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摘要 采用 16S rDNA PCR-RFLP、16S rDNA全序列分析、BOX-PCR等多相分类技术，对采集自陕西神木、甘肃天水、青海泽库地区的豆科植物根瘤内生细菌资源的多样性进行了研究。从采集的豆科植物根瘤中共分离到50株供试菌株，对这50株供试菌株和8株参比菌株进行了16S rDNA PCR-RFLP 聚类分析。结果显示，全部供试菌株在81.5%的相似性水平上分成4个分支（在86%相似性水平上，分支I包括3个群，分支III包括3个群）。选取各群代表菌株进行16S rDNA 测序，确定了50株供试菌株中，1株属于慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），1株属于土壤杆菌属（Agrobacterium），6株属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium），27株属于芽孢杆菌属（Bacillus），2株属于类芽孢杆菌属（Paenibacillus），其余13株则分别归属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）和泛菌属（Pantoea）。表明16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析结果具有较好的一致性。对部分16SrDNA序列相似性达到100%的菌株进行BOX-PCR来确定是否为同一克隆。研究结果表明，陕西神木等地区豆科植物根瘤内生菌具有很丰富的遗传多样性。
关键词 根瘤内生菌；根瘤菌系统发育；多样性
中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）18-056-06
根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，其显著特点是能够通过侵染豆科植物的根或茎形成根瘤或茎瘤与豆科植物进行共生固氮[1]，属于根瘤内生细菌，它可将空气中游离态的氮气转化为化合态氮，以氨的形式为宿主植物提供氮素营养。然而，在豆科植物的根瘤内，不但有根瘤菌能与之形成共生关系；还存在许多非共生细菌，能与之形成多种相互关系。相对根瘤菌而言，对根瘤内生细菌的研究相对较少。
植物内生细菌是指能定殖在活体植物内，一般不引起寄（宿）主植物组织结构发生明显变化和病害症状，且能够与植物建立动态平衡和谐联合关系的一类微生物[2]。植物内生细菌具有丰富的多样性，部分植物内生细菌具有生物防治、植物促生和内共生固氮等作用[3-4]。由于现代农业中大量使用农药和化肥，使得植物和土壤中微生物的多样性大为减少；重视植物内生细菌的研究与应用，可有效减少和替代农药以及化肥的使用。研究以及保护植物内生细菌的多样性对于保持微生物多样性及改善农业生态系统具有重要意义[5]。
陕西省神木县、甘肃省天水市以及青海省泽库县位于我国西北部地区，具有地势较高，冬长夏短，年降雨量较少，日照时间长，温差较大，土壤资源种类丰富等特点。由于此前对该地域豆科植物根瘤内生细菌资源多样性研究较少，故笔者对从该地域采集的豆科植物根瘤内生细菌的多样性和系统发育进行研究，对于丰富我国根瘤内生细菌资源具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料 将采集自陕西神木等地区的根瘤用无菌水浸泡过夜，95%乙醇浸泡5 min后用0.1% HgCl2 表面灭菌5 min，无菌水洗涤 6次，然后用无菌镊子将其夹碎，挤出汁液，逐个划线接种于YMA 平板[6]，于 28 ℃培养箱内培养3～7 d。挑取单菌落划线纯化，进行革兰氏染色并镜检[7]，将革兰氏阴性（G-）杆菌作为供试菌并用甘油保存法将其保存于-80 ℃冰箱。选用供试菌株50株，参比菌株8株，详情见表1。
1.2 方法
1.2.1 16S rDNA PCR-RFLP DNA提取。提取方法见参考文献[8]。正向引物P1为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，其序列对应于E.coli 16S rDNA基因第8～37碱基位置；反向引物P6 为 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC -3′，其序列为对应第1 479～1 506 碱基位置[9]，引物由上海生工生物公司合成。
扩增体系（50 μl）：2×Taq PCR Green Mix （0.1 U/μl Taq DNA聚合酶，2×反应缓冲液，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs ）25 μl，DNA模板10 μl，引物P1 1 μl，引物P6 1 μl，ddH2O补充至50 μl。
PCR的反应条件：92 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，32 个循环；72 ℃延伸 6 min；4 ℃贮存。扩增产物用1%含EB的琼脂糖凝胶检测，100 V电泳15 min，UV扫描，并保存为TIF文件。
用4 种限制性内切酶：HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和HaeⅢ对扩增产物进行酶切。
酶切反应体系（30 μl）：PCR产物10 μl，内切酶缓冲液2 μl，内切酶（约10U）1 μl，ddH2O补充至30 μl。
按反应体系配制，37 ℃水浴4 h。取15 μl酶切产物与3 μl 6×Loading Buffer混合后点样，用3%含EB的琼脂糖凝胶，100 V水平电泳1.5 h，UV扫描，并保存为TIF格式文件。
对4种酶切图谱作均一化处理，把所得的酶切带型转化为“0”和“1”数字符，即有条带记为“1”，无条带记为“0”，以平均连锁法（UPGMA）聚类，通过NTSYS.2.10软件进行相似性分析，最后绘制成UPGMA树状图[10]。
1.2.2 16S rDNA全序列分析。根据16S rDNA PCR-RFLP的酶切树状图结果，选取每个表观群代表菌株进行16S rDNA PCR扩增[11]，PCR产物经电泳检测后交由上海生工生物公司进行测序，将测得序列与GenBank中已知种序列通过MEGA5.0 中的ClustalW 进行多序列比对，系统发育树的构建采用邻接法（Neighbour-joining）[12]，相似性计算采用Kimura two-parameter模型[13]，自展值（Bootstrap）为1 000[14-15]，并计算各菌株之间的相似性距离。 1.2.3 BOX -PCR 指纹图谱分析。DNA 提取同“1.2.1”。引物为 BOXA1R ：5′-CTA CGG CAA GGC GACGCT GAC G -3′[16]，扩增过程见参考文献[17]。BOX-PCR产物经 1.5% 琼脂糖凝胶（含 EB）电泳分离，电泳条件为100 V，1.5 h，UV扫描，将图谱保存为TIF格式文件，之后对BOX -PCR 指纹的电泳图像进行观察比较和分析。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA PCR-RFLP分析 通过50株供试菌株和8株已知参比菌株16S rDNA PCR-RFLP结果分析，建立了聚类树状图（图1）。由图1可知，在81.5%的水平上，供试菌株聚成了4个分支；在86%的相似性水平上，分支I又分为群1、群2和群3，分支III又分为群4、群5以及群6。群1包括CNU 093801与Bradyrhizobium japonicum USDA 6T所形成的分支，群2包括CNU 091209等6株供试菌株与Sinorhizobium fredii USDA 205T、S.americanum CFN156T、S.meliloti USDA 1002T、Mesorhizobium loti NZP 2213T、Rhizobium leguminosarum USDA2370T所形成的分支，这6株供试菌株宿主均为Glycine max。
图3由参比菌株Agrobacterium tumefaciens IAM13129T、A.rubi LMG 156T和与其聚在一起的CNU 091238组成，供试菌株宿主为Vigna angularis。除分支I与参比菌株聚在一起外，分支II、III、IV均未与参比菌株聚在一起。分支II涵盖来自甘肃天水、青海泽库、陕西神木3个采集地区的27株供试菌株，宿主很广泛，有Kummerowia striata 、Oxytropis ochrocephala、Glycine max、Phaseolus vulgaris 4种豆科植物。与此类似，未能与参比菌株聚在一起的分支III分为3个群，群4由CNU 093803在内的6株菌构成，宿主同样来自3个地区，涵盖4种豆科植物；群5由CNU 091208和CNU 091246组成；群6由CNU 091221在内的5株菌构成，且群5和群6的宿主均为采集自陕西神木的Glycine max。分支Ⅳ则由2株供试菌株CNU 091213和CNU 091250形成的独立分支组成。这2株菌宿主都是Glycine max，采集地都在陕西神木。
2.2 16S rDNA 全序列分析 依据 16S rDNA PCR-RFLP 聚类结果，选取各分支代表菌株 1～3 株共20株进行 16S rDNA 全序列测定，并根据测序结果构建系统发育树状图（图2）。由图2可知，16S rDNA 测序结果与 16S rDNA PCR-RFLP 的结果基本一致。
由图2可知，处于分支I群2的5株中华根瘤菌CNU 091209、CNU 091211、CNU 091214、CNU 091223、CNU 091239的系统发育相似性为100%，需要进一步通过BOX-PCR指纹图谱来判断是否为同一个克隆。处于分支I群3的CNU 091238与A.tumefaciens IAM 13129T 的相似性为99.5%；处于分支I群1的CNU 093801与B.japonicum LMG 6138T的相似性为99.4%，这2株菌需要通过与参比菌株进行DNA-DNA同源性分析确定是否为新种。
处于分支II的CNU 091249在内的属于芽孢杆菌属的6株菌，与以CNU 091213和CNU 091250组成的分支IV且属于类芽孢杆菌属的2株菌聚在一起，其中CNU 091222与CNU 091224的相似性为100%，需要进一步通过BOX-PCR指纹图谱来判断是否为同一个克隆。在芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的系统发育分支构建上，16SrDNA全序列测定结果较16S rDNA PCR-RFLP 聚类结果更为准确合理。
此外，图2还显示出根瘤内生细菌的多样性。其中CNU 091208与寡养单胞菌属Stenotrophominas rhizophila DSM 14405T的相似性为100%；CNU 091235与假单胞菌属Pseudomonas koreensis LMG 21318T的相似性为99.8%；而CNU 093803与CNU 091233、CNU 091243的相似性均为99.8%，且这3株菌与泛菌属Pantoea agglomerans ATCC 27155T的相似性均在99.8%以上。
2.3 BOX-PCR结果 由于分支I群2内属于中华根瘤菌属的菌株CNU 091209、CNU 091211、CNU 091214、CNU 091223和CNU 091239的16S rDNA序列相似性达到100%，分支II属于芽孢杆菌属的菌株 CNU 091222和CNU 091224的相似性也达到 100%（图2）。故对这些菌株分别进行了 BOX-PCR（图3）。从图3可以看出，CNU 091211、CNU 091223与CNU 091239的BOX指纹图谱一致，代表这3株菌为同一个克隆；而CNU 091209、CNU 091214与这3株菌的BOX指纹图谱不一致，则与这3株不是相同克隆。此外，指纹图谱不一致的3株菌需要通过与参比菌株进行DNA-DNA同源性分析以确定是否为新种。分支II中属于芽孢菌属的CNU 091222与CNU 091224的 BOX 指纹图谱一致，所以这2株菌也为同一个克隆。
3 讨论
3.1 陕西等地区根瘤内生根瘤菌的多样性 从50株供试菌株中，有6株分离自陕西神木大豆根瘤内的内生细菌属于中华根瘤菌属，无论是16S rDNA PCR-RFLP还是16S rDNA全序列分析，它们都与S.fredii和S.americanum聚在一起。S.fredii是Scholla 等[18]于1984年发现并命名为Rhizobium fredii；Chen等[19]在1988年从中国新疆大豆中也分离到该菌，基于研究结果，她提出建立新属Sinorhzobium并将其归并其中，将该菌重新命名为S.fredii。该种的宿主主要是大豆，并在大豆根瘤中占有优势，该研究结果与此有较好的一致性。此外，在豇豆、金合欢、菜豆、扁豆等宿主根瘤内分离到该种根瘤菌[20-23]。S.americanum则分离自墨西哥的金合欢属植物Acacia acatlensis，该菌株与S.fredii在16S rDNA水平上相似性较高，能通过DNA杂交、nifH和部分生理生化特征来区分这2株菌[24]。1株分离自甘肃天水鸡眼草根瘤内的内生细菌属于慢生根瘤菌属。B.japonicum是从日本大豆中分离出来的慢生根瘤菌，随着研究的深入，学者们发现其宿主植物众多，从花生、豇豆、绿豆、鸡眼草、葛藤、金合欢、杭子梢等多种豆科植物中均可分离到[25-26]。 3.2 陕西等地区根瘤内非共生菌 从50株供试菌株中，分离到1株属于土壤杆菌属的菌。近年来，从豆科植物根瘤内分离到土壤杆菌的报道愈发频繁。1997年Tan等[27]从采集自陕西等地的甘草、狼牙刺、锦鸡儿等植物的根瘤中分离到A.tumerfaciens；1999年de Lajudie等[28]从非洲合欢等植物根瘤中分离到了A.tumerfaciens；2005年Liu等[29]从紫藤根瘤中也分离到了土壤杆菌。此外，Kan等[30]、Liu等[31]、Li等[32]相继从不同豆科植物中分离到土壤杆菌。该研究分离到的A.tumerfaciens的宿主是采集自陕西神木的赤豆，此前尚未有分离自赤豆根瘤中土壤杆菌的报道。根瘤内生土壤杆菌影响宿主植物结瘤与生长的方式主要体现在对结瘤数量、重量、效率、固氮能力、形态发育的影响以及对其侵入根瘤的途径等方面[33-35]。目前，土壤杆菌对豆科植物根瘤的侵染过程及其与根瘤菌、宿主植物之间的互作是一个极其复杂的过程，尚未有研究准确揭示其机制[36]。
从50株供试菌株中，分离到了27株菌属于芽孢杆菌属，宿主囊括大豆、菜豆、鸡眼草和黄花棘豆；2株属于类芽孢杆菌属，宿主均为大豆。2株属于寡养单胞菌属，5株属于假单胞菌属，宿主均为大豆。6株属于泛菌属，宿主囊括大豆、菜豆、鸡眼草和黄花棘豆。从根瘤中分离到芽孢杆菌的现象时有报道，且芽孢菌作为植物内生细菌，在某些情况下对植物的生长有一定程度的帮助[31-32]。2002年，Bai等[37]发现部分Bacillus属的菌株在与B.japonicum共同接种大豆时，能够增加大豆重量。2005年，Arkhipova等[3]指出，Bacillus subtilis接种植物时能产生细胞分裂素，还能影响植物内源激素的增加。2008年，Zhang等[38]从采集自河北的大豆根系中分离到一株芽孢杆菌新种并命名为Bacillus endoradicis。
2008年，Li等[32]发现我国东北地区栽培大豆的根瘤中不仅能分离到慢生根瘤菌、芽孢菌、土壤杆菌，还能分离到泛菌属的细菌，该报道指出成团泛菌（Pantoea agglomerans）是一种普遍存在于根瘤内的内生菌，且在采集地黑龙江地区的大豆根瘤中占有主要地位；其能够产生IAA从而促进植物生长，还具有一定的固氮能力。2003年研究表明在地瓜茎中分离到的Pantoea agglomerans同样具有固氮能力[39]。
2005年，Di Simona等[40]从富含硒的紫云英属植物（Astragalus bisulcatus）的根际土壤中分离到寡养单胞菌。2007年，Kan等[30]从青海省的Vicia angustifolia（窄叶野豌豆）中分离到2株菌属于寡养单胞菌属。
类芽孢杆菌属是一类普遍存在于自然中并在根际、叶圈、植物内生组织中广泛存在的植物内生细菌[41]。2006年，Zakhia等[42]从突尼斯的野生豆科植物根瘤中分离到属于类芽孢杆菌属（宿主为Lotus argenteus）和假单胞菌属的内生菌（宿主为Medicagotruncatula和Hedysarum carnosum）。Valverde等[43-44]相继在2008年和2010年分别从欧洲栗（Catanea sativa）叶圈和木豆树属植物（Prosopis farcta）根瘤中分离到2株类芽孢杆菌新种Paenibacillus castaneae和Paenibacillus prosopidis。2009年，Son等[45]通过试验验证了Paenibacillus polymyxa和Paenibacillus lentimorbus能够在一定程度上有效抑制由根结线虫（Meloidogyne incognita）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）引起的植物病害。2013年Carro等[41]从鹰嘴豆（Cicer arietinum）中分离到一株类芽孢杆菌新种并命名为Paenibacillus endophyticus。同年Zhang等[46]从梓属植物Catalpa speciosa的根际土壤中分离到一株类芽孢杆菌新种并命名为Paenibacillus catalpae。2014年，Carro等[47]又从采集自西班牙的白羽扇豆（Lupinus albus）的根瘤中分离出一株类芽孢杆菌属新种并命名为Paenibacillus lupin。
4 结论
综上所述，利用多相分类方法对陕西等地区豆科植物根瘤内生菌资源进行调查，显示了陕西等地豆科植物根瘤内生菌具有丰富的遗传多样性。有学者指出，由于受到豆科植物所处区域、气候环境、土壤条件、人类活动影响以及在分离根瘤内生菌时的试验条件、所用培养基、培养方法等的影响，故从豆科植物根瘤中分离到的内生菌会有差异性。
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关键词 根瘤内生菌；根瘤菌系统发育；多样性
中图分类号 S432.4+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）18-056-06
根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，其显著特点是能够通过侵染豆科植物的根或茎形成根瘤或茎瘤与豆科植物进行共生固氮[1]，属于根瘤内生细菌，它可将空气中游离态的氮气转化为化合态氮，以氨的形式为宿主植物提供氮素营养。然而，在豆科植物的根瘤内，不但有根瘤菌能与之形成共生关系；还存在许多非共生细菌，能与之形成多种相互关系。相对根瘤菌而言，对根瘤内生细菌的研究相对较少。
植物内生细菌是指能定殖在活体植物内，一般不引起寄（宿）主植物组织结构发生明显变化和病害症状，且能够与植物建立动态平衡和谐联合关系的一类微生物[2]。植物内生细菌具有丰富的多样性，部分植物内生细菌具有生物防治、植物促生和内共生固氮等作用[3-4]。由于现代农业中大量使用农药和化肥，使得植物和土壤中微生物的多样性大为减少；重视植物内生细菌的研究与应用，可有效减少和替代农药以及化肥的使用。研究以及保护植物内生细菌的多样性对于保持微生物多样性及改善农业生态系统具有重要意义[5]。
陕西省神木县、甘肃省天水市以及青海省泽库县位于我国西北部地区，具有地势较高，冬长夏短，年降雨量较少，日照时间长，温差较大，土壤资源种类丰富等特点。由于此前对该地域豆科植物根瘤内生细菌资源多样性研究较少，故笔者对从该地域采集的豆科植物根瘤内生细菌的多样性和系统发育进行研究，对于丰富我国根瘤内生细菌资源具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料 将采集自陕西神木等地区的根瘤用无菌水浸泡过夜，95%乙醇浸泡5 min后用0.1% HgCl2 表面灭菌5 min，无菌水洗涤 6次，然后用无菌镊子将其夹碎，挤出汁液，逐个划线接种于YMA 平板[6]，于 28 ℃培养箱内培养3～7 d。挑取单菌落划线纯化，进行革兰氏染色并镜检[7]，将革兰氏阴性（G-）杆菌作为供试菌并用甘油保存法将其保存于-80 ℃冰箱。选用供试菌株50株，参比菌株8株，详情见表1。
1.2 方法
1.2.1 16S rDNA PCR-RFLP DNA提取。提取方法见参考文献[8]。正向引物P1为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，其序列对应于E.coli 16S rDNA基因第8～37碱基位置；反向引物P6 为 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC -3′，其序列为对应第1 479～1 506 碱基位置[9]，引物由上海生工生物公司合成。
扩增体系（50 μl）：2×Taq PCR Green Mix （0.1 U/μl Taq DNA聚合酶，2×反应缓冲液，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs ）25 μl，DNA模板10 μl，引物P1 1 μl，引物P6 1 μl，ddH2O补充至50 μl。
PCR的反应条件：92 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，32 个循环；72 ℃延伸 6 min；4 ℃贮存。扩增产物用1%含EB的琼脂糖凝胶检测，100 V电泳15 min，UV扫描，并保存为TIF文件。
用4 种限制性内切酶：HinfⅠ、MspⅠ、AluⅠ和HaeⅢ对扩增产物进行酶切。
酶切反应体系（30 μl）：PCR产物10 μl，内切酶缓冲液2 μl，内切酶（约10U）1 μl，ddH2O补充至30 μl。
按反应体系配制，37 ℃水浴4 h。取15 μl酶切产物与3 μl 6×Loading Buffer混合后点样，用3%含EB的琼脂糖凝胶，100 V水平电泳1.5 h，UV扫描，并保存为TIF格式文件。
对4种酶切图谱作均一化处理，把所得的酶切带型转化为“0”和“1”数字符，即有条带记为“1”，无条带记为“0”，以平均连锁法（UPGMA）聚类，通过NTSYS.2.10软件进行相似性分析，最后绘制成UPGMA树状图[10]。
1.2.2 16S rDNA全序列分析。根据16S rDNA PCR-RFLP的酶切树状图结果，选取每个表观群代表菌株进行16S rDNA PCR扩增[11]，PCR产物经电泳检测后交由上海生工生物公司进行测序，将测得序列与GenBank中已知种序列通过MEGA5.0 中的ClustalW 进行多序列比对，系统发育树的构建采用邻接法（Neighbour-joining）[12]，相似性计算采用Kimura two-parameter模型[13]，自展值（Bootstrap）为1 000[14-15]，并计算各菌株之间的相似性距离。 1.2.3 BOX -PCR 指纹图谱分析。DNA 提取同“1.2.1”。引物为 BOXA1R ：5′-CTA CGG CAA GGC GACGCT GAC G -3′[16]，扩增过程见参考文献[17]。BOX-PCR产物经 1.5% 琼脂糖凝胶（含 EB）电泳分离，电泳条件为100 V，1.5 h，UV扫描，将图谱保存为TIF格式文件，之后对BOX -PCR 指纹的电泳图像进行观察比较和分析。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA PCR-RFLP分析 通过50株供试菌株和8株已知参比菌株16S rDNA PCR-RFLP结果分析，建立了聚类树状图（图1）。由图1可知，在81.5%的水平上，供试菌株聚成了4个分支；在86%的相似性水平上，分支I又分为群1、群2和群3，分支III又分为群4、群5以及群6。群1包括CNU 093801与Bradyrhizobium japonicum USDA 6T所形成的分支，群2包括CNU 091209等6株供试菌株与Sinorhizobium fredii USDA 205T、S.americanum CFN156T、S.meliloti USDA 1002T、Mesorhizobium loti NZP 2213T、Rhizobium leguminosarum USDA2370T所形成的分支，这6株供试菌株宿主均为Glycine max。
图3由参比菌株Agrobacterium tumefaciens IAM13129T、A.rubi LMG 156T和与其聚在一起的CNU 091238组成，供试菌株宿主为Vigna angularis。除分支I与参比菌株聚在一起外，分支II、III、IV均未与参比菌株聚在一起。分支II涵盖来自甘肃天水、青海泽库、陕西神木3个采集地区的27株供试菌株，宿主很广泛，有Kummerowia striata 、Oxytropis ochrocephala、Glycine max、Phaseolus vulgaris 4种豆科植物。与此类似，未能与参比菌株聚在一起的分支III分为3个群，群4由CNU 093803在内的6株菌构成，宿主同样来自3个地区，涵盖4种豆科植物；群5由CNU 091208和CNU 091246组成；群6由CNU 091221在内的5株菌构成，且群5和群6的宿主均为采集自陕西神木的Glycine max。分支Ⅳ则由2株供试菌株CNU 091213和CNU 091250形成的独立分支组成。这2株菌宿主都是Glycine max，采集地都在陕西神木。
2.2 16S rDNA 全序列分析 依据 16S rDNA PCR-RFLP 聚类结果，选取各分支代表菌株 1～3 株共20株进行 16S rDNA 全序列测定，并根据测序结果构建系统发育树状图（图2）。由图2可知，16S rDNA 测序结果与 16S rDNA PCR-RFLP 的结果基本一致。
由图2可知，处于分支I群2的5株中华根瘤菌CNU 091209、CNU 091211、CNU 091214、CNU 091223、CNU 091239的系统发育相似性为100%，需要进一步通过BOX-PCR指纹图谱来判断是否为同一个克隆。处于分支I群3的CNU 091238与A.tumefaciens IAM 13129T 的相似性为99.5%；处于分支I群1的CNU 093801与B.japonicum LMG 6138T的相似性为99.4%，这2株菌需要通过与参比菌株进行DNA-DNA同源性分析确定是否为新种。
处于分支II的CNU 091249在内的属于芽孢杆菌属的6株菌，与以CNU 091213和CNU 091250组成的分支IV且属于类芽孢杆菌属的2株菌聚在一起，其中CNU 091222与CNU 091224的相似性为100%，需要进一步通过BOX-PCR指纹图谱来判断是否为同一个克隆。在芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属的系统发育分支构建上，16SrDNA全序列测定结果较16S rDNA PCR-RFLP 聚类结果更为准确合理。
此外，图2还显示出根瘤内生细菌的多样性。其中CNU 091208与寡养单胞菌属Stenotrophominas rhizophila DSM 14405T的相似性为100%；CNU 091235与假单胞菌属Pseudomonas koreensis LMG 21318T的相似性为99.8%；而CNU 093803与CNU 091233、CNU 091243的相似性均为99.8%，且这3株菌与泛菌属Pantoea agglomerans ATCC 27155T的相似性均在99.8%以上。
2.3 BOX-PCR结果 由于分支I群2内属于中华根瘤菌属的菌株CNU 091209、CNU 091211、CNU 091214、CNU 091223和CNU 091239的16S rDNA序列相似性达到100%，分支II属于芽孢杆菌属的菌株 CNU 091222和CNU 091224的相似性也达到 100%（图2）。故对这些菌株分别进行了 BOX-PCR（图3）。从图3可以看出，CNU 091211、CNU 091223与CNU 091239的BOX指纹图谱一致，代表这3株菌为同一个克隆；而CNU 091209、CNU 091214与这3株菌的BOX指纹图谱不一致，则与这3株不是相同克隆。此外，指纹图谱不一致的3株菌需要通过与参比菌株进行DNA-DNA同源性分析以确定是否为新种。分支II中属于芽孢菌属的CNU 091222与CNU 091224的 BOX 指纹图谱一致，所以这2株菌也为同一个克隆。
3 讨论
3.1 陕西等地区根瘤内生根瘤菌的多样性 从50株供试菌株中，有6株分离自陕西神木大豆根瘤内的内生细菌属于中华根瘤菌属，无论是16S rDNA PCR-RFLP还是16S rDNA全序列分析，它们都与S.fredii和S.americanum聚在一起。S.fredii是Scholla 等[18]于1984年发现并命名为Rhizobium fredii；Chen等[19]在1988年从中国新疆大豆中也分离到该菌，基于研究结果，她提出建立新属Sinorhzobium并将其归并其中，将该菌重新命名为S.fredii。该种的宿主主要是大豆，并在大豆根瘤中占有优势，该研究结果与此有较好的一致性。此外，在豇豆、金合欢、菜豆、扁豆等宿主根瘤内分离到该种根瘤菌[20-23]。S.americanum则分离自墨西哥的金合欢属植物Acacia acatlensis，该菌株与S.fredii在16S rDNA水平上相似性较高，能通过DNA杂交、nifH和部分生理生化特征来区分这2株菌[24]。1株分离自甘肃天水鸡眼草根瘤内的内生细菌属于慢生根瘤菌属。B.japonicum是从日本大豆中分离出来的慢生根瘤菌，随着研究的深入，学者们发现其宿主植物众多，从花生、豇豆、绿豆、鸡眼草、葛藤、金合欢、杭子梢等多种豆科植物中均可分离到[25-26]。 3.2 陕西等地区根瘤内非共生菌 从50株供试菌株中，分离到1株属于土壤杆菌属的菌。近年来，从豆科植物根瘤内分离到土壤杆菌的报道愈发频繁。1997年Tan等[27]从采集自陕西等地的甘草、狼牙刺、锦鸡儿等植物的根瘤中分离到A.tumerfaciens；1999年de Lajudie等[28]从非洲合欢等植物根瘤中分离到了A.tumerfaciens；2005年Liu等[29]从紫藤根瘤中也分离到了土壤杆菌。此外，Kan等[30]、Liu等[31]、Li等[32]相继从不同豆科植物中分离到土壤杆菌。该研究分离到的A.tumerfaciens的宿主是采集自陕西神木的赤豆，此前尚未有分离自赤豆根瘤中土壤杆菌的报道。根瘤内生土壤杆菌影响宿主植物结瘤与生长的方式主要体现在对结瘤数量、重量、效率、固氮能力、形态发育的影响以及对其侵入根瘤的途径等方面[33-35]。目前，土壤杆菌对豆科植物根瘤的侵染过程及其与根瘤菌、宿主植物之间的互作是一个极其复杂的过程，尚未有研究准确揭示其机制[36]。
从50株供试菌株中，分离到了27株菌属于芽孢杆菌属，宿主囊括大豆、菜豆、鸡眼草和黄花棘豆；2株属于类芽孢杆菌属，宿主均为大豆。2株属于寡养单胞菌属，5株属于假单胞菌属，宿主均为大豆。6株属于泛菌属，宿主囊括大豆、菜豆、鸡眼草和黄花棘豆。从根瘤中分离到芽孢杆菌的现象时有报道，且芽孢菌作为植物内生细菌，在某些情况下对植物的生长有一定程度的帮助[31-32]。2002年，Bai等[37]发现部分Bacillus属的菌株在与B.japonicum共同接种大豆时，能够增加大豆重量。2005年，Arkhipova等[3]指出，Bacillus subtilis接种植物时能产生细胞分裂素，还能影响植物内源激素的增加。2008年，Zhang等[38]从采集自河北的大豆根系中分离到一株芽孢杆菌新种并命名为Bacillus endoradicis。
2008年，Li等[32]发现我国东北地区栽培大豆的根瘤中不仅能分离到慢生根瘤菌、芽孢菌、土壤杆菌，还能分离到泛菌属的细菌，该报道指出成团泛菌（Pantoea agglomerans）是一种普遍存在于根瘤内的内生菌，且在采集地黑龙江地区的大豆根瘤中占有主要地位；其能够产生IAA从而促进植物生长，还具有一定的固氮能力。2003年研究表明在地瓜茎中分离到的Pantoea agglomerans同样具有固氮能力[39]。
2005年，Di Simona等[40]从富含硒的紫云英属植物（Astragalus bisulcatus）的根际土壤中分离到寡养单胞菌。2007年，Kan等[30]从青海省的Vicia angustifolia（窄叶野豌豆）中分离到2株菌属于寡养单胞菌属。
类芽孢杆菌属是一类普遍存在于自然中并在根际、叶圈、植物内生组织中广泛存在的植物内生细菌[41]。2006年，Zakhia等[42]从突尼斯的野生豆科植物根瘤中分离到属于类芽孢杆菌属（宿主为Lotus argenteus）和假单胞菌属的内生菌（宿主为Medicagotruncatula和Hedysarum carnosum）。Valverde等[43-44]相继在2008年和2010年分别从欧洲栗（Catanea sativa）叶圈和木豆树属植物（Prosopis farcta）根瘤中分离到2株类芽孢杆菌新种Paenibacillus castaneae和Paenibacillus prosopidis。2009年，Son等[45]通过试验验证了Paenibacillus polymyxa和Paenibacillus lentimorbus能够在一定程度上有效抑制由根结线虫（Meloidogyne incognita）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）引起的植物病害。2013年Carro等[41]从鹰嘴豆（Cicer arietinum）中分离到一株类芽孢杆菌新种并命名为Paenibacillus endophyticus。同年Zhang等[46]从梓属植物Catalpa speciosa的根际土壤中分离到一株类芽孢杆菌新种并命名为Paenibacillus catalpae。2014年，Carro等[47]又从采集自西班牙的白羽扇豆（Lupinus albus）的根瘤中分离出一株类芽孢杆菌属新种并命名为Paenibacillus lupin。
4 结论
综上所述，利用多相分类方法对陕西等地区豆科植物根瘤内生菌资源进行调查，显示了陕西等地豆科植物根瘤内生菌具有丰富的遗传多样性。有学者指出，由于受到豆科植物所处区域、气候环境、土壤条件、人类活动影响以及在分离根瘤内生菌时的试验条件、所用培养基、培养方法等的影响，故从豆科植物根瘤中分离到的内生菌会有差异性。
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