2.1.4双碟的制备[5]于双碟中加入高温灭菌后的营养琼脂培养基20ml，使其在碟内均匀平铺，并在水平操作台上冷却凝固，作为底层。另取培养基适量，高温灭菌后放冷至50℃，加入占培养基体积1%的悬菌液，摇匀，在每一双碟中分别加入5ml，作为菌层。待冷却后，在每一双碟中均匀等距放置6个牛津杯，备用。
2.2效价检测的方法学检查
2.2.1方法采用管碟法，测定标准品对实验菌产生的抑菌圈直径，进行分析考察。
2.2.2剂量反应关系考察取制备完毕的双碟2只，分别均匀等距安置4个牛津杯，用陶瓦圆盖覆盖备用，分别取标准品按照1∶0.8剂距分别用磷酸盐溶液稀释至10、8、6.4、5.12、4.096、3.278、2.62、2.10μg/ml的溶液0.3ml加样，置于37℃恒温培养箱中培养20h，取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径D值，结果见表1。
以抑菌圈直径D（mm）为横坐标X，标准品浓度C（μg/ml）为纵坐标Y，经线性回归，得回归方程为Y=1.9273X+10.882，R2=0.9921，若以抑菌圈直径D（mm）为横坐标X，标准品浓度C（μg/ml）的对数为纵坐标Y，经线性回归，回归方程为Y=0.0381X，R2=0.9991。结果表明，在2.10～10μg/ml范围内庆大霉素磷酸盐溶液的对数值与抑菌圈直径进行直线回归处理，剂量反应关系系数R均大于0.99，说明庆大霉素磷酸盐溶液的浓度在2.10～10μg/ml范围内，与抑菌圈直径有较好的量效关系。 2.2.3精密度试验取标准品溶液，稀释至6.4μg/ml，按上述条件重复测定5次，精密测量各抑菌圈直径D值，计算相对标准偏差RSD值低于1%，具有较好的精密度。
2.2.4中间精密度试验邀请不同试验人员，在不同时间，取标准品溶液，稀释至6.4μg/ml，按上述条件重复测定5次，精密测量各抑菌圈直径D值计算RSD值均低于2%，具有较好的中间精密度。
2.2.5稳定性试验取供试品溶液，分别于0、l、4、8、24h按上述条件测定各抑菌圈直径D值，计算RSD值均低于2%。结果表明，标准品溶液在24h内稳定性良好。
2.2.6 重复性试验取标准品溶液，稀释至6.4μg/ml，共5份，按上述条件测定各抑菌圈直径D值，计算RSD低于1%。结果表明，所采用的测定方法重复性良好。
2.3试验设计采用量反应平行线（3·3）法，随机区组设计实验，将标准品溶液和供试品溶液按照1∶0.8随机分成高、中、低6组，前三组接受标准品的3个剂量，后三组接受供试品的3个剂量。取6只制备完成的双碟，在每一双碟中一侧的3个牛津杯分别滴加高（SH）、中（SM）、低（SL）浓度的庆大霉素磷酸盐溶液，另一侧3个牛津杯分别滴加高（TH）、中（TM）、低（TL）3种浓度的双黄连口服液供试品溶液，加样量均为0.3ml，于37℃恒温培养箱中培养20h后，精密测量各个抑菌圈直径，使用生物检定统计程序BS2000版[6-7]中的（3·3）法进行可靠性测验、效价计算和试验误差估计。
2.4结果与小结
2.4.1效价计算结果，结果见表2。
2.4.2小结试验应用生物检定中的管碟法对不同厂家的双黄连口服液进行抑菌效价的检测，实验结果均能通过可靠性检测，表明双黄连制剂可以通过量反应平行線（3·3）法进行效价计算和实验误差估计。由于1ml供试品溶液中含有0.5ml双黄连口服液，上述检测结果经过换算可以得出，不同厂家的双黄连制剂抑菌效价存在差异，抗菌效价为10.278～15.7276U，因此暂定每1ml双黄连口服液抑菌效价不得低于9.3300U。
3讨论
3.1管碟法检测条件的选择与优化按照中国药典（2010年版）二部微生物鉴定法管碟法测定样品对双碟中培养菌产生的抑菌圈，应用单因素实验法确定培养菌接种量和培养时间对抑菌圈的影响。
3.2培养菌接种量的考察应用第3代金黄色葡萄球菌，菌悬液浊度分别调整为0.5、1.0、1.5、2.0麦氏比浊标准（MCF）。结果表明，菌悬液浊度在0.5～2.0MCF范围内，抑菌圈直径不明显，当接种量为2.0MCF时，菌层生长良好并且抑菌圈分界清晰，因此2.0MCF为适宜的培养菌接种量。
3.3培养时间的考察在相同条件下，分别考察14.0、14.5、15.0、15.5、16.0h等不同培养时间对试验抑菌圈产生的影响。结果表明，培养时间为15.0h时抑菌圈直径（即效应值）较大，菌层生长良好并且抑菌圈分界清晰。因此培养时间选定为15.0h。
参考文献
[1] 肖小河，金城，赵中振，等.论中药质量控制与评价模式的创新与发展[J].中国中药杂志，2007，32（14）：1377-1381.
[2] 方艺霖.含小檗碱类中药品质生物评价与控制的初步研究[D].成都：成都中医药大学，2008：35-48.
[3] 王小平，刘雅华.贵州省习用金银花抑菌作用初探[J].中国民族民间医药，1998，6（34）：40-41.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[S].北京：化学工业出版社.2010：附录93-95.
[5] 王美珍.培养基对抗生素效价测定的影响[J].中国民族民间医药，2010，18（3）：68.
[6] 沈连忠，李波.中国药典生物检定统计软件BS2000For Windows9X[J].中国卫生统计，2000，17（6）：330.
[7] 张媛，谭德讲.中国药典生物检定统计实例不同计算方式结果比较和几点修改建议[J].药物分析杂志2013，33（11）：1858-1861.
（收稿日期：2015.01.22）
【关键词】双黄连制剂；质量控制；生物效价；管碟法
【中图分类号】R927.11【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）08-0030-03
中药制剂质量控制方法目前常用含量测定法，一般以某种或几种有效成分为对照，但中药制剂不同于成分单一的化学药，其成分复杂，具有多成分、多靶点的药理作用，仅依靠某种或几种有效成分难以全面评价中药质量，更难以体现中药的整体效应。借鉴生物制品质量控制模式，建立中药制剂基于生物效价检测的中药质量控制方法，用以完善现行的中药质量控制体系[1]。
生物效价测定法是鉴定制剂质量的一种新方法，利用药物对生物体所产生的影响，测定药物的生物效价。用此方法控制中药质量，可以对药品的药效、毒副作用进行评价，尤其对于某些理化方法无法探明含量、无法表征生物活性的中药制剂更有其明显的优越性。目前已有文献采用生物鉴定法对含小檗碱类中药进行研究[2]，以生物效应为为核心药效控制药材的质量，取得了一定进展。迄今为止，尚未见采用生物效价测定法控制成方制剂质量的研究报道。
双黄连制剂由金银花、黄芩、连翘组成，具有疏风解表、清热解毒的功效。临床用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛[3]。本文以双黄连相关制剂为例，对处方中三味药材的生物效价进行系统研究，以期控制制剂的质量。为有效进行双黄连制剂的质量控制研究，以多种不同厂家的双黄连制剂为研究对象，以药典规定的双黄连含量测定成分为参考，制定基于生物效价的双黄连制剂质量标准。
1仪器与材料
1.1仪器1/10万电子天平（Sartorius公司，德国）；高温高压高湿灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；恒温培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；牛津杯[内径（6.0±0.1）mm、外径（7.8±0.1）mm、高（10.0±0.1）mm]；游标卡尺（上海宝琴工具有限公司）；陶瓦蓋。
1.2试剂庆大霉素（批号：130326-201015，标定效价为630U/mg，中国药品生物制品检定所提供）； 金黄色葡萄球菌[staphylocoeccus aureus CMCC（B）26003]（中国药品生物制品检定所）；营养琼脂培养基（蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，北京陆桥技术有限责任公司）；水为无菌超纯水；其余试剂均为分析纯。
1.3药品双黄连口服液（批号：112112025，河南太龙药业股份有限公司；批号：13052416，哈药集团三精制药股份有限公司；批号：10121321，河南太龙药业股份有限公司；批号：20141020，东莞市亚洲制药有限公司；批号：121021，河南福森药业有限公司；批号：120905，南阳市新生制药有限公司；批号：110317，哈尔滨汇利药业有限公司；批号：B20130104，黑龙江珍宝岛药业股份有限公司；批号：110306，黑龙江瑞格制药有限公司；批号：110506哈高科白天鹅药业集团有限公司）。
2方法与结果
2.1试验材料准备参照中国药典（2010年版）二部“抗生素微生物检定法-管碟法操作”[4]。
2.1.1标准品的制备精密称取庆大霉素适量，加pH7.8的磷酸盐溶液稀释0.01μg/ml作为标准品储备液。
2.1.2供试品的制备精密量取双黄连口服液样品5ml，至10ml容量瓶中，用无菌水定容至刻度，蒸汽灭菌30min，存于4℃保存备用。
2.1.3菌悬液的制备取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，另取营养琼脂接种，在37℃下培养20～22h，取3、4代细菌的培养物，用无菌水将菌苔洗下后，制成悬液，使用血球计数板调节浊度为2.0麦氏比浊度，备用。
2.1.4双碟的制备[5]于双碟中加入高温灭菌后的营养琼脂培养基20ml，使其在碟内均匀平铺，并在水平操作台上冷却凝固，作为底层。另取培养基适量，高温灭菌后放冷至50℃，加入占培养基体积1%的悬菌液，摇匀，在每一双碟中分别加入5ml，作为菌层。待冷却后，在每一双碟中均匀等距放置6个牛津杯，备用。
2.2效价检测的方法学检查
2.2.1方法采用管碟法，测定标准品对实验菌产生的抑菌圈直径，进行分析考察。
2.2.2剂量反应关系考察取制备完毕的双碟2只，分别均匀等距安置4个牛津杯，用陶瓦圆盖覆盖备用，分别取标准品按照1∶0.8剂距分别用磷酸盐溶液稀释至10、8、6.4、5.12、4.096、3.278、2.62、2.10μg/ml的溶液0.3ml加样，置于37℃恒温培养箱中培养20h，取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径D值，结果见表1。
以抑菌圈直径D（mm）为横坐标X，标准品浓度C（μg/ml）为纵坐标Y，经线性回归，得回归方程为Y=1.9273X+10.882，R2=0.9921，若以抑菌圈直径D（mm）为横坐标X，标准品浓度C（μg/ml）的对数为纵坐标Y，经线性回归，回归方程为Y=0.0381X，R2=0.9991。结果表明，在2.10～10μg/ml范围内庆大霉素磷酸盐溶液的对数值与抑菌圈直径进行直线回归处理，剂量反应关系系数R均大于0.99，说明庆大霉素磷酸盐溶液的浓度在2.10～10μg/ml范围内，与抑菌圈直径有较好的量效关系。 2.2.3精密度试验取标准品溶液，稀释至6.4μg/ml，按上述条件重复测定5次，精密测量各抑菌圈直径D值，计算相对标准偏差RSD值低于1%，具有较好的精密度。
2.2.4中间精密度试验邀请不同试验人员，在不同时间，取标准品溶液，稀释至6.4μg/ml，按上述条件重复测定5次，精密测量各抑菌圈直径D值计算RSD值均低于2%，具有较好的中间精密度。
2.2.5稳定性试验取供试品溶液，分别于0、l、4、8、24h按上述条件测定各抑菌圈直径D值，计算RSD值均低于2%。结果表明，标准品溶液在24h内稳定性良好。
2.2.6 重复性试验取标准品溶液，稀释至6.4μg/ml，共5份，按上述条件测定各抑菌圈直径D值，计算RSD低于1%。结果表明，所采用的测定方法重复性良好。
2.3试验设计采用量反应平行线（3·3）法，随机区组设计实验，将标准品溶液和供试品溶液按照1∶0.8随机分成高、中、低6组，前三组接受标准品的3个剂量，后三组接受供试品的3个剂量。取6只制备完成的双碟，在每一双碟中一侧的3个牛津杯分别滴加高（SH）、中（SM）、低（SL）浓度的庆大霉素磷酸盐溶液，另一侧3个牛津杯分别滴加高（TH）、中（TM）、低（TL）3种浓度的双黄连口服液供试品溶液，加样量均为0.3ml，于37℃恒温培养箱中培养20h后，精密测量各个抑菌圈直径，使用生物检定统计程序BS2000版[6-7]中的（3·3）法进行可靠性测验、效价计算和试验误差估计。
2.4结果与小结
2.4.1效价计算结果，结果见表2。
2.4.2小结试验应用生物检定中的管碟法对不同厂家的双黄连口服液进行抑菌效价的检测，实验结果均能通过可靠性检测，表明双黄连制剂可以通过量反应平行線（3·3）法进行效价计算和实验误差估计。由于1ml供试品溶液中含有0.5ml双黄连口服液，上述检测结果经过换算可以得出，不同厂家的双黄连制剂抑菌效价存在差异，抗菌效价为10.278～15.7276U，因此暂定每1ml双黄连口服液抑菌效价不得低于9.3300U。
3讨论
3.1管碟法检测条件的选择与优化按照中国药典（2010年版）二部微生物鉴定法管碟法测定样品对双碟中培养菌产生的抑菌圈，应用单因素实验法确定培养菌接种量和培养时间对抑菌圈的影响。
3.2培养菌接种量的考察应用第3代金黄色葡萄球菌，菌悬液浊度分别调整为0.5、1.0、1.5、2.0麦氏比浊标准（MCF）。结果表明，菌悬液浊度在0.5～2.0MCF范围内，抑菌圈直径不明显，当接种量为2.0MCF时，菌层生长良好并且抑菌圈分界清晰，因此2.0MCF为适宜的培养菌接种量。
3.3培养时间的考察在相同条件下，分别考察14.0、14.5、15.0、15.5、16.0h等不同培养时间对试验抑菌圈产生的影响。结果表明，培养时间为15.0h时抑菌圈直径（即效应值）较大，菌层生长良好并且抑菌圈分界清晰。因此培养时间选定为15.0h。
参考文献
[1] 肖小河，金城，赵中振，等.论中药质量控制与评价模式的创新与发展[J].中国中药杂志，2007，32（14）：1377-1381.
[2] 方艺霖.含小檗碱类中药品质生物评价与控制的初步研究[D].成都：成都中医药大学，2008：35-48.
[3] 王小平，刘雅华.贵州省习用金银花抑菌作用初探[J].中国民族民间医药，1998，6（34）：40-41.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典二部[S].北京：化学工业出版社.2010：附录93-95.
[5] 王美珍.培养基对抗生素效价测定的影响[J].中国民族民间医药，2010，18（3）：68.
[6] 沈连忠，李波.中国药典生物检定统计软件BS2000For Windows9X[J].中国卫生统计，2000，17（6）：330.
[7] 张媛，谭德讲.中国药典生物检定统计实例不同计算方式结果比较和几点修改建议[J].药物分析杂志2013，33（11）：1858-1861.
（收稿日期：2015.01.22）