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摘要 [目的]为了研究桑螵蛸成分在体外试验中自由基DPPH清除的效果。[方法] 利用DPPH法，测定抗自由基活性。[结果] 从桑螵蛸中分离得到N-（3，4-二羟基苯基乙基）乙酰胺（1） 和 2，4-二丁基苯酚（2），化合物1和2在DPPH自由基清除试验中表现出抗自由基活性（1： EC50=12.9 μmol/L和2： EC50=17.8 μmol/L）。[结论] 桑螵蛸成分有很强的抗自由基活性。
关键词 桑螵蛸;DPPH;自由基
中图分类号 S186 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11619-02
Study of the Anti-DPPH Free Radical Component from Mantidis ootheca Extracts
XU Ming-zhe
（College of Agriculture， Yanbian University， Yanji， Jilin 133000）
Abstract [Objective] To evaluate the antiradical effect of N-acetyldopamine dimmer from Mantidis ootheca in vitro. [Method] DPPH free radical scavenging assay method was used to observe the inhibitive radical. [Result] N-（3，4-dihydroxyphenethyl） acetamide （1） and 2，4-di-tert-butylphenol （2） were isolated from the methanol extract of Mantidis ootheca using silica-gel column chromateography and C-18 gel column chromatography. Compounds 1 and 2 exhibited antiradical active-ties in the DPPH scavenging assay （1： EC50=12.9 μmol/L and 2： EC50=17.8 μmol/L）. [Conclusion] The two compounds from Mantidis ootheca have strong DPPH scavenging activities.
Key words Mantidis ootheca; DPPH; Free radical
作者简介 徐明哲（1969-），男，吉林珲春人，副教授，博士，从事农业昆虫学方面的研究。
收稿日期 2014-10-15
人体中耗氧生物反应所参与的各种生物酶会产生超氧化物自由基、 羟基自由基以及过氧化氢等各种含氧活性粒子（ROS）[1]。适量的含氧活性粒子有助于神经信号的传递和生长调节[2]。然而，由于这类活性微粒具有强氧化性，在细胞内破坏各种蛋白质、类脂和DNA，改变细胞内各种氧化还原平衡和氧化各种生化反应的中间物质[3]。含氧活性粒子过量存在于人体是有害的，会产生癌症、心血管疾病、过度衰老及神经组织退化等诸多疾病[4]。补充必要的抗氧化成分来维持体内氧化还原平衡，保证ROS含量稳定是非常必要的。近年来，许多研究表明，食用含有抗氧化成分的新鲜水果、蔬菜、茶叶可以预防或治疗过量ROS引起的疾病。常见的抗氧化成分是维生素、类黄酮、花青素以及酚类衍生物[5]。来源于水果和蔬菜的维生素C、维生素E、胡萝卜素和芳香醇类化合物等天然抗氧化物可以有效地清除氧自由基。很多研究者从各种植物的花、果实、叶、茎及根中寻找和人工合成了各种各样的抗氧化物质来抑制自由基氧化，其中某些抗氧化效果极好的成分被开发成各种药物[6]。自然界中存在各种各样的昆虫。它们的生存环境千变万化，形态多种多样，数目极其繁多。但是，当前对昆虫有效成分进行的研究甚少。笔者通过抗自由基活性检测系统地对各种昆虫进行了活性检测，发现桑螵蛸的乙醇溶液具有强烈的抗自由基活性。
据调查，桑螵蛸为螳螂科昆虫大刀螂、小刀螂或巨斧螳螂的干燥卵鞘，别名又称蜱蛸、桑蛸、致神、螳螂子、赖尿郎、螳螂蛋、流尿狗、猴儿包等[7]。在我国，其药用历史可追溯到汉代以前。桑螵蛸入药，性平，味甘咸， 入肝，肾经，具有补肾、助阳、固精、缩尿等功能，主治肾阳不足、遗精、阳萎、早泄、白浊、赤白带下、小便频数、遗尿等症[8]。目前，主要用于益肾固精、缩尿、止浊、遗精滑精、遗尿尿频、小便白浊等。现代中药临床研究中，将桑螵蛸作为利尿剂[9]，且已得到广泛的应用。桑螵蛸多与别的中药配伍，应用最广泛的是水煎剂，用于治疗小儿遗尿等症，如补肾活血汤、固尿汤、黄耆桑螵蛸汤、桑螵蛸散、桑螵蛸散合缩泉丸等，还有应用脉冲治疗仪配合桑螵蛸散治疗小儿遗尿的报道[10]。但是，桑螵蛸的抗自由基活性及其成分的化合物组成从未见报道。
1 材料与方法
1.1 药用昆虫原料
干燥黑螵蛸是传统中药材桑螵蛸的一种，在延吉市中药材市场选购。
1.2 提取分离试验
取400 g桑螵蛸粉末，浸泡于2 L乙醇液中，2 d后过滤得乙醇液体，并用旋转蒸发器蒸发至干，得提取物20.8 g。然后，用乙酸乙酯对该提取物进行二次萃取，得到乙酸乙酯提取物8.0 g。对乙酸乙酯浓缩物进行二次柱层析分离和高效液相柱层析分离，得到化合物1、2。
1.3 自由基DPPH的清除试验
化合物对DPPH自由基的清除试验通过采取Lu等[11]方法进行部分修正后进行的。在4个3.0 ml比色皿中，分别加入2.0 ml新制备的自由基DPPH的乙醇溶液（100 μmol/L），保持恒定室温。在每个比色皿中，分别加入同样保持恒定室温的1.0 ml 100 μmol/L的化合物1、2和参照物乙醇溶液，立即开始測定，最后一个比色皿作为空白。利用紫外分光光度计，在波长517 nm处，每隔2 min测定反应液，计算得到相应化合物的吸收曲线。在测定过程，在黑暗中进行测定。自由基清除活性 （E%） 用下式计算。 E%=[（ABS控制-ABS样品）/ ABS控制]×100
1.4 化合物的半数有效浓度（EC50）的计算
采用Sigma Plot软件进行计算。该软件是科学研究专用的绘图和数据分析软件，比Microsoft Excel 软件丰富准确。
2 结果与分析
2.1 确定化合物1和2 的结构
化合物 1 是白色粉末状固体。通过高分辨质谱分析（HRFAB-MS data （m/z [M + Na]+，195.0893，calcd. 195.0895 for C10H13NO3），化合物1的分子式是C10H13NO3。它的比旋光度是+13.8°（c 0.1，甲醇）。通过核磁共振图谱分析，得到化合物1 的结构（1H，13C，COSY，HMQC，和 HMBC）。化合物1的结构是N-（3，4-二羟基苯基乙基）乙酰胺（1）。化合物2是白色粉末状固体。质谱显示它的分子离子[M]+在206峰处，通过高分辨质谱分析（HRFAB-MS data（m/z [M + Na]+，206.1668，calcd. 206.1671 for C14H22O），说明它的分子式是C14H22O。通过核磁共振图谱分析，得到它的结构（1H，13C，COSY，HMQC，和 HMBC）。因此，化合物2的结构可确定为2，4-二丁基苯酚（2）。这2个化合物的化学结构见图1。
图1 化合物1和2 的化学结构
2.2 自由基DPPH的清除试验
化合物对DPPH自由基的清除能力测试是通过自由基DPPH的清除反应进行的。由图2可知，在反应开始后，溶液的自由基含量受反应物的影响，残余DPPH数量急速下降，反应4 min后化合物1 和化合物2猝灭，导致反应液中剩余DPPH自由基分别达31%和42%，10 min以后反应液中分别剩下5%和8%的自由基。同样浓度的参照物（Probucol）反应4 min，则剩余61%的DPPH自由基。反应12 min后化合物1和2与DPPH反应完全，而此时参照物反应液中仍存在38%的DPPH自由基，直至反应30 min后反应液中还存在24%的DPPH自由基。化合物1和2表现出强烈的抗自由基活性（毫摩尔级别）。
图2 自由基DPPH的猝灭试验中化合物1和2的活性
2.3 化合物的EC50
经测定，化合物1、2的EC50分别是 12.9、17.8 μmol/L。它们的抗自由基活性都达到微摩尔级别。虽然相应的参照物probucol是非常典型的药物，但它的EC50为25.5 μmol/L，要大于化合物1、2。
3 讨论
市售的桑螵蛸有团螵蛸、长螵蛸、黑螵蛸3种，但分别是哪种螳螂所产，尚存在很大争议，传统认为，大刀螳（Tenodera sinensis Saussuer）、小刀螳[Statilia maculate （Thunberg）]、蒲翅螳螂（Mantis religiosa La）、巨斧螳螂（Hierdula patellifera Serville）所产[12]。但是，有研究者证明其有误[13]。螳螂目的昆虫种类繁多，有的种属甚至到现在仍没有分清，可以确认的是多数螳螂目昆虫都可以生产桑螵蛸。
桑螵蛸[14]含蛋白质、氨基酸、磷脂类、脂肪、粗蛋白、粗纤维、铁钙胡萝卜素样色素、柠檬酸钙结晶、糖蛋白及脂蛋白，其中蛋白质占58.5%，脂肪占11.95%，糖占1.6%，粗纤维占20.16%;此外，桑螵蛸[15]還含有Fe、Cu、Zn、Mn、I、Co、Cr、Ni等20余种微量元素及K、P、Ca、Na、Mg等常量元素，桑螵蛸的药用功能与其化学成分是密切相关的。杨会全等[16]对3种桑螵蛸氨基酸含量进行了分析，指出3种桑螵蛸均含有18种氨基酸，其中为人体必需的8种氨基酸。黑螵蛸总的氨基酸含量最多，长螵蛸次之，团螵蛸最少。黑螵蛸酪氨酸含量为最高，在人体中酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成L-多巴，因此在抗氧化、精神调节、增强皮肤保护功能等方面黑螵蛸具有重要作用。桑螵蛸磷脂含量丰富，有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇及溶血磷脂酰胆碱等，总含量为0.43%。李翔[17]从团螵蛸中分离得到络氨酸、氰尿酸、尿嘧啶、对苯二酚、胡椒酸、谷甾醇、1-（3，4-二羟基）-2-乙酰氨基-乙酮、2，2-联苯二甲酸、3-氨基哌嗪-2，5-二酮共9个化合物。巍署飔[18]从桑螵蛸中分离得到对羟基苯乙醇、对羟基苯甲醇、3-苯基-1，2丙二醇、胆甾醇等21种化合物，可惜的是都没有测定其抗氧化性。经结构分析，可以预测对苯二酚、1-（3，4-二羟基）-2-乙酰氨基-乙酮、对羟基苯乙醇、对羟基苯甲醇属于酚类化合物，都具有抗氧化性。从蔬菜和水果中提取的酚类化合物被证明具有抗氧化的生物活性。该研究也证明了这一点。临床上，癌症产生于机体某些组织的氧化，酚类化合物因具有抗氧化性而常被用于抗癌剂[19]。笔者采用生物活性为导向的新型分离方法，分离得到了N- （3，4-二羟基苯基乙基）乙酰胺、2，4-二丁基苯酚2种有生物活性的化合物。这种方法保证分离得到的化合物都具有相应的生物活性，没有生物活性的成分在分离过程中得到有效排除。这种分离方法是为分离具有某种生物活性的有效成分而采用的。
为了测量抗自由基化合物的总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC），研究者比较了最常用的2种方法，带有颜色的自由基化合物ABTS（2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonicacid）[20]和DPPH（ 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）成为常用的自由基化合物。在食品的抗氧化能力的测定中，这2种方法都被采用，都是利用颜色的变化来测定抗氧化能力，但表现出不同的机理[21]。 ABTS 方法 通常被用来测定亲水化合物的抗氧化能力，而 DPPH方法可以用来测定水提取物或有机溶剂提取物中的各种亲水化合物和亲脂化合物的抗氧化能力[22]。有研究者同样认为，
ABTS方法是基于蓝绿变化的ABTS离子，因此这个体系适用于水相反应环境，同时适用于亲水化合物。 而DPPH 方法是建立在有机相中的自由基变化，适用于有机相反应环境，主要用于亲脂化合物[23]。DPPH方法适用面更广，同时拥有很多优点，常温下形成稳定的自由基和简单、容易的实验操作条件是最大的优点[24]。DPPH 紫色溶液在320～325、515～520 nm波长处有2个特征的吸收峰，515～520 nm 变化更明显，常被采用于测试波长。但要注意的是，DPPH自由基溶液在517 nm波长处的吸光度变化并非随加入的抗氧化剂量的变化呈线性关系[25]。现有几个明显的试验研究结果已经证明两者不是线性关系[26-27]，因此过去很多的DPPH试验使用线性方程进行结果分析存在较大的系统误差。该试验结果也同样证明这一点。DPPH活性检测试验在恒温、黑暗条件下进行，测定结果最佳。化合物1在前文中已经报道过[28]。化合物1和2是典型的抗动脉硬化药物，对低密度脂蛋白的氧化变异有优良的抗氧化效果，研究中则表现出优良的抗自由基活性。
参考文献
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关键词 桑螵蛸;DPPH;自由基
中图分类号 S186 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11619-02
Study of the Anti-DPPH Free Radical Component from Mantidis ootheca Extracts
XU Ming-zhe
（College of Agriculture， Yanbian University， Yanji， Jilin 133000）
Abstract [Objective] To evaluate the antiradical effect of N-acetyldopamine dimmer from Mantidis ootheca in vitro. [Method] DPPH free radical scavenging assay method was used to observe the inhibitive radical. [Result] N-（3，4-dihydroxyphenethyl） acetamide （1） and 2，4-di-tert-butylphenol （2） were isolated from the methanol extract of Mantidis ootheca using silica-gel column chromateography and C-18 gel column chromatography. Compounds 1 and 2 exhibited antiradical active-ties in the DPPH scavenging assay （1： EC50=12.9 μmol/L and 2： EC50=17.8 μmol/L）. [Conclusion] The two compounds from Mantidis ootheca have strong DPPH scavenging activities.
Key words Mantidis ootheca; DPPH; Free radical
作者简介 徐明哲（1969-），男，吉林珲春人，副教授，博士，从事农业昆虫学方面的研究。
收稿日期 2014-10-15
人体中耗氧生物反应所参与的各种生物酶会产生超氧化物自由基、 羟基自由基以及过氧化氢等各种含氧活性粒子（ROS）[1]。适量的含氧活性粒子有助于神经信号的传递和生长调节[2]。然而，由于这类活性微粒具有强氧化性，在细胞内破坏各种蛋白质、类脂和DNA，改变细胞内各种氧化还原平衡和氧化各种生化反应的中间物质[3]。含氧活性粒子过量存在于人体是有害的，会产生癌症、心血管疾病、过度衰老及神经组织退化等诸多疾病[4]。补充必要的抗氧化成分来维持体内氧化还原平衡，保证ROS含量稳定是非常必要的。近年来，许多研究表明，食用含有抗氧化成分的新鲜水果、蔬菜、茶叶可以预防或治疗过量ROS引起的疾病。常见的抗氧化成分是维生素、类黄酮、花青素以及酚类衍生物[5]。来源于水果和蔬菜的维生素C、维生素E、胡萝卜素和芳香醇类化合物等天然抗氧化物可以有效地清除氧自由基。很多研究者从各种植物的花、果实、叶、茎及根中寻找和人工合成了各种各样的抗氧化物质来抑制自由基氧化，其中某些抗氧化效果极好的成分被开发成各种药物[6]。自然界中存在各种各样的昆虫。它们的生存环境千变万化，形态多种多样，数目极其繁多。但是，当前对昆虫有效成分进行的研究甚少。笔者通过抗自由基活性检测系统地对各种昆虫进行了活性检测，发现桑螵蛸的乙醇溶液具有强烈的抗自由基活性。
据调查，桑螵蛸为螳螂科昆虫大刀螂、小刀螂或巨斧螳螂的干燥卵鞘，别名又称蜱蛸、桑蛸、致神、螳螂子、赖尿郎、螳螂蛋、流尿狗、猴儿包等[7]。在我国，其药用历史可追溯到汉代以前。桑螵蛸入药，性平，味甘咸， 入肝，肾经，具有补肾、助阳、固精、缩尿等功能，主治肾阳不足、遗精、阳萎、早泄、白浊、赤白带下、小便频数、遗尿等症[8]。目前，主要用于益肾固精、缩尿、止浊、遗精滑精、遗尿尿频、小便白浊等。现代中药临床研究中，将桑螵蛸作为利尿剂[9]，且已得到广泛的应用。桑螵蛸多与别的中药配伍，应用最广泛的是水煎剂，用于治疗小儿遗尿等症，如补肾活血汤、固尿汤、黄耆桑螵蛸汤、桑螵蛸散、桑螵蛸散合缩泉丸等，还有应用脉冲治疗仪配合桑螵蛸散治疗小儿遗尿的报道[10]。但是，桑螵蛸的抗自由基活性及其成分的化合物组成从未见报道。
1 材料与方法
1.1 药用昆虫原料
干燥黑螵蛸是传统中药材桑螵蛸的一种，在延吉市中药材市场选购。
1.2 提取分离试验
取400 g桑螵蛸粉末，浸泡于2 L乙醇液中，2 d后过滤得乙醇液体，并用旋转蒸发器蒸发至干，得提取物20.8 g。然后，用乙酸乙酯对该提取物进行二次萃取，得到乙酸乙酯提取物8.0 g。对乙酸乙酯浓缩物进行二次柱层析分离和高效液相柱层析分离，得到化合物1、2。
1.3 自由基DPPH的清除试验
化合物对DPPH自由基的清除试验通过采取Lu等[11]方法进行部分修正后进行的。在4个3.0 ml比色皿中，分别加入2.0 ml新制备的自由基DPPH的乙醇溶液（100 μmol/L），保持恒定室温。在每个比色皿中，分别加入同样保持恒定室温的1.0 ml 100 μmol/L的化合物1、2和参照物乙醇溶液，立即开始測定，最后一个比色皿作为空白。利用紫外分光光度计，在波长517 nm处，每隔2 min测定反应液，计算得到相应化合物的吸收曲线。在测定过程，在黑暗中进行测定。自由基清除活性 （E%） 用下式计算。 E%=[（ABS控制-ABS样品）/ ABS控制]×100
1.4 化合物的半数有效浓度（EC50）的计算
采用Sigma Plot软件进行计算。该软件是科学研究专用的绘图和数据分析软件，比Microsoft Excel 软件丰富准确。
2 结果与分析
2.1 确定化合物1和2 的结构
化合物 1 是白色粉末状固体。通过高分辨质谱分析（HRFAB-MS data （m/z [M + Na]+，195.0893，calcd. 195.0895 for C10H13NO3），化合物1的分子式是C10H13NO3。它的比旋光度是+13.8°（c 0.1，甲醇）。通过核磁共振图谱分析，得到化合物1 的结构（1H，13C，COSY，HMQC，和 HMBC）。化合物1的结构是N-（3，4-二羟基苯基乙基）乙酰胺（1）。化合物2是白色粉末状固体。质谱显示它的分子离子[M]+在206峰处，通过高分辨质谱分析（HRFAB-MS data（m/z [M + Na]+，206.1668，calcd. 206.1671 for C14H22O），说明它的分子式是C14H22O。通过核磁共振图谱分析，得到它的结构（1H，13C，COSY，HMQC，和 HMBC）。因此，化合物2的结构可确定为2，4-二丁基苯酚（2）。这2个化合物的化学结构见图1。
图1 化合物1和2 的化学结构
2.2 自由基DPPH的清除试验
化合物对DPPH自由基的清除能力测试是通过自由基DPPH的清除反应进行的。由图2可知，在反应开始后，溶液的自由基含量受反应物的影响，残余DPPH数量急速下降，反应4 min后化合物1 和化合物2猝灭，导致反应液中剩余DPPH自由基分别达31%和42%，10 min以后反应液中分别剩下5%和8%的自由基。同样浓度的参照物（Probucol）反应4 min，则剩余61%的DPPH自由基。反应12 min后化合物1和2与DPPH反应完全，而此时参照物反应液中仍存在38%的DPPH自由基，直至反应30 min后反应液中还存在24%的DPPH自由基。化合物1和2表现出强烈的抗自由基活性（毫摩尔级别）。
图2 自由基DPPH的猝灭试验中化合物1和2的活性
2.3 化合物的EC50
经测定，化合物1、2的EC50分别是 12.9、17.8 μmol/L。它们的抗自由基活性都达到微摩尔级别。虽然相应的参照物probucol是非常典型的药物，但它的EC50为25.5 μmol/L，要大于化合物1、2。
3 讨论
市售的桑螵蛸有团螵蛸、长螵蛸、黑螵蛸3种，但分别是哪种螳螂所产，尚存在很大争议，传统认为，大刀螳（Tenodera sinensis Saussuer）、小刀螳[Statilia maculate （Thunberg）]、蒲翅螳螂（Mantis religiosa La）、巨斧螳螂（Hierdula patellifera Serville）所产[12]。但是，有研究者证明其有误[13]。螳螂目的昆虫种类繁多，有的种属甚至到现在仍没有分清，可以确认的是多数螳螂目昆虫都可以生产桑螵蛸。
桑螵蛸[14]含蛋白质、氨基酸、磷脂类、脂肪、粗蛋白、粗纤维、铁钙胡萝卜素样色素、柠檬酸钙结晶、糖蛋白及脂蛋白，其中蛋白质占58.5%，脂肪占11.95%，糖占1.6%，粗纤维占20.16%;此外，桑螵蛸[15]還含有Fe、Cu、Zn、Mn、I、Co、Cr、Ni等20余种微量元素及K、P、Ca、Na、Mg等常量元素，桑螵蛸的药用功能与其化学成分是密切相关的。杨会全等[16]对3种桑螵蛸氨基酸含量进行了分析，指出3种桑螵蛸均含有18种氨基酸，其中为人体必需的8种氨基酸。黑螵蛸总的氨基酸含量最多，长螵蛸次之，团螵蛸最少。黑螵蛸酪氨酸含量为最高，在人体中酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成L-多巴，因此在抗氧化、精神调节、增强皮肤保护功能等方面黑螵蛸具有重要作用。桑螵蛸磷脂含量丰富，有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇及溶血磷脂酰胆碱等，总含量为0.43%。李翔[17]从团螵蛸中分离得到络氨酸、氰尿酸、尿嘧啶、对苯二酚、胡椒酸、谷甾醇、1-（3，4-二羟基）-2-乙酰氨基-乙酮、2，2-联苯二甲酸、3-氨基哌嗪-2，5-二酮共9个化合物。巍署飔[18]从桑螵蛸中分离得到对羟基苯乙醇、对羟基苯甲醇、3-苯基-1，2丙二醇、胆甾醇等21种化合物，可惜的是都没有测定其抗氧化性。经结构分析，可以预测对苯二酚、1-（3，4-二羟基）-2-乙酰氨基-乙酮、对羟基苯乙醇、对羟基苯甲醇属于酚类化合物，都具有抗氧化性。从蔬菜和水果中提取的酚类化合物被证明具有抗氧化的生物活性。该研究也证明了这一点。临床上，癌症产生于机体某些组织的氧化，酚类化合物因具有抗氧化性而常被用于抗癌剂[19]。笔者采用生物活性为导向的新型分离方法，分离得到了N- （3，4-二羟基苯基乙基）乙酰胺、2，4-二丁基苯酚2种有生物活性的化合物。这种方法保证分离得到的化合物都具有相应的生物活性，没有生物活性的成分在分离过程中得到有效排除。这种分离方法是为分离具有某种生物活性的有效成分而采用的。
为了测量抗自由基化合物的总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC），研究者比较了最常用的2种方法，带有颜色的自由基化合物ABTS（2，2-azino-bis-（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonicacid）[20]和DPPH（ 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）成为常用的自由基化合物。在食品的抗氧化能力的测定中，这2种方法都被采用，都是利用颜色的变化来测定抗氧化能力，但表现出不同的机理[21]。 ABTS 方法 通常被用来测定亲水化合物的抗氧化能力，而 DPPH方法可以用来测定水提取物或有机溶剂提取物中的各种亲水化合物和亲脂化合物的抗氧化能力[22]。有研究者同样认为，
ABTS方法是基于蓝绿变化的ABTS离子，因此这个体系适用于水相反应环境，同时适用于亲水化合物。 而DPPH 方法是建立在有机相中的自由基变化，适用于有机相反应环境，主要用于亲脂化合物[23]。DPPH方法适用面更广，同时拥有很多优点，常温下形成稳定的自由基和简单、容易的实验操作条件是最大的优点[24]。DPPH 紫色溶液在320～325、515～520 nm波长处有2个特征的吸收峰，515～520 nm 变化更明显，常被采用于测试波长。但要注意的是，DPPH自由基溶液在517 nm波长处的吸光度变化并非随加入的抗氧化剂量的变化呈线性关系[25]。现有几个明显的试验研究结果已经证明两者不是线性关系[26-27]，因此过去很多的DPPH试验使用线性方程进行结果分析存在较大的系统误差。该试验结果也同样证明这一点。DPPH活性检测试验在恒温、黑暗条件下进行，测定结果最佳。化合物1在前文中已经报道过[28]。化合物1和2是典型的抗动脉硬化药物，对低密度脂蛋白的氧化变异有优良的抗氧化效果，研究中则表现出优良的抗自由基活性。
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