【摘 要】
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目的:构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒.方法:以基因D
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目的:构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒.方法:以基因DNMT3bmRNA为靶序列设计三条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3b-shRNA2、pGensil-1-DNMT3b-shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T24细胞中,应用RT-PCR和Western-blot检测各组质粒对DNMT3bmRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列.结果:各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确.RT-PCR结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3bmRNA的抑制率分别为20.44%、79.91%和54.48%;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17.27%、77.74%和56.79%.结论:成功构建了质粒pGensi1-1-DNMT3b-shRNA(1,2,3),并筛选出pGensil-1-DNMT3b-shRNA2为沉默效应最强的质粒.
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