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摘要：目的：研究确认盐酸丙美卡因滴眼液有关物质检测和含量检测方法的可行性。方法：采用高效液相色谱法，对盐酸丙美卡因滴眼液有关物质和含量的检查方法进行研究。结果：通过系统适用性试验、回收率试验、精密度试验，确定了盐酸丙美卡因滴眼液有关物质和含量各项检测条件的合理性。结论：可采用高效液相色谱法进行本品盐酸丙美卡因的有关物质和含量检测。
关键词： 盐酸丙美卡因滴眼液 有关物质 含量 高效液相色谱法
[Abstract] Objective： To confirm the feasibility of the detection of related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops.Methods： To study the detection of related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops through high performance liquid chromatography （HPLC）. Results： It is determined that the detection method for related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops is appropriate by the system suitability test， recovery and precision test. Conclusion： HPLC can be used to detect the related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops.
[Key words] Key words： proparacaine hydrochloride eye drops， related substance， content， High performance liquid chromatography （HPLC）
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章編号】2107-2306（2021）07-063-02
盐酸丙美卡因滴眼液有关物质和含量检测方法的可行性，将直接影响到产品上市后的有效性、安全性和质量稳定性。故本次采用高效液相色谱法，通过系统适用性试验、回收率试验、精密度试验，确定了盐酸丙美卡因滴眼液有关物质和含量各项检测条件的合理性。从而确认盐酸丙美卡因的有关物质和含量检测检测方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-10ATVP泵，岛津SPD-10AVP检测器，TL-9900色谱数据工作站，MS205DU电子天平
1.2 试药
磷酸二氢钾（分析纯，北京益利精细化学品公司），庚烷磺酸钠（色谱纯 进口），三乙胺（色谱纯 进口），甲醇（色谱纯，北京益利精细化学品公司）
2.有关物质检测方法研究
采用高效液相色谱法，对本品有关物质的检查方法进行研究，照中国药典2015年版四部0512[1]。
2.1色谱条件
色谱柱：Inertsil Ph-3苯基柱，250mm×4.6mm，5m
参照英国药典盐酸丙美卡因质量标准 [2]，有关物质检查色谱条件以磷酸盐缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾、0.02mol/L庚烷磺酸钠，三乙胺调pH值至5.2）-甲醇（38：62） 为流动相。
检测波长232nm。
以上述色谱条件进行系统适用性试验。
2.2系统适用性试验
取5份盐酸丙美卡因滴眼液，每份2ml（约相当于盐酸丙美卡因10mg），置10ml试管中，分别加1.0mol/L盐酸1ml，1.0mol/L氢氧化钠溶液1ml，30%双氧水1ml，放置3天，另两份分别在105℃恒温箱和4500lx±500lx强光下放置3天，取上述样品及未破坏样品，加甲醇制成1mg/ml的溶液（酸碱破坏的样品分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液和1.0mol/L盐酸调至中性后配制），摇匀，滤过。
另取相当于盐酸丙美卡因10mg的空白辅料，置于10ml试管中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得空白辅料测试液。
取上述溶液各10l，分别注入液相色谱仪，结果见表1。
结论：在上述色谱条件下，各降解产物均能与盐酸丙美卡因主峰分离，符合系统适用性试验要求。
2.3测定法
取最低装量检查项下内容物适量（约相当于盐酸丙美卡因10mg），置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照溶液。精密量取对照溶液10l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%-20%。再精密量取对照溶液和供试品溶液各10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3.5倍。扣除空白辅料峰，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液峰面积的1.0倍（1.0%），各杂质峰面积总和不得大于对照溶液的峰面积1.5倍（1.5%）。
2.4有关物质测定
取本品，照有关物质测定法项下的方法测定，结果见表2。 结论：放大三批样品单一杂质均小于1.0%，有关物质均小于1.5%
有关物质方法学研究结果表明：用高效液相色谱法测定本品的有关物质，其方法准确度高、适应性强，可采用高效液相色谱法进行本品盐酸丙美卡因的有关物质检测。
3.含量检测方法研究
选用准确性好，专属性强，灵敏度高的HPLC法，对盐酸丙美卡因滴眼液的含量进行了测定。
3.1色谱条件及方法
以苯基硅烷键合硅胶为填充剂：以磷酸盐缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾、0.02mol/L庚烷磺酸钠，三乙胺调pH值至5.2）-甲醇（38：62） 为流动相。检测波长270nm。理论板数按盐酸丙美卡因峰计算应不低于3000。
取样品适量，用水稀释成20g/ml的溶液，作为供试品溶液，另取盐酸丙美卡因对照品适量同法配制，作为对照溶液。取上述溶液各20l注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
3.2 方法的建立
3.2.1检测波长的確定和辅料干扰性试验 盐酸丙美卡因以水为溶剂，在232nm、268nm、310nm处均有较强的吸收，均能作为含量测定的检测波长，考虑到采用高效液相色谱法测定含量，选择高波长可以减少干扰，另参照英国药典标准盐酸丙美卡因滴眼液（爱尔凯因）X20070130质量标准，选择270nm为含量测定的检测波长。经考察在此波长处辅料不干扰主峰的检测。
3.2.2 含量测定线性范围 取盐酸丙美卡因约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取母液1ml，分别置于10ml、25ml、50ml量瓶中，加水稀释至刻度，另分别精密量取母液2ml、5ml、溶液分别置于10ml量瓶中，用水稀释至刻度，取上述溶液及母液作为供试品溶液。取上述溶液各20l，注入液相色谱仪，记录峰面积，结果见表3。
结论：以峰面积对浓度计算，线性方程为：A=122.9C+214.4相关系数r=0.9999，盐酸丙美卡因在4.08g/ml～204.00g/ml范围内，呈线性关系。
3.2.3盐酸丙美卡因含量测定的回收率试验 取盐酸丙美卡因对照品16mg、20mg、24mg，精密称定，分置100ml容量瓶中，加水适量使溶解，按处方比例加入空白辅料，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度作为供试品溶液，三种浓度各平行配制三份。另精密称取盐酸丙美卡因对照品适量，用水配制成20g/ml的溶液作为对照溶液，取上述溶液各20l注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。结果见表4。
结论：用高效液相色谱法测定盐酸丙美卡因的含量，准确度高。
3.2.4精密度试验 取含量测定项下溶液，照含量测定方法平行测定6份，结果见表5。
结论：6份样品的相对标准偏差小于2%，说明该法精密度好。
3.2.5盐酸丙美卡因溶液的稳定性 取精密度试验项下的溶液1份，于8小时内测定5次。结果见表6。
结论：盐酸丙美卡因滴眼液中盐酸丙美卡因8小时内稳定。
3.2.6含量测定 按以上方法测定三批放大样品的含量，结果见表7。
结论：本品三批放大样品的含量均在95.0%～110.0%的范围内。
含量方法学研究结果表明：用高效液相色谱法测定本品的含量，其方法准确度高、重现性好，在4.08g/ml～204.00g/ml浓度范围内，浓度与峰面积线性良好，测定波长处空白辅料对主药的检测无干扰，溶液8小时内稳定性良好，可采用高效液相色谱法进行本品盐酸丙美卡因的含量检测。
参考文献：
[1] 蔡红 浩云涛 薛军等 高效液相色谱法 中国药典四部[M]. 15版.北京：中国医药科技出版社， 2015：59-61
[2] 英国药典委员会 盐酸丙美卡因 英国药典第二卷[M]. 07版.伦敦：文具办公室， 2007：1743-1744
关键词： 盐酸丙美卡因滴眼液 有关物质 含量 高效液相色谱法
[Abstract] Objective： To confirm the feasibility of the detection of related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops.Methods： To study the detection of related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops through high performance liquid chromatography （HPLC）. Results： It is determined that the detection method for related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops is appropriate by the system suitability test， recovery and precision test. Conclusion： HPLC can be used to detect the related substance and its content in proparacaine hydrochloride eye drops.
[Key words] Key words： proparacaine hydrochloride eye drops， related substance， content， High performance liquid chromatography （HPLC）
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章編号】2107-2306（2021）07-063-02
盐酸丙美卡因滴眼液有关物质和含量检测方法的可行性，将直接影响到产品上市后的有效性、安全性和质量稳定性。故本次采用高效液相色谱法，通过系统适用性试验、回收率试验、精密度试验，确定了盐酸丙美卡因滴眼液有关物质和含量各项检测条件的合理性。从而确认盐酸丙美卡因的有关物质和含量检测检测方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-10ATVP泵，岛津SPD-10AVP检测器，TL-9900色谱数据工作站，MS205DU电子天平
1.2 试药
磷酸二氢钾（分析纯，北京益利精细化学品公司），庚烷磺酸钠（色谱纯 进口），三乙胺（色谱纯 进口），甲醇（色谱纯，北京益利精细化学品公司）
2.有关物质检测方法研究
采用高效液相色谱法，对本品有关物质的检查方法进行研究，照中国药典2015年版四部0512[1]。
2.1色谱条件
色谱柱：Inertsil Ph-3苯基柱，250mm×4.6mm，5m
参照英国药典盐酸丙美卡因质量标准 [2]，有关物质检查色谱条件以磷酸盐缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾、0.02mol/L庚烷磺酸钠，三乙胺调pH值至5.2）-甲醇（38：62） 为流动相。
检测波长232nm。
以上述色谱条件进行系统适用性试验。
2.2系统适用性试验
取5份盐酸丙美卡因滴眼液，每份2ml（约相当于盐酸丙美卡因10mg），置10ml试管中，分别加1.0mol/L盐酸1ml，1.0mol/L氢氧化钠溶液1ml，30%双氧水1ml，放置3天，另两份分别在105℃恒温箱和4500lx±500lx强光下放置3天，取上述样品及未破坏样品，加甲醇制成1mg/ml的溶液（酸碱破坏的样品分别用1.0mol/L氢氧化钠溶液和1.0mol/L盐酸调至中性后配制），摇匀，滤过。
另取相当于盐酸丙美卡因10mg的空白辅料，置于10ml试管中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得空白辅料测试液。
取上述溶液各10l，分别注入液相色谱仪，结果见表1。
结论：在上述色谱条件下，各降解产物均能与盐酸丙美卡因主峰分离，符合系统适用性试验要求。
2.3测定法
取最低装量检查项下内容物适量（约相当于盐酸丙美卡因10mg），置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照溶液。精密量取对照溶液10l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%-20%。再精密量取对照溶液和供试品溶液各10l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3.5倍。扣除空白辅料峰，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液峰面积的1.0倍（1.0%），各杂质峰面积总和不得大于对照溶液的峰面积1.5倍（1.5%）。
2.4有关物质测定
取本品，照有关物质测定法项下的方法测定，结果见表2。 结论：放大三批样品单一杂质均小于1.0%，有关物质均小于1.5%
有关物质方法学研究结果表明：用高效液相色谱法测定本品的有关物质，其方法准确度高、适应性强，可采用高效液相色谱法进行本品盐酸丙美卡因的有关物质检测。
3.含量检测方法研究
选用准确性好，专属性强，灵敏度高的HPLC法，对盐酸丙美卡因滴眼液的含量进行了测定。
3.1色谱条件及方法
以苯基硅烷键合硅胶为填充剂：以磷酸盐缓冲液（0.05mol/L磷酸二氢钾、0.02mol/L庚烷磺酸钠，三乙胺调pH值至5.2）-甲醇（38：62） 为流动相。检测波长270nm。理论板数按盐酸丙美卡因峰计算应不低于3000。
取样品适量，用水稀释成20g/ml的溶液，作为供试品溶液，另取盐酸丙美卡因对照品适量同法配制，作为对照溶液。取上述溶液各20l注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
3.2 方法的建立
3.2.1检测波长的確定和辅料干扰性试验 盐酸丙美卡因以水为溶剂，在232nm、268nm、310nm处均有较强的吸收，均能作为含量测定的检测波长，考虑到采用高效液相色谱法测定含量，选择高波长可以减少干扰，另参照英国药典标准盐酸丙美卡因滴眼液（爱尔凯因）X20070130质量标准，选择270nm为含量测定的检测波长。经考察在此波长处辅料不干扰主峰的检测。
3.2.2 含量测定线性范围 取盐酸丙美卡因约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液，精密量取母液1ml，分别置于10ml、25ml、50ml量瓶中，加水稀释至刻度，另分别精密量取母液2ml、5ml、溶液分别置于10ml量瓶中，用水稀释至刻度，取上述溶液及母液作为供试品溶液。取上述溶液各20l，注入液相色谱仪，记录峰面积，结果见表3。
结论：以峰面积对浓度计算，线性方程为：A=122.9C+214.4相关系数r=0.9999，盐酸丙美卡因在4.08g/ml～204.00g/ml范围内，呈线性关系。
3.2.3盐酸丙美卡因含量测定的回收率试验 取盐酸丙美卡因对照品16mg、20mg、24mg，精密称定，分置100ml容量瓶中，加水适量使溶解，按处方比例加入空白辅料，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置10ml容量瓶中，用水稀释至刻度作为供试品溶液，三种浓度各平行配制三份。另精密称取盐酸丙美卡因对照品适量，用水配制成20g/ml的溶液作为对照溶液，取上述溶液各20l注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。结果见表4。
结论：用高效液相色谱法测定盐酸丙美卡因的含量，准确度高。
3.2.4精密度试验 取含量测定项下溶液，照含量测定方法平行测定6份，结果见表5。
结论：6份样品的相对标准偏差小于2%，说明该法精密度好。
3.2.5盐酸丙美卡因溶液的稳定性 取精密度试验项下的溶液1份，于8小时内测定5次。结果见表6。
结论：盐酸丙美卡因滴眼液中盐酸丙美卡因8小时内稳定。
3.2.6含量测定 按以上方法测定三批放大样品的含量，结果见表7。
结论：本品三批放大样品的含量均在95.0%～110.0%的范围内。
含量方法学研究结果表明：用高效液相色谱法测定本品的含量，其方法准确度高、重现性好，在4.08g/ml～204.00g/ml浓度范围内，浓度与峰面积线性良好，测定波长处空白辅料对主药的检测无干扰，溶液8小时内稳定性良好，可采用高效液相色谱法进行本品盐酸丙美卡因的含量检测。
参考文献：
[1] 蔡红 浩云涛 薛军等 高效液相色谱法 中国药典四部[M]. 15版.北京：中国医药科技出版社， 2015：59-61
[2] 英国药典委员会 盐酸丙美卡因 英国药典第二卷[M]. 07版.伦敦：文具办公室， 2007：1743-1744