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摘要： 目的：研究探讨EGCG对恶性胶质瘤细胞凋亡过程的影响作用，探讨EGCG抗恶性胶质瘤细胞的可能机制。方法：MTT法检测EGCG处理恶性胶质瘤细胞后的活性及流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：与对照组相比，随着用药浓度增高，细胞生长抑制率逐渐增高，即细胞活性下降（P<0.05）。结论： EGCG抗恶性胶质瘤细胞的可能机制发生细胞凋亡，为抗恶性胶质瘤治疗方面的临床用药奠定基础。
关键词：EGCG；恶性胶质瘤；细胞凋亡。
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是常见的中枢神经系统恶性神经上皮细胞肿瘤，占胶质瘤的25%以上，也是100种脑癌类型中最凶险的恶性脑癌[1]。手术切除后常很快复发，预后极差，尽管实行传统手术，化学治疗及辐射治疗，但患者多在2年内死亡[2]。，故在治疗上是一个世界性难题。近年来，植物来源药物越来越受到重视，充分利用我国药用植物资源，开发新的抗肿瘤药物，已成为肿瘤研究领域的重要内容。现代研究表明， 茶多酚具有抗肿瘤，抗氧化，抗炎效应。同时也能抑制多种细胞黏附分子、TNF、COX-2和MMP-9的表达[3]。因此， 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是一类非常有前途的抗肿瘤药物[2]。本实验我们进行了EGCG诱导恶性胶质瘤细胞凋亡的研究，现报告如下：
【中图分类号】R651 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602（2014）06-0003-02
1 材料与方法
1. 1 材料 高糖型DMEM培养基购自美国Gibco公司；新生小牛血清购自杭州四季青公司；DMSO、MTT均为Sigma公司产品。处理细胞时，DMSO的最终体积小于或等于0.1%。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取恶性胶质瘤细胞U87MG传代30～36h处于对数生长期的细胞（约70%～80%融合），以每孔0.5×105细胞平均接种于6孔细胞培养板中，每孔体积1ml，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的环境中培养过夜，使细胞贴壁供实验用。
1.2.2 与EGCG共孵育 去除含原培养液，用不含血清的培养液洗3次后，加入等量的含10% FBS的DMEM培养基，同时按实验要求加入不同浓度（0.1、10、15、20μM）的EGCG，另每孔加100ng/ml 的PMA。37℃，5%CO2条件下培养48h后，收集细胞和上清液。
1.2.3 MTT 法 细胞种植于24孔培养板，生长至80%融合，EGCG浓度梯度组（5%、10%、15%）处理，24h后加入终浓度为0.5g/L的MTT溶液，继续37℃孵育4h；酶标仪测定在570nm波长处吸光度值。用以下公式计算细胞生长抑制率。抑制率（%）=100%×（对照组吸光度值均值-实验组吸光度值均值）/对照组吸光度值均值。
1.2.4 流式细胞仪分析 继续孵育24h后，收获细胞，制成单细胞悬液，700g离心5min，弃上清，冷PBS洗涤后，用-20℃预冷的70%乙醇于4℃固定24h。分析前调整细胞浓度为106/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗三次，加入RNase于37℃作用30min，再加入PI染液37℃避光染色30min，即可进行流式分析[3]。
1.2.5 统计分析 结果以x±s表示，n为样本数，用SPSS 10.0 统计软件分析。P<0.05被认为差异有统计学显著性。
2 结果
2.1 MTT 法测定细胞活性变化
U87MG细胞株与EGCG共孵育24h 后，与对照组相比，随着用药浓度增高，细胞生长抑制率逐渐增高，即细胞活性下降（P<0.01），可见EGCG呈浓度依赖性抑制胃U87MG细胞株生长。见表1 。
2.2 流式细胞仪分析
如表2所示，U87MG细胞株与EGCG共孵育24h后，随着用药浓度增高，细胞凋亡率与对照组相比，显著增加；细胞周期分析结果显示，20μM EGCG处理U87MG细胞24h后，G2/M期细胞百分率比对照组升高了3倍。
3 讨论
真核多细胞生物的细胞数目是通过细胞的增殖和死亡二者的平衡来维持的，而维持这种平衡的因素之一的“死亡”在很大程度上是通过凋亡来实现的。肿瘤实际上也是一种凋亡异常的疾病，本该发生凋亡的细胞未发生凋亡是肿瘤发生的机制之一[4]。目前研究发现许多化学药物和放射治疗方法都是通过诱导细胞凋亡发挥其抗癌作用的[5]。常规的化学药品治疗费用昂贵且具有严重的毒副作用。为克服这些缺点和不足，许多学者正在积 极寻找开发中药来源的新型抗癌药物。
本实验以MTT法检测观察EGCG对恶性胶质瘤细胞U87MG细胞，结果表明，EGCG对恶性胶质瘤细胞U87MG细胞有明显抑制作用，不同浓度EGCG对恶性胶质瘤细胞细胞增殖呈现出不同程度的抑制作用，呈现明显的剂量依赖关系。
细胞周期的阻滞与细胞凋亡、分化关系密切。细胞周期能够顺利发生、发展和完成， 取决于重要控制点。随着细胞凋亡的发生和发展，本研究中经终浓度为20μMEGCG处理U87MG细胞24h后，G2/M期细胞百分率比对照组升高了3倍。
说明较高浓度EGCG可诱导恶性胶质瘤细胞U87MG细胞发生显著的G2/M期阻滞
参考文献
「1」 Glas M， Rath BH， Simon M，. et al. Residual tumor cells are unique cellular targets in glioblastoma.. Ann Neurol. 2010，68（2）：264-269..
「2」 Dang L， Jin S， Su SM. IDH mutations in glioma and acute myeloid leukemia.. Trends Mol Med. 2010，16（9）：387-397..
「3」 Enloe BM， Jay DG. Inhibition of Necl-5 （CD155/PVR） reduces glioblastoma dispersal and decreases MMP-2 expression and activity. J Neurooncol. 2010.
「4」 Raizer JJ， Grimm S， Chamberlain MC， et al. A phase 2 trial of single-agent bevacizumab given in an every-3-week schedule for patients with recurrent high-grade gliomas.. Cancer. 2010
关键词：EGCG；恶性胶质瘤；细胞凋亡。
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是常见的中枢神经系统恶性神经上皮细胞肿瘤，占胶质瘤的25%以上，也是100种脑癌类型中最凶险的恶性脑癌[1]。手术切除后常很快复发，预后极差，尽管实行传统手术，化学治疗及辐射治疗，但患者多在2年内死亡[2]。，故在治疗上是一个世界性难题。近年来，植物来源药物越来越受到重视，充分利用我国药用植物资源，开发新的抗肿瘤药物，已成为肿瘤研究领域的重要内容。现代研究表明， 茶多酚具有抗肿瘤，抗氧化，抗炎效应。同时也能抑制多种细胞黏附分子、TNF、COX-2和MMP-9的表达[3]。因此， 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是一类非常有前途的抗肿瘤药物[2]。本实验我们进行了EGCG诱导恶性胶质瘤细胞凋亡的研究，现报告如下：
【中图分类号】R651 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602（2014）06-0003-02
1 材料与方法
1. 1 材料 高糖型DMEM培养基购自美国Gibco公司；新生小牛血清购自杭州四季青公司；DMSO、MTT均为Sigma公司产品。处理细胞时，DMSO的最终体积小于或等于0.1%。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取恶性胶质瘤细胞U87MG传代30～36h处于对数生长期的细胞（约70%～80%融合），以每孔0.5×105细胞平均接种于6孔细胞培养板中，每孔体积1ml，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的环境中培养过夜，使细胞贴壁供实验用。
1.2.2 与EGCG共孵育 去除含原培养液，用不含血清的培养液洗3次后，加入等量的含10% FBS的DMEM培养基，同时按实验要求加入不同浓度（0.1、10、15、20μM）的EGCG，另每孔加100ng/ml 的PMA。37℃，5%CO2条件下培养48h后，收集细胞和上清液。
1.2.3 MTT 法 细胞种植于24孔培养板，生长至80%融合，EGCG浓度梯度组（5%、10%、15%）处理，24h后加入终浓度为0.5g/L的MTT溶液，继续37℃孵育4h；酶标仪测定在570nm波长处吸光度值。用以下公式计算细胞生长抑制率。抑制率（%）=100%×（对照组吸光度值均值-实验组吸光度值均值）/对照组吸光度值均值。
1.2.4 流式细胞仪分析 继续孵育24h后，收获细胞，制成单细胞悬液，700g离心5min，弃上清，冷PBS洗涤后，用-20℃预冷的70%乙醇于4℃固定24h。分析前调整细胞浓度为106/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗三次，加入RNase于37℃作用30min，再加入PI染液37℃避光染色30min，即可进行流式分析[3]。
1.2.5 统计分析 结果以x±s表示，n为样本数，用SPSS 10.0 统计软件分析。P<0.05被认为差异有统计学显著性。
2 结果
2.1 MTT 法测定细胞活性变化
U87MG细胞株与EGCG共孵育24h 后，与对照组相比，随着用药浓度增高，细胞生长抑制率逐渐增高，即细胞活性下降（P<0.01），可见EGCG呈浓度依赖性抑制胃U87MG细胞株生长。见表1 。
2.2 流式细胞仪分析
如表2所示，U87MG细胞株与EGCG共孵育24h后，随着用药浓度增高，细胞凋亡率与对照组相比，显著增加；细胞周期分析结果显示，20μM EGCG处理U87MG细胞24h后，G2/M期细胞百分率比对照组升高了3倍。
3 讨论
真核多细胞生物的细胞数目是通过细胞的增殖和死亡二者的平衡来维持的，而维持这种平衡的因素之一的“死亡”在很大程度上是通过凋亡来实现的。肿瘤实际上也是一种凋亡异常的疾病，本该发生凋亡的细胞未发生凋亡是肿瘤发生的机制之一[4]。目前研究发现许多化学药物和放射治疗方法都是通过诱导细胞凋亡发挥其抗癌作用的[5]。常规的化学药品治疗费用昂贵且具有严重的毒副作用。为克服这些缺点和不足，许多学者正在积 极寻找开发中药来源的新型抗癌药物。
本实验以MTT法检测观察EGCG对恶性胶质瘤细胞U87MG细胞，结果表明，EGCG对恶性胶质瘤细胞U87MG细胞有明显抑制作用，不同浓度EGCG对恶性胶质瘤细胞细胞增殖呈现出不同程度的抑制作用，呈现明显的剂量依赖关系。
细胞周期的阻滞与细胞凋亡、分化关系密切。细胞周期能够顺利发生、发展和完成， 取决于重要控制点。随着细胞凋亡的发生和发展，本研究中经终浓度为20μMEGCG处理U87MG细胞24h后，G2/M期细胞百分率比对照组升高了3倍。
说明较高浓度EGCG可诱导恶性胶质瘤细胞U87MG细胞发生显著的G2/M期阻滞
参考文献
「1」 Glas M， Rath BH， Simon M，. et al. Residual tumor cells are unique cellular targets in glioblastoma.. Ann Neurol. 2010，68（2）：264-269..
「2」 Dang L， Jin S， Su SM. IDH mutations in glioma and acute myeloid leukemia.. Trends Mol Med. 2010，16（9）：387-397..
「3」 Enloe BM， Jay DG. Inhibition of Necl-5 （CD155/PVR） reduces glioblastoma dispersal and decreases MMP-2 expression and activity. J Neurooncol. 2010.
「4」 Raizer JJ， Grimm S， Chamberlain MC， et al. A phase 2 trial of single-agent bevacizumab given in an every-3-week schedule for patients with recurrent high-grade gliomas.. Cancer. 2010