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摘要：目的：观察不同浓度的谷氨酸预处理对星形胶质细胞胞膜上兴奋性氨基酸受体（EAAT2）表达的影响。方法：在纯培养的星形胶质细胞上，用低浓度的谷氨酸溶液进行连续短时刺激，用Western Blot法检测该细胞EAAT2的表达量，以观察谷氨酸预处理对星形胶质细胞的影响。结果：谷氨酸预处理能够增加EAAT2的蛋白表达量，在10μmol/L浓度的谷氨酸预处理细胞2h复灌6h最显著。结论：较低浓度的谷氨酸作用较长时间可以增加EAAT2的表达量。
关键词：谷氨酸预处理；星形胶质细胞；EAAT2
发生脑缺血时脑部损伤部位会产生大量的谷氨酸，谷氨酸的积聚会对神经细胞产生兴奋性毒性，研究表明这是导致神经元产生继发性损伤的关键。在生理条件下，谷氨酸会被兴奋性氨基酸转运体（EAAT）清除，EAAT的一种主要分布在星形胶质细胞上的亚型EAAT2清除谷氨酸作用尤其明显。有研究报道，脑缺血损伤后，星形胶质细胞EAAT2表达会明显增加[1]，在星形胶质细胞上过表达EAAT2，可保护中等程度的脑缺血损伤[2]。所以，通过增强EAAT2的表达可保护神经元。但如何才能实现临床可应用的EAAT2表达增强呢？有报道说明一定量的谷氨酸会诱导EAAT2的表达，本研究试图探讨通过谷氨酸的预处理能否改变星形胶质细胞EAAT2的表达，进而产生保护作用。
一、材料和方法
1、实验主要试剂和仪器 谷氨酸（Glu）、头孢曲松钠（CEF）、丙烯酰胺、甲又双丙烯酰胺均购自Sigma公司，RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所，一抗兔抗大鼠EAAT2多克隆抗体、一抗兔抗大鼠GFAP多克隆抗体、二抗鼠抗兔抗体均购自武汉博士德生物有限公司。
2、星形胶质细胞的培养 取出生24h内的Sprague-Dawley大鼠新生鼠，75%乙醇消毒，断头取脑并在解剖显微镜下分离出大脑皮层组织，至于0.25%的胰酶中消化18min（37℃）。用5%FBS终止消化后，DMEM清洗，机械吹打分离细胞，收集细胞悬液离心沉淀，最后将细胞重悬于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，种植于培养瓶内。3-5天换液，9-10天后于恒温摇床260rpm摇12小时以去除神经元细胞和小胶质细胞等，弃除细胞悬液后0.25%的胰酶中消化1-3min（37℃），5%FBS终止消化后吹打悬浮细胞，离心沉淀后再重悬细胞于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中。
3、蛋白质样品制备 取出RIPA裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的终浓度为1mM待用。将处理后的细胞培养液吸去，用PBS洗两遍，之后加入溶解了PMSF的裂解液，每孔200ul，放在冰上震荡15min。用刮板刀轻轻刮每个孔底部，能看到淡淡白色物质，将每孔内的物质分别吸到每个EP管内，轻轻吹打数次后4℃12000g离心30min。将每孔上清分别吸至新EP管，-20℃保存。
4、蛋白印迹法（western blot） 蛋白定量配平各组蛋白浓度后，加入SDS Loading Buffer95℃变性5min，样品蛋白（20μg）行10%SDS-PAGE电泳并转膜。5﹪羊血清封闭硝酸纤维素膜2 h后，加入EAAT2抗体（1：400）、GFAP抗体（1：2000）或β-actin一抗（1：2000），4℃反应过夜。次日洗膜，加入1：1000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，洗膜后加ECL显色剂，X片显影。Image J图象分析软件根据光密度定量分析。
二、观察指标
每组设置空白组，绝对兴奋组及实验组，绝对兴奋组选用CEF（头孢曲松钠）作为绝对兴奋剂，取两种不同浓度。星形胶质细胞在六孔细胞板上进行预处理，每组实验拟定两块细胞板。
1、每块细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，预处理30 min，处理结束后换上新鲜培养液，复灌6 h。
2、每块细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，预处理2 h，处理结束后换上新鲜培养液，复灌6h。
3、细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的时间为2 h，每组下采用Glutamate浓度梯度处理细胞。
4、细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的时间为48 h，每组下采用Glutamate浓度梯度处理细胞。
5、以上处理结束后，均用western-blotting方法对蛋白进行分离和定量分析。
6、实验数据处理 所有数据均由Microsoft office2010处理，进行假设t检验；图均用Graphpad Prism5绘制。
三、实验结果
3.1不同浓度的Glutamate预处理30min复灌6h对EAAT2表达的影响
如圖1所示，各浓度Glutamate处理30min都不能明显增加EAAT2的表达量，阳性对照CEF组能明显增加EAAT2的表达量。
30min/6h谷氨酸处理后EAAT2表达的Western blot灰度分析结果。Image J图象分析软件根据光密度定量分析。数值均以control组值作为对照进行标准化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式给出。*P<0.05与Control组相比。
3.2不同浓度的Glutamate预处理2h复灌6h对EAAT2表达的影响
如图2所示，10uM Glutamate处理2h可以明显增加EAAT2的表达量，阳性对照CEF组能明显增加EAAT2的表达量。
2h/6h谷氨酸处理后EAAT2表达的Western blot灰度分析结果。Image J图象分析软件根据光密度定量分析。数值均以control组值作为对照进行标准化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式给出。*P<0.05，**P<0.01与Control组相比。 四、讨论
脑缺血损伤时，谷氨酸因过度释放会大量积聚在损伤部位的神经细胞突触间隙中，这将会过度激活细胞膜上的受体，对神经元产生兴奋性毒性，是神经细胞功能损伤的重要病理生理基础[3]。谷氨酸转运体可以摄取损伤产生的大量谷氨酸，研究表明多种生理和病理生理的刺激能调节谷氨酸转运蛋白的活性和表达：低浓度Glu作用6h，大脑皮层神经细胞即有凋亡细胞的出现，12h后漸增多，以18h达到高峰，为12%[4]。因此，星形胶质细胞的培养是基础与临床神经科学研究的基础，研究星形胶质细胞Glutamate等化学因素损伤后的细胞内分子表达的改变，对于研究疾病机理、指导临床诊断治疗具有一定的意义。
本研究中，各浓度组谷氨酸处理30min复灌6h后，10uM浓度组能稍微增加EAAT2的表达，但并没有显著性差异，所以，我们得出结论：各浓度谷氨酸处理30min都不能明显增加EAAT2的表达量，阳性对照CEF组能明显增加EAAT2的表达量。各浓度组谷氨酸处理2h复灌6h后，能够明显增加EAAT2的表达量，并且在10uM浓度组最为明显（P<0.01），甚至和阳性对照组相当，所以，我们得出结论：10uM 谷氨酸处理2h复灌6h能明显增加EAAT2的表达量。最终结论为：谷氨酸预处理能够增加EAAT2的蛋白表达量，在10μmol/L浓度的谷氨酸预处理2h最显著。即较低浓度的谷氨酸作用较长时间可以增加EAAT2的表达量。
参考文献：
[1]粱辉，陈虎，蔡定芳.急性脑缺血损伤大鼠海马神经元谷氨酸转运体的表达[J].中国病理生理杂志，2005，21（6）： 1061-1065.
[2]张光运，段丽，饶志仁.局灶性脑梗死引起谷氨酸转运体在星形胶质细胞的表达[J].解剖学报，2004，35（6）：574-577.
[3]Lo EH，Moskowitz MA，Jacobs TP.Exciting radical suicidal： how brain cells die a Rerstroke[J].Stroke， 2005，36（2）： 189-192.
[4]杨翠，赵晏.谷氨酸介导的大脑皮层神经细胞凋亡[J].西安医科大学学报，2001，22（3）：75-77.
基金项目：作者主持皖南医学院2017年度中青年科研基金项目“谷氨酸预处理对星形胶质细胞EAAT2表达和氧糖剥夺神经元存活率的影响”（编号：WK201701）
关键词：谷氨酸预处理；星形胶质细胞；EAAT2
发生脑缺血时脑部损伤部位会产生大量的谷氨酸，谷氨酸的积聚会对神经细胞产生兴奋性毒性，研究表明这是导致神经元产生继发性损伤的关键。在生理条件下，谷氨酸会被兴奋性氨基酸转运体（EAAT）清除，EAAT的一种主要分布在星形胶质细胞上的亚型EAAT2清除谷氨酸作用尤其明显。有研究报道，脑缺血损伤后，星形胶质细胞EAAT2表达会明显增加[1]，在星形胶质细胞上过表达EAAT2，可保护中等程度的脑缺血损伤[2]。所以，通过增强EAAT2的表达可保护神经元。但如何才能实现临床可应用的EAAT2表达增强呢？有报道说明一定量的谷氨酸会诱导EAAT2的表达，本研究试图探讨通过谷氨酸的预处理能否改变星形胶质细胞EAAT2的表达，进而产生保护作用。
一、材料和方法
1、实验主要试剂和仪器 谷氨酸（Glu）、头孢曲松钠（CEF）、丙烯酰胺、甲又双丙烯酰胺均购自Sigma公司，RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所，一抗兔抗大鼠EAAT2多克隆抗体、一抗兔抗大鼠GFAP多克隆抗体、二抗鼠抗兔抗体均购自武汉博士德生物有限公司。
2、星形胶质细胞的培养 取出生24h内的Sprague-Dawley大鼠新生鼠，75%乙醇消毒，断头取脑并在解剖显微镜下分离出大脑皮层组织，至于0.25%的胰酶中消化18min（37℃）。用5%FBS终止消化后，DMEM清洗，机械吹打分离细胞，收集细胞悬液离心沉淀，最后将细胞重悬于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，种植于培养瓶内。3-5天换液，9-10天后于恒温摇床260rpm摇12小时以去除神经元细胞和小胶质细胞等，弃除细胞悬液后0.25%的胰酶中消化1-3min（37℃），5%FBS终止消化后吹打悬浮细胞，离心沉淀后再重悬细胞于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中。
3、蛋白质样品制备 取出RIPA裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的终浓度为1mM待用。将处理后的细胞培养液吸去，用PBS洗两遍，之后加入溶解了PMSF的裂解液，每孔200ul，放在冰上震荡15min。用刮板刀轻轻刮每个孔底部，能看到淡淡白色物质，将每孔内的物质分别吸到每个EP管内，轻轻吹打数次后4℃12000g离心30min。将每孔上清分别吸至新EP管，-20℃保存。
4、蛋白印迹法（western blot） 蛋白定量配平各组蛋白浓度后，加入SDS Loading Buffer95℃变性5min，样品蛋白（20μg）行10%SDS-PAGE电泳并转膜。5﹪羊血清封闭硝酸纤维素膜2 h后，加入EAAT2抗体（1：400）、GFAP抗体（1：2000）或β-actin一抗（1：2000），4℃反应过夜。次日洗膜，加入1：1000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h，洗膜后加ECL显色剂，X片显影。Image J图象分析软件根据光密度定量分析。
二、观察指标
每组设置空白组，绝对兴奋组及实验组，绝对兴奋组选用CEF（头孢曲松钠）作为绝对兴奋剂，取两种不同浓度。星形胶质细胞在六孔细胞板上进行预处理，每组实验拟定两块细胞板。
1、每块细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，预处理30 min，处理结束后换上新鲜培养液，复灌6 h。
2、每块细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，预处理2 h，处理结束后换上新鲜培养液，复灌6h。
3、细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的时间为2 h，每组下采用Glutamate浓度梯度处理细胞。
4、细胞板控制预处理的Glutamate溶液和CEF溶液的时间为48 h，每组下采用Glutamate浓度梯度处理细胞。
5、以上处理结束后，均用western-blotting方法对蛋白进行分离和定量分析。
6、实验数据处理 所有数据均由Microsoft office2010处理，进行假设t检验；图均用Graphpad Prism5绘制。
三、实验结果
3.1不同浓度的Glutamate预处理30min复灌6h对EAAT2表达的影响
如圖1所示，各浓度Glutamate处理30min都不能明显增加EAAT2的表达量，阳性对照CEF组能明显增加EAAT2的表达量。
30min/6h谷氨酸处理后EAAT2表达的Western blot灰度分析结果。Image J图象分析软件根据光密度定量分析。数值均以control组值作为对照进行标准化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式给出。*P<0.05与Control组相比。
3.2不同浓度的Glutamate预处理2h复灌6h对EAAT2表达的影响
如图2所示，10uM Glutamate处理2h可以明显增加EAAT2的表达量，阳性对照CEF组能明显增加EAAT2的表达量。
2h/6h谷氨酸处理后EAAT2表达的Western blot灰度分析结果。Image J图象分析软件根据光密度定量分析。数值均以control组值作为对照进行标准化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式给出。*P<0.05，**P<0.01与Control组相比。 四、讨论
脑缺血损伤时，谷氨酸因过度释放会大量积聚在损伤部位的神经细胞突触间隙中，这将会过度激活细胞膜上的受体，对神经元产生兴奋性毒性，是神经细胞功能损伤的重要病理生理基础[3]。谷氨酸转运体可以摄取损伤产生的大量谷氨酸，研究表明多种生理和病理生理的刺激能调节谷氨酸转运蛋白的活性和表达：低浓度Glu作用6h，大脑皮层神经细胞即有凋亡细胞的出现，12h后漸增多，以18h达到高峰，为12%[4]。因此，星形胶质细胞的培养是基础与临床神经科学研究的基础，研究星形胶质细胞Glutamate等化学因素损伤后的细胞内分子表达的改变，对于研究疾病机理、指导临床诊断治疗具有一定的意义。
本研究中，各浓度组谷氨酸处理30min复灌6h后，10uM浓度组能稍微增加EAAT2的表达，但并没有显著性差异，所以，我们得出结论：各浓度谷氨酸处理30min都不能明显增加EAAT2的表达量，阳性对照CEF组能明显增加EAAT2的表达量。各浓度组谷氨酸处理2h复灌6h后，能够明显增加EAAT2的表达量，并且在10uM浓度组最为明显（P<0.01），甚至和阳性对照组相当，所以，我们得出结论：10uM 谷氨酸处理2h复灌6h能明显增加EAAT2的表达量。最终结论为：谷氨酸预处理能够增加EAAT2的蛋白表达量，在10μmol/L浓度的谷氨酸预处理2h最显著。即较低浓度的谷氨酸作用较长时间可以增加EAAT2的表达量。
参考文献：
[1]粱辉，陈虎，蔡定芳.急性脑缺血损伤大鼠海马神经元谷氨酸转运体的表达[J].中国病理生理杂志，2005，21（6）： 1061-1065.
[2]张光运，段丽，饶志仁.局灶性脑梗死引起谷氨酸转运体在星形胶质细胞的表达[J].解剖学报，2004，35（6）：574-577.
[3]Lo EH，Moskowitz MA，Jacobs TP.Exciting radical suicidal： how brain cells die a Rerstroke[J].Stroke， 2005，36（2）： 189-192.
[4]杨翠，赵晏.谷氨酸介导的大脑皮层神经细胞凋亡[J].西安医科大学学报，2001，22（3）：75-77.
基金项目：作者主持皖南医学院2017年度中青年科研基金项目“谷氨酸预处理对星形胶质细胞EAAT2表达和氧糖剥夺神经元存活率的影响”（编号：WK201701）