论文部分内容阅读
摘要[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因（登录号：DQ661682）序列，设计含有酶切位点的一对特异性引物，以紫花苜蓿cDNA为模板，获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列，并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置，构建植物表达载体35S∷MsCOL1，再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示，所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RTPCR 检测，证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1，并获得了转基因拟南芥植株。
关键词紫花苜蓿；拟南芥；转基因；MsCOL1
中图分类号S541+.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01610-02
Abstract[Objective] To construct plant expression vector of MsCOL1 gene from alfalfa. [Method] Based on the sequence of alfalfa CONSTANSLike 1 （MsCOL1） gene （Access No.： DQ661682）， two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of fulllength cDNA， the coding domain sequence of MsCOL1 was obtained， which was inserted into the restrict sites of expression vector pBI121， resulting plant expression vector 35S：：MsCOL1. Mediated by Agrobacterium tumefaciens， 35S：：MsCOL1 was transformed into Arabidopsis thaliana. [Result] PCR testing showed that 15 transgenic plants were obtained. [Conclusion] These results indicated that the plant expression vector 35S：：MsCOL1 was constructed and transgenic Arabidopsis plants with MsCOL1 gene were obtained successfully.
Key wordsAlfalfa； Arabidopsis thaliana； Transgene； MsCOL1
有关植物开花时间的分子生物学研究，在模式植物拟南芥上已经进行得相对全面、深入。在调控拟南芥开花时间的光周期途径中，CONSTANS（CO）基因的表达控制拟南芥感知日照时间的长短，在连接光信号与生物信号过程中起关键性作用，该基因编码一个含有锌指结构的核蛋白[1]。当植物受到长时间光照时，CO基因的mRNA表达量增加[2]。CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其转录因子能促进植物开花。在拟南芥开花时间有关基因调控研究中，CO基因突变体能使开花时间延迟，通过调节增加CO基因的表达，可以使FT基因的表达量提高，使植物开花行为提前发生[1]。但是在CO基因的同源基因COL的表达模式中，功能有所差异。过表达COL1基因只能使其昼夜节律明显缩短，但对植物开花时间没有产生干扰；COL2基因的表达量对植物开花时间没有干扰[4]；COL3基因的表产物对红色波长信号敏感，并且能使根部细胞生长加快[6]。COL9基因的超量表达能使植物延迟开花[5]。相关研究结果表明，通过转基因方法将拟南芥CO基因导入马铃薯中进行过表达，使马铃薯的带花现象延迟[7]。此外，水稻中的一个CO的同源基因OsCO3在水稻中过表达时能导致水稻开花推迟[8]。
在植物生长发育中，开花时间是一个非常重要的生理事件。开花时间受到多种基因调控。已克隆的与开花时间相关基因仅在拟南芥、水稻等少数几种植物中成功获得。通过对这些基因进行分析，种间的CO基因存在较高的保守性，但其在作用机理上却存在较大差异。此外，由于CO基因在植物中属于一个包含多拷贝的基因家族，这个家族中其他拷贝的基因是否与调控开花时间有关还不是很清楚，故仍需深入研究。为了揭示植物开花时间的调控基因网络，需要对开花时间相关基因的作用机理及互作模式进行深入研究。
转基因技术是通过构建使目标基因过量表达的DNA载体，将其转化到植物体内实现基因功能。笔者将构建的紫花苜蓿MsCOL1基因过量表达载体，应用农杆菌转化法获得拟南芥转基因植株，以期为研究该基因的功能奠定基础。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒。大肠杆菌菌株为E.coli DH5α，购自上海申能博彩生物科技有限公司；克隆载体 pMD19T与植物表达载体pBI121，由内蒙古巴彦淖尔市农科院畜牧所惠赠；农杆菌菌株GV3101，实验室保存。
1.1.2主要试剂。限制性内切酶、T4DNA连接酶及DNA回收试剂盒，均购自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker和 Tap DNA聚合酶，购自北京天根生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯，市售。
1.2.3MsCOL1基因表达载体构建及鉴定。利用质粒小提试剂盒，对含有正确MsCOL1基因序列的大肠杆菌，提取质粒，使用XbaI和BamHI双酶切，经凝胶电泳检测分别回收目的片段后，使用T4连接酶16 ℃连接6 h后，转化感受态大肠杆菌DH 5α，在含有50 mg/L卡纳霉素的LB固体培养基上划线培养，挑取单克隆菌落，进行PCR鉴定，以CO1f和CO1r为引物；然后将含有目的条带的菌液送至北京三博远志测序鉴定。构建的植物表达载体命名为35S∷MsCOL1。 1.2.4农杆菌介导法转化拟南芥及其鉴定。提取35S∷MsCOL1质粒并纯化，用CaCl2冻融法将重组子导入农杆菌GV3101中，菌液PCR筛选阳性克隆。利用花序浸泡法，对处于花蕾期的野生型拟南芥进行农杆菌介导的转化，具体步骤为：将已经长出腋生花序的拟南芥植株在含有pBINCED4的农杆菌菌液浸泡约5 min，罩上塑料袋，在恒温箱中放置，暗培养24 h，一周后再次浸入农杆菌悬浮液浸染，温室中待拟南芥生长成熟。收集拟南芥种子，在无菌条件下，将拟南芥种子用70%酒精浸泡10 min后，用蒸馏水清洗，然后均匀撒在含有50 mg/L卡那霉素1/2Ms培养基上。15 d后，选取正常生长的拟南芥幼苗，转移到土中，继续生长。
1.2.5再生植株检测。采用CTAB法提取抗性苗基因组DNA，以CO1f和CO1r为引物，以基因组DNA为模板进行PCR检测。
2结果与分析
2.1紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体构建及鉴定以紫花苜蓿第一链cDNA为模板，以引物CO1f和CO1r进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，得到的片段大小与预期结果一致（图1）。PCR产物分别用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与克隆载体pMD19T载体连接。转化后，挑取阳性克隆鉴定并测序。分析测序结果显示，所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。
具有发夹结构的RNAi载体pARTSA使紫花苜蓿的MsCOL1基因表达量有所下降[9]。张威威等构建了银杏pCAMBIA1304GbCOab表达载体，用转基因来研究CO基因功能是一种常用的方法，该方法已经在很多实验中得到应用[10]。
试验为了构建MsCOL1基因超表达载体，通过PCR扩增的方式在目的基因开放阅读框两端分别引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点，保证了连接方向的准确性。将分离到的基因构建表达载体转入拟南芥中进行过量表达，得到成功转化的转基因苗，进一步研究了MsCOL1基因及NCED4基因的功能。试验采用农杆菌介导的方法转化拟南芥，并通过PCR反应与未转化的植株对比验证，结果显示所转化的4株全部为阳
性，证实目的基因已转入拟南芥基因组中。研究将构建的MsCOL1基因过量表达载体导入拟南芥中，得到转基因植株，对该基因功能的研究具有重要的价值。
参考文献
[1] ROBSON F，COSTA M M R，HEPWORTH S R，et al.Functional importance of conserved domains in the floweringtime gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants[J].The Plant Journal，2001，28（6）：619-631.
[2] SUAREZLOPEZ P，WHEATLEY K，ROBSON F，et al.CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis[J].Nature，2001，410（6832）：1116-1120.
[3] LEE H，SUH S S，PARK E，et al.The AGAMOUSLIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis[J].Genes Dev，2000，14（18）：2366-2376.
[4] LEDGER S，STRAYER C，ASHTON F，et al.Analysis of the function of two circadianregulated CONSTANSLIKE genes[J].Plant J，2001，26（1）：15-22.
[5] CHENG X F，WANG Z Y.Overexpression of COL9，a CONSTANSLIKE gene，delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，2005，43（5）：758-768.
[6] DATTA S，HETTIARACHCHI G H C M，DENG X W，et al.Arabidopsis CONSTANSLIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J].The Plant Cell Online，2006，18（1）：70-84.
[7] GONZLEZSCHAIN N，SUREZLPEZ P.CONSTANS delays flowering and affects tuber yield in potato[J].Biologia Plantarum，2008，52（2）：251-258.
[8] KIM S K，YUN C H，LEE J H，et al.OsCO3，a CONSTANSLIKE gene，controls flowering by negatively regulating the expression of FTlike genes under SD conditions in rice[J].Planta，2008，228（2）：355-365.
[9] 周光輝，杨青川，张铁军，等.紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表达载体的构建及转化[J].中国草地学报，2013，35（4）：7-12.
[10] 张威威，宁迎晶，陈柳吉，等.银杏CONSTANS基因植物表达载体构建[J].生物技术，2010，20（6）：8-10.
关键词紫花苜蓿；拟南芥；转基因；MsCOL1
中图分类号S541+.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01610-02
Abstract[Objective] To construct plant expression vector of MsCOL1 gene from alfalfa. [Method] Based on the sequence of alfalfa CONSTANSLike 1 （MsCOL1） gene （Access No.： DQ661682）， two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of fulllength cDNA， the coding domain sequence of MsCOL1 was obtained， which was inserted into the restrict sites of expression vector pBI121， resulting plant expression vector 35S：：MsCOL1. Mediated by Agrobacterium tumefaciens， 35S：：MsCOL1 was transformed into Arabidopsis thaliana. [Result] PCR testing showed that 15 transgenic plants were obtained. [Conclusion] These results indicated that the plant expression vector 35S：：MsCOL1 was constructed and transgenic Arabidopsis plants with MsCOL1 gene were obtained successfully.
Key wordsAlfalfa； Arabidopsis thaliana； Transgene； MsCOL1
有关植物开花时间的分子生物学研究，在模式植物拟南芥上已经进行得相对全面、深入。在调控拟南芥开花时间的光周期途径中，CONSTANS（CO）基因的表达控制拟南芥感知日照时间的长短，在连接光信号与生物信号过程中起关键性作用，该基因编码一个含有锌指结构的核蛋白[1]。当植物受到长时间光照时，CO基因的mRNA表达量增加[2]。CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其转录因子能促进植物开花。在拟南芥开花时间有关基因调控研究中，CO基因突变体能使开花时间延迟，通过调节增加CO基因的表达，可以使FT基因的表达量提高，使植物开花行为提前发生[1]。但是在CO基因的同源基因COL的表达模式中，功能有所差异。过表达COL1基因只能使其昼夜节律明显缩短，但对植物开花时间没有产生干扰；COL2基因的表达量对植物开花时间没有干扰[4]；COL3基因的表产物对红色波长信号敏感，并且能使根部细胞生长加快[6]。COL9基因的超量表达能使植物延迟开花[5]。相关研究结果表明，通过转基因方法将拟南芥CO基因导入马铃薯中进行过表达，使马铃薯的带花现象延迟[7]。此外，水稻中的一个CO的同源基因OsCO3在水稻中过表达时能导致水稻开花推迟[8]。
在植物生长发育中，开花时间是一个非常重要的生理事件。开花时间受到多种基因调控。已克隆的与开花时间相关基因仅在拟南芥、水稻等少数几种植物中成功获得。通过对这些基因进行分析，种间的CO基因存在较高的保守性，但其在作用机理上却存在较大差异。此外，由于CO基因在植物中属于一个包含多拷贝的基因家族，这个家族中其他拷贝的基因是否与调控开花时间有关还不是很清楚，故仍需深入研究。为了揭示植物开花时间的调控基因网络，需要对开花时间相关基因的作用机理及互作模式进行深入研究。
转基因技术是通过构建使目标基因过量表达的DNA载体，将其转化到植物体内实现基因功能。笔者将构建的紫花苜蓿MsCOL1基因过量表达载体，应用农杆菌转化法获得拟南芥转基因植株，以期为研究该基因的功能奠定基础。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒。大肠杆菌菌株为E.coli DH5α，购自上海申能博彩生物科技有限公司；克隆载体 pMD19T与植物表达载体pBI121，由内蒙古巴彦淖尔市农科院畜牧所惠赠；农杆菌菌株GV3101，实验室保存。
1.1.2主要试剂。限制性内切酶、T4DNA连接酶及DNA回收试剂盒，均购自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker和 Tap DNA聚合酶，购自北京天根生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯，市售。
1.2.3MsCOL1基因表达载体构建及鉴定。利用质粒小提试剂盒，对含有正确MsCOL1基因序列的大肠杆菌，提取质粒，使用XbaI和BamHI双酶切，经凝胶电泳检测分别回收目的片段后，使用T4连接酶16 ℃连接6 h后，转化感受态大肠杆菌DH 5α，在含有50 mg/L卡纳霉素的LB固体培养基上划线培养，挑取单克隆菌落，进行PCR鉴定，以CO1f和CO1r为引物；然后将含有目的条带的菌液送至北京三博远志测序鉴定。构建的植物表达载体命名为35S∷MsCOL1。 1.2.4农杆菌介导法转化拟南芥及其鉴定。提取35S∷MsCOL1质粒并纯化，用CaCl2冻融法将重组子导入农杆菌GV3101中，菌液PCR筛选阳性克隆。利用花序浸泡法，对处于花蕾期的野生型拟南芥进行农杆菌介导的转化，具体步骤为：将已经长出腋生花序的拟南芥植株在含有pBINCED4的农杆菌菌液浸泡约5 min，罩上塑料袋，在恒温箱中放置，暗培养24 h，一周后再次浸入农杆菌悬浮液浸染，温室中待拟南芥生长成熟。收集拟南芥种子，在无菌条件下，将拟南芥种子用70%酒精浸泡10 min后，用蒸馏水清洗，然后均匀撒在含有50 mg/L卡那霉素1/2Ms培养基上。15 d后，选取正常生长的拟南芥幼苗，转移到土中，继续生长。
1.2.5再生植株检测。采用CTAB法提取抗性苗基因组DNA，以CO1f和CO1r为引物，以基因组DNA为模板进行PCR检测。
2结果与分析
2.1紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体构建及鉴定以紫花苜蓿第一链cDNA为模板，以引物CO1f和CO1r进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，得到的片段大小与预期结果一致（图1）。PCR产物分别用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，与克隆载体pMD19T载体连接。转化后，挑取阳性克隆鉴定并测序。分析测序结果显示，所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。
具有发夹结构的RNAi载体pARTSA使紫花苜蓿的MsCOL1基因表达量有所下降[9]。张威威等构建了银杏pCAMBIA1304GbCOab表达载体，用转基因来研究CO基因功能是一种常用的方法，该方法已经在很多实验中得到应用[10]。
试验为了构建MsCOL1基因超表达载体，通过PCR扩增的方式在目的基因开放阅读框两端分别引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点，保证了连接方向的准确性。将分离到的基因构建表达载体转入拟南芥中进行过量表达，得到成功转化的转基因苗，进一步研究了MsCOL1基因及NCED4基因的功能。试验采用农杆菌介导的方法转化拟南芥，并通过PCR反应与未转化的植株对比验证，结果显示所转化的4株全部为阳
性，证实目的基因已转入拟南芥基因组中。研究将构建的MsCOL1基因过量表达载体导入拟南芥中，得到转基因植株，对该基因功能的研究具有重要的价值。
参考文献
[1] ROBSON F，COSTA M M R，HEPWORTH S R，et al.Functional importance of conserved domains in the floweringtime gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants[J].The Plant Journal，2001，28（6）：619-631.
[2] SUAREZLOPEZ P，WHEATLEY K，ROBSON F，et al.CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis[J].Nature，2001，410（6832）：1116-1120.
[3] LEE H，SUH S S，PARK E，et al.The AGAMOUSLIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis[J].Genes Dev，2000，14（18）：2366-2376.
[4] LEDGER S，STRAYER C，ASHTON F，et al.Analysis of the function of two circadianregulated CONSTANSLIKE genes[J].Plant J，2001，26（1）：15-22.
[5] CHENG X F，WANG Z Y.Overexpression of COL9，a CONSTANSLIKE gene，delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，2005，43（5）：758-768.
[6] DATTA S，HETTIARACHCHI G H C M，DENG X W，et al.Arabidopsis CONSTANSLIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J].The Plant Cell Online，2006，18（1）：70-84.
[7] GONZLEZSCHAIN N，SUREZLPEZ P.CONSTANS delays flowering and affects tuber yield in potato[J].Biologia Plantarum，2008，52（2）：251-258.
[8] KIM S K，YUN C H，LEE J H，et al.OsCO3，a CONSTANSLIKE gene，controls flowering by negatively regulating the expression of FTlike genes under SD conditions in rice[J].Planta，2008，228（2）：355-365.
[9] 周光輝，杨青川，张铁军，等.紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表达载体的构建及转化[J].中国草地学报，2013，35（4）：7-12.
[10] 张威威，宁迎晶，陈柳吉，等.银杏CONSTANS基因植物表达载体构建[J].生物技术，2010，20（6）：8-10.