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摘要 [目的]建立砂梨抗枝干轮纹病的鉴定方法。[方法]采用轮纹病菌菌丝块、分生孢子悬浮液分别以离体和活体接种砂梨1年生枝条，比较发病时间、发病率、调查时间和接种工作量，并采用菌丝块针刺接种活体枝条的方法对德胜香×西子绿的223株F1代群体进行抗性评价。[结果]以菌丝块针刺法接种活体枝条发病率高、接种效果最好，可充分评价梨树对枝干轮纹病的抗性。采用菌丝块针刺接种活体枝条的方法，德胜香×西子绿的223株F1代群体中高抗单株有33株，抗性单株有41株，中抗单株有83株，感病单株有31株，高感单株有35株。[结论]试验结果为砂梨抗枝干轮纹病育种提供了参考。
关键词 砂梨； 枝干轮纹病； 抗性评价
中图分类号 S436.612.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-162-02
Abstract [Objective] The aim was to establish one identification method for trunk ring rot disease of sand pear. [Method] The resistant evaluation of individual plant was inoculated with mycelia disc and spore suspension in vitro and in vivo， and disease time， disease rate， investigation method and inoculated work amount were compared. The resistance identification of 223 F1 plants of Deshengnxiang×Xizilv was identified with mycelia disc in vivo. [Result] The disease incidence and index with mycelia disc was higher than that of the spore suspension， and the disease incidence and index of in vivo was also higher than that of in vitro， which suggested that inoculation with mycelia disc in vivo was fit for resistance identification of trunk ring rot disease of sand pear. Among 223 F1 plants of Deshengnxiang×Xizilv， 33 F1 plants were high resistant； 41 plants were resistant； 83 plants were middle resistant， 31 plants were sensitive and 35 plants were high sensitive. [Conclusion] The results provide reference for resistant breeding of sand pear to trunk ring rot disease.
Key words Sand pear； Trunk ring rot disease； Resistant identification
梨是我國近年来发展迅速的水果之一，其栽培面积和总产量在国内位居第3位。在生产上，梨轮纹病是最严重的病害之一。尤其在南方砂梨产区，由于高温、高湿的气候条件易于轮纹病的发生，且主栽品种对轮纹病抗性弱，轮纹病发生尤其严重[1]。轮纹病病原菌为Botryosphaeria. dothidea （Moug ：Fr） Ces&De Not，主要为害枝干和果实，导致枝干粗皮、果实腐烂，严重影响树势和果实产量。近年来，随着砂梨套袋技术的普及，果实轮纹病的发生较轻，果农对轮纹病的防治也不重视，从而导致枝干轮纹病的发生日益严重。挖掘抗性资源、培育抗性品种是解决生产上轮纹病危害最有效的方法[2]。为此，笔者以轮纹病菌菌丝块、分生孢子悬浮液针刺接种砂梨1年生离体和活体枝条，通过对发病时间、发病率、调查时间、接种工作量的比较确定了一种砂梨对枝干轮纹病抗性的接种方法，根据发病症状的严重程度制定了抗性分级标准，并以该评价体系对德胜香×西子绿的F1代群体223株进行了抗性评价，旨在为砂梨抗枝干轮纹病的QTL定位提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
供试砂梨品种（单株）：德胜香、西子绿、德胜香×西子绿的F1代群体223株，其中德胜香为高抗枝干轮纹病品种，西子绿为高感枝干轮纹病品种。分别将德胜香、西子绿及223株F1代单株以砧木嫁接，每个单株（品种）嫁接5棵，供抗性评价。
1.2 方法
1.2.1
轮纹病菌的分离与培养。采集西子绿发病枝条病瘤，以75%乙醇消毒30 s后，无菌水漂洗，置于PDA培养基上，28 ℃光照培养，2 d后可见轮纹病菌菌丝长出。挑菌落边缘菌丝置于新的PDA培养基上培养，以备抗性鉴定。
1.2.2
接种方法。
1.2.2.1
分生孢子悬浮液接种。轮纹病菌接种于PDA培养基上，28 ℃普通光照培养5 d后，置于25 W黑光灯下培养，诱导产孢[3]。待分生孢子长出后，取分生孢子器加无菌水研磨，纱布过滤，制成孢子液，以显微镜镜检，调孢子浓度为1×105个/ml。将每根梨树枝条以细针轻刺3个点，各点之间距离约为10 cm，再以喷雾接种轮纹病菌分生孢子悬浮液，接种后用保鲜膜覆盖保湿。 1.2.2.2
菌丝块接种。轮纹病菌接种于PDA培养基上，28 ℃普通光照培养5 d后，以5 mm打孔器取轮纹病菌菌落边缘幼嫩菌丝块。将每根梨树枝条以细针轻刺3个点，各点之间距离约为10 cm，再将有菌丝一面贴在刺伤处，接种后用保鲜膜覆盖保湿。
上述2种接种方法中，枝条分别以活体和离体2种方式进行接种。以抗性亲本德胜香与感病亲本西子绿作为参照。每个处理中，每个品种（单株）各取生长一致的枝条3根。离体枝条长度约为30 cm。活体接种在室外自然环境中进行。离体枝条接种后，枝条底部以脱脂棉包裹保湿，置于人工气候箱，在温度28 ℃、湿度90%以上条件下培养。接种时间在4月末，分别在接种7、14、21 d后调查。
1.2.3
德胜香×西子绿的F1代群体抗性评价。以菌丝块针刺接种法对德胜香×西子绿的F1代群体进行抗性评价。采用活体接种1年生枝条。接种方法同“1.2.2”。以抗性亲本德胜香与感病亲本西子绿作参照， 14 d后调查发病情况。记录病斑面积，计算平均发病面积/接种点，根据抗性分级标准进行评价。
2 结果与分析
2.1 接种法比较
通过对不同接种方法的发病时间、发病率、最适调查时间、接种工作量的比较，结果表明以菌丝块针刺法接种活体枝条最适于抗性评价（表1），以菌丝块针刺法接种活体枝条3 d后即可见病斑，7 d病斑明显，14 d后病斑进一步扩大。调查显示，223个F1单株中，发病单株有190株，发病率为85.7%，发病效果明显优于其他3种接种方法，能充分评价梨树对枝干轮纹病的抗性。且接种点病斑清晰易调查，耗时短，不足之处在于接种工作量较大。
总体来看，菌丝块接种较分生孢子悬浮液接种好，发病时间短，接种点明显、易调查，发病效果好。而活体接种较离体接种好，主要是由于离体接种枝条易干枯或霉烂，直接影响接种结果。
2.2 抗性分级标准的建立
在以菌丝块针刺接种活体枝条试验中，西子绿枝条平均每个接种点病斑面积为9.0 mm2，而德胜香枝条未见病斑或可见少量愈伤组织。以此为参照，以平均病斑面积在9.0 mm2以上的单株为高感（HS）轮纹病菌株，以平均病斑面积在1.0 mm2以下的单株为高抗（HR）轮纹病菌株。再根据实际发病情况，以平均病斑面积在1.0～1.9 mm2为抗性（R）单株，以平均病斑面积在2.0～4.9 mm2为中性（MR）单株，以平均病斑面积在5.0～8.9 mm2为感病（S）单株。
2.3 德胜香×西子绿的F1代群体抗性评价
根据“2.2”分级标准，统计223株F1代单株发病情况。由表2可知，F1代群体高抗单株数占14.8%，抗性单株数占18.4%，中抗单株数占37.2%，感病单株数占13.9%，高感病单株数占15.7%。平均病斑面积与感病亲本西子绿相当的亲本有16株。部分高感单株发病症状较西子绿更严重，其中，平均病斑面积大于15.0 mm2的单株有12株。
3 讨论
人工接种是鉴定植物对病原菌抗性最基本的方法。不同的接种体、不同接种方法和条件对抗性鉴定均有一定的影响。在《梨种质资源描述规范和数据标准》中[4]，梨轮纹病抗性评价方法以轮纹病菌分生孢子液喷雾接种梨果实为标准，无枝干轮纹病的抗性评价标准。在苹果上，周增强等[5-6]比较了分生孢子液涂抹、滤纸条蘸液、点滴法和菌丝体接种的方法，发现无论用分生孢子还是菌丝体作为接种体，无论接种枝条还是果实都能致病，但是菌丝接种的发病率和病情指数明显高于分生孢子接种。周增强等[5]还根据菌丝体接种产生症状的严重度制定了人工调查的标准，用于抗性鉴定和病菌的致病力测定。分级标準分为0、1、3、5、7、9级，以枝条病瘤数量及增粗度为依据。但采用该方法接种，35～40 d后才开始发病，且当年5～7月接种，4～5个月以后才能调查，从而使整个鉴定评价时间较长。
为了摸索出一种砂梨抗枝干轮纹病的快速鉴定方法，该研究以轮纹病菌菌丝块、分生孢子悬浮液分别接种活体枝条与离体枝条，枝条均以细针轻轻刺伤作为接种点，每个处理均设3个重复。结果表明，以菌丝块接种活体枝条最佳，发病快，且接种点与病斑清晰易调查，不足之处在于接种工作量大；以菌丝块接种离体枝条，较活体接种容易，但接种条件难以控制，湿度低，枝条易干枯；湿度高，枝条又易腐烂发霉，不能真实反映发病症状，尤其是嫩梢，几乎全部腐烂发霉；以分生孢子接种最方便、省力。但是，在该试验过程中，无论是分生孢子诱导还是接种效果都不稳定，且发病率低，不适合作抗性评价方法。
与周增强等[5]的接种方法相比，以菌丝块针刺法接种枝条，3 d后即可发病，7 d后病斑明显，14 d后观察病斑面积较7 d时稍大，21 d后观察病斑面积与14 d时相比无明显变化。因此，整个抗性鉴定过程可在14 d内完成，缩短了时间。以该方法对德胜香×西子绿的F1代群体进行抗性评价。结果表明，F1代群体中高抗单株有33株，抗性单株有41株，中抗单株有83株，感病单株有31株，高感单株有35株，符合正态分布，同时也说明梨树对枝干轮纹病的抗性是多个基因决定的数量性状，为砂梨抗枝干轮纹病的QTL定位奠定了基础。
参考文献
[1] 刘先琴，秦仲麒，李先明，等.武汉地区梨轮纹病发生重的原因与防治技术[J].湖北农业科学，2006，45（5）：606-607.
[2] 国立耘，李金云，李保华，等.中国苹果枝干轮纹病发生和防治情况[J].植物保护，2009，35（4）：120-123.
[3] 张丽丽，常有宏，陈志宜.梨轮纹病菌培养特性研究[J].果树学报，2009，26（4）：520-524.
[4] 曹玉芬，刘凤之，胡红菊，等.梨种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2006.
[5] 周增强，侯珲，王丽，等.枝干苹果轮纹病人工接种方法与品种抗性评价[J].果树学报，2010，27（6）：952-955.
[6] 林月丽，黄丽丽，康振生，等.苹果轮纹病室内快速评价体系的建立[J].植物保护学报，2011，38（1）：37-41.
关键词 砂梨； 枝干轮纹病； 抗性评价
中图分类号 S436.612.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-162-02
Abstract [Objective] The aim was to establish one identification method for trunk ring rot disease of sand pear. [Method] The resistant evaluation of individual plant was inoculated with mycelia disc and spore suspension in vitro and in vivo， and disease time， disease rate， investigation method and inoculated work amount were compared. The resistance identification of 223 F1 plants of Deshengnxiang×Xizilv was identified with mycelia disc in vivo. [Result] The disease incidence and index with mycelia disc was higher than that of the spore suspension， and the disease incidence and index of in vivo was also higher than that of in vitro， which suggested that inoculation with mycelia disc in vivo was fit for resistance identification of trunk ring rot disease of sand pear. Among 223 F1 plants of Deshengnxiang×Xizilv， 33 F1 plants were high resistant； 41 plants were resistant； 83 plants were middle resistant， 31 plants were sensitive and 35 plants were high sensitive. [Conclusion] The results provide reference for resistant breeding of sand pear to trunk ring rot disease.
Key words Sand pear； Trunk ring rot disease； Resistant identification
梨是我國近年来发展迅速的水果之一，其栽培面积和总产量在国内位居第3位。在生产上，梨轮纹病是最严重的病害之一。尤其在南方砂梨产区，由于高温、高湿的气候条件易于轮纹病的发生，且主栽品种对轮纹病抗性弱，轮纹病发生尤其严重[1]。轮纹病病原菌为Botryosphaeria. dothidea （Moug ：Fr） Ces&De Not，主要为害枝干和果实，导致枝干粗皮、果实腐烂，严重影响树势和果实产量。近年来，随着砂梨套袋技术的普及，果实轮纹病的发生较轻，果农对轮纹病的防治也不重视，从而导致枝干轮纹病的发生日益严重。挖掘抗性资源、培育抗性品种是解决生产上轮纹病危害最有效的方法[2]。为此，笔者以轮纹病菌菌丝块、分生孢子悬浮液针刺接种砂梨1年生离体和活体枝条，通过对发病时间、发病率、调查时间、接种工作量的比较确定了一种砂梨对枝干轮纹病抗性的接种方法，根据发病症状的严重程度制定了抗性分级标准，并以该评价体系对德胜香×西子绿的F1代群体223株进行了抗性评价，旨在为砂梨抗枝干轮纹病的QTL定位提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
供试砂梨品种（单株）：德胜香、西子绿、德胜香×西子绿的F1代群体223株，其中德胜香为高抗枝干轮纹病品种，西子绿为高感枝干轮纹病品种。分别将德胜香、西子绿及223株F1代单株以砧木嫁接，每个单株（品种）嫁接5棵，供抗性评价。
1.2 方法
1.2.1
轮纹病菌的分离与培养。采集西子绿发病枝条病瘤，以75%乙醇消毒30 s后，无菌水漂洗，置于PDA培养基上，28 ℃光照培养，2 d后可见轮纹病菌菌丝长出。挑菌落边缘菌丝置于新的PDA培养基上培养，以备抗性鉴定。
1.2.2
接种方法。
1.2.2.1
分生孢子悬浮液接种。轮纹病菌接种于PDA培养基上，28 ℃普通光照培养5 d后，置于25 W黑光灯下培养，诱导产孢[3]。待分生孢子长出后，取分生孢子器加无菌水研磨，纱布过滤，制成孢子液，以显微镜镜检，调孢子浓度为1×105个/ml。将每根梨树枝条以细针轻刺3个点，各点之间距离约为10 cm，再以喷雾接种轮纹病菌分生孢子悬浮液，接种后用保鲜膜覆盖保湿。 1.2.2.2
菌丝块接种。轮纹病菌接种于PDA培养基上，28 ℃普通光照培养5 d后，以5 mm打孔器取轮纹病菌菌落边缘幼嫩菌丝块。将每根梨树枝条以细针轻刺3个点，各点之间距离约为10 cm，再将有菌丝一面贴在刺伤处，接种后用保鲜膜覆盖保湿。
上述2种接种方法中，枝条分别以活体和离体2种方式进行接种。以抗性亲本德胜香与感病亲本西子绿作为参照。每个处理中，每个品种（单株）各取生长一致的枝条3根。离体枝条长度约为30 cm。活体接种在室外自然环境中进行。离体枝条接种后，枝条底部以脱脂棉包裹保湿，置于人工气候箱，在温度28 ℃、湿度90%以上条件下培养。接种时间在4月末，分别在接种7、14、21 d后调查。
1.2.3
德胜香×西子绿的F1代群体抗性评价。以菌丝块针刺接种法对德胜香×西子绿的F1代群体进行抗性评价。采用活体接种1年生枝条。接种方法同“1.2.2”。以抗性亲本德胜香与感病亲本西子绿作参照， 14 d后调查发病情况。记录病斑面积，计算平均发病面积/接种点，根据抗性分级标准进行评价。
2 结果与分析
2.1 接种法比较
通过对不同接种方法的发病时间、发病率、最适调查时间、接种工作量的比较，结果表明以菌丝块针刺法接种活体枝条最适于抗性评价（表1），以菌丝块针刺法接种活体枝条3 d后即可见病斑，7 d病斑明显，14 d后病斑进一步扩大。调查显示，223个F1单株中，发病单株有190株，发病率为85.7%，发病效果明显优于其他3种接种方法，能充分评价梨树对枝干轮纹病的抗性。且接种点病斑清晰易调查，耗时短，不足之处在于接种工作量较大。
总体来看，菌丝块接种较分生孢子悬浮液接种好，发病时间短，接种点明显、易调查，发病效果好。而活体接种较离体接种好，主要是由于离体接种枝条易干枯或霉烂，直接影响接种结果。
2.2 抗性分级标准的建立
在以菌丝块针刺接种活体枝条试验中，西子绿枝条平均每个接种点病斑面积为9.0 mm2，而德胜香枝条未见病斑或可见少量愈伤组织。以此为参照，以平均病斑面积在9.0 mm2以上的单株为高感（HS）轮纹病菌株，以平均病斑面积在1.0 mm2以下的单株为高抗（HR）轮纹病菌株。再根据实际发病情况，以平均病斑面积在1.0～1.9 mm2为抗性（R）单株，以平均病斑面积在2.0～4.9 mm2为中性（MR）单株，以平均病斑面积在5.0～8.9 mm2为感病（S）单株。
2.3 德胜香×西子绿的F1代群体抗性评价
根据“2.2”分级标准，统计223株F1代单株发病情况。由表2可知，F1代群体高抗单株数占14.8%，抗性单株数占18.4%，中抗单株数占37.2%，感病单株数占13.9%，高感病单株数占15.7%。平均病斑面积与感病亲本西子绿相当的亲本有16株。部分高感单株发病症状较西子绿更严重，其中，平均病斑面积大于15.0 mm2的单株有12株。
3 讨论
人工接种是鉴定植物对病原菌抗性最基本的方法。不同的接种体、不同接种方法和条件对抗性鉴定均有一定的影响。在《梨种质资源描述规范和数据标准》中[4]，梨轮纹病抗性评价方法以轮纹病菌分生孢子液喷雾接种梨果实为标准，无枝干轮纹病的抗性评价标准。在苹果上，周增强等[5-6]比较了分生孢子液涂抹、滤纸条蘸液、点滴法和菌丝体接种的方法，发现无论用分生孢子还是菌丝体作为接种体，无论接种枝条还是果实都能致病，但是菌丝接种的发病率和病情指数明显高于分生孢子接种。周增强等[5]还根据菌丝体接种产生症状的严重度制定了人工调查的标准，用于抗性鉴定和病菌的致病力测定。分级标準分为0、1、3、5、7、9级，以枝条病瘤数量及增粗度为依据。但采用该方法接种，35～40 d后才开始发病，且当年5～7月接种，4～5个月以后才能调查，从而使整个鉴定评价时间较长。
为了摸索出一种砂梨抗枝干轮纹病的快速鉴定方法，该研究以轮纹病菌菌丝块、分生孢子悬浮液分别接种活体枝条与离体枝条，枝条均以细针轻轻刺伤作为接种点，每个处理均设3个重复。结果表明，以菌丝块接种活体枝条最佳，发病快，且接种点与病斑清晰易调查，不足之处在于接种工作量大；以菌丝块接种离体枝条，较活体接种容易，但接种条件难以控制，湿度低，枝条易干枯；湿度高，枝条又易腐烂发霉，不能真实反映发病症状，尤其是嫩梢，几乎全部腐烂发霉；以分生孢子接种最方便、省力。但是，在该试验过程中，无论是分生孢子诱导还是接种效果都不稳定，且发病率低，不适合作抗性评价方法。
与周增强等[5]的接种方法相比，以菌丝块针刺法接种枝条，3 d后即可发病，7 d后病斑明显，14 d后观察病斑面积较7 d时稍大，21 d后观察病斑面积与14 d时相比无明显变化。因此，整个抗性鉴定过程可在14 d内完成，缩短了时间。以该方法对德胜香×西子绿的F1代群体进行抗性评价。结果表明，F1代群体中高抗单株有33株，抗性单株有41株，中抗单株有83株，感病单株有31株，高感单株有35株，符合正态分布，同时也说明梨树对枝干轮纹病的抗性是多个基因决定的数量性状，为砂梨抗枝干轮纹病的QTL定位奠定了基础。
参考文献
[1] 刘先琴，秦仲麒，李先明，等.武汉地区梨轮纹病发生重的原因与防治技术[J].湖北农业科学，2006，45（5）：606-607.
[2] 国立耘，李金云，李保华，等.中国苹果枝干轮纹病发生和防治情况[J].植物保护，2009，35（4）：120-123.
[3] 张丽丽，常有宏，陈志宜.梨轮纹病菌培养特性研究[J].果树学报，2009，26（4）：520-524.
[4] 曹玉芬，刘凤之，胡红菊，等.梨种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2006.
[5] 周增强，侯珲，王丽，等.枝干苹果轮纹病人工接种方法与品种抗性评价[J].果树学报，2010，27（6）：952-955.
[6] 林月丽，黄丽丽，康振生，等.苹果轮纹病室内快速评价体系的建立[J].植物保护学报，2011，38（1）：37-41.